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1 19 年 1 月第 26 卷第 1 期中国中医药信息杂志 57 两色金鸡菊对糖尿病大鼠肾脏纤维化 RhoA/ROCK/Nox4 信号通路的影响 姚蓝, 蒋洁, 王靖宣, 毛新民 新疆医科大学中医学院, 新疆乌鲁木齐 811 摘要 : 目的观察两色金鸡菊对糖尿病大鼠肾功能损伤及肾脏纤维化的影响, 探讨其作用机制 方法 SD 大鼠以高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型 将 只大鼠随机分为 和两色金鸡菊高 中, 每组 只 各给药组给予相应剂量药物灌胃 4 周 Masson 染色观 察大鼠肾脏纤维物质沉积的变化 ; 放射免疫法检测大鼠早期肾损伤各指标的水平 ; 免疫组化检测大鼠肾组织 RhoA p-mypt Nox4 平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA) 的蛋白表达 结果与比较, 大鼠肾脏纤维物质沉积 尿微量白蛋白 α1- 微球蛋白 (α1-mg) β2- 巨球蛋白 (β2-mg) 水平显著升高,RhoA p-mypt Nox4 α-sma 蛋白表达显著升高 (P<.1); 与比较, 两色金鸡菊高 中 均不同程度地改善大鼠肾脏纤维物质的沉积, 抑制尿液微量白蛋白 α1-mg β2-mg 表达水平, 肾组织 RhoA p-mypt Nox4 α-sma 蛋白表达显著降低 (P<.5,P<.1) 结论两色金鸡菊乙酸乙酯提取物可能通过 RhoA/ROCK/Nox4 信号通路抑制模型大鼠肾组织 α-sma 的表达 肾脏纤维物质沉积, 进而减轻模型大鼠早期肾脏损伤 关键词 : 两色金鸡菊乙酸乙酯提取物 ; 糖尿病 ; 肾脏纤维化 ;RhoA/ROCK/Nox4 信号通路 ; 大鼠中图分类号 :R285.5 文献标识码 :A 文章编号 :5-54(19) DOI:.3969/j.issn 开放科学 ( 资源服务 ) 标识码 (OSID): Effects of Coreopsis tinctoria Nutt. on RhoA/ROCK/Nox4 Signaling Pathway of Renal Fibrosis of Diabetic Rats YAO Lan, JIANG Jie, WANG Jingxuan, MAO Xinmin College of TCM, Xinjiang Medical University, Urumqi 811, China Abstract: Objective To investigate effects of Coreopsis tinctoria Nutt. on renal disfunction and fibrosis of diabetic rats; To discuss its relevant mechanism of action. Methods A diabetic rat model induced by high-fat and high-sugar diet combined with low-dose STZ in SD rats was established. rats were randomly divided into normal group, model group, positive medicine group and ethyl acetate extract of Coreoposis tinctoria Nutt. high-, medium- and low-dosage groups, with rats in each group. Each administration group was given relevant medicine for gavage. Masson staining was applied to detect the fibrotic accumulation in rat kidney. Radioimmunoassay was used to test the renal function. Immunohistochemical method was used to detect protein expressions of RhoA, p-mypt and Nox4 in rat kidney. Results Compared with normal group, the levels of urine microalbum in protein, α1-mg and β2-mg, renal fibrotic accumulation, RhoA, p-mypt, Nox4 and α-sma in model group increased significantly (P<.1). Compared with the model group, ethyl acetate extract of Coreoposis tinctoria Nutt. high-, medium- and low-dosage groups improved the deposition of renal fiber in rats, inhibited the expression levels of microalbumin, α1-mg and β2-mg in urine and decreased expressions of RhoA, p-mypt, Nox4 and α-sma protein (P<.5, P<.1). Conclusion Ethyl acetate extract of Coreoposis tinctoria Nutt. is possible to inhibit the expression of α-sma and renal fibrous substance deposition in rat kidney via RhoA/ROCK/Nox4 signaling pathway, thereby reducing early kidney damage in model rats. Keywords: ethyl acetate extract of Coreoposis tinctoria Nutt.; diabetes; renal fibrosis; RhoA/ROCK/Nox4 signaling pathway; rats 基金项目 : 国家自然科学基金 ( U1223) 通讯作者 : 毛新民, mxm3277@139.com

2 58 Chinese Journal of Information on TCM Jan.19 Vol.26 No.1 两色金鸡菊 Coreopsis tinctoria Nutt. 又名 昆仑雪菊, 有清热解毒 活血化瘀 和胃健脾功效 临床上用于治疗燥热烦渴 胃肠不适 食欲不振 痢疾及疮疔肿毒等 [1-2] 两色金鸡菊主要化学成分为黄酮类化合物, 也是发挥药效的主要成分 [3] 现代药理研究表明, 两色金鸡菊具有抗氧化 降血压 降血脂 降血糖等作用 [4-5] 本研究采用高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素 (STZ) 诱导 SD 大鼠建立糖尿病 (DM) 模型, 观察两色金鸡菊乙酸乙酯提取物对大鼠肾脏早期损伤标志物及肾脏纤维化物质沉积的影响, 免疫组化检测大鼠肾组织 RhoA/ROCK/Nox4 信号通路蛋白及纤维化成分平滑肌肌动蛋白 -α(α-sma) 的表达, 探讨其防治 DM 的作用机制 1 实验材料 1.1 动物 SPF 级 SD 大鼠 只,8~ 周龄, 体质量 ~ 2 g, 新疆医科大学实验动物中心提供, 动物合格证号 645 饲养于新疆医科大学实验动物中心, 温度 (±2), 相对湿度 (45±5)%, 日照时间 12 h,24 h 保持通风状态 大鼠分笼喂养, 每 5 只 1 笼, 自由摄食饮水 大鼠给予普通饲料喂养, 高脂组大鼠喂养高脂高糖饲料 ( 蔗糖 % 猪油 % 胆固醇 2.5% 胆酸钠.5% 基础饲料 67%), 新疆医科大学实验动物中心提供 1.2 药物及制备两色金鸡菊头状花序采自新疆和田市民丰县, 地理坐标为 : 东经 ~85 55, 北纬 35 ~39 植物标本由新疆医科大学杨卫星教授鉴定为两色金鸡菊 Coreopsis tinctoria Nutt.; 盐酸二甲双胍片, 中美上海施贵宝制药有限公司, 批号 1212 取两色金鸡菊干燥头状花序 1 g, 经粉碎后, 置于 4 L 55% 乙醇中, 回流提取 2 次, 每次 2 h 提取液经过滤后, 合并滤液并置于旋转蒸发仪中浓缩至 1 L 浓缩液中加入等体积乙酸乙酯溶液进行萃取, 萃取液进一步浓缩后, 经减压干燥, 得乙酸乙酯提取物粉末 ( 提取率约为 4.4%, W/W) 称取适量两色金鸡菊乙酸乙酯粉末 阳性对照药, 加入含.5% 羧甲基纤维素钠的蒸馏水溶液中, 搅拌混匀, 超声溶解 4 h, 直至药物呈均匀混悬液 1.3 主要试剂与仪器 STZ( 美国 Sigma 公司 ),Accu-Chek 血糖仪 ( 德国 Roch 公司 ), 血糖试纸 ( 德国 Roch 公司 ), 尿微量白蛋白 α1- 微球蛋白 (α1-mg) β2- 微球蛋白 (β2-mg) 放射免疫检测试剂盒 ( 北京北方生物技术研究所 ), 兔源 RhoA p-mypt Nox4( 武汉三鹰 ) R-2 旋转蒸发仪 ( 德国 Essen 公司 ),VT1 石蜡切片机 ( 德国 Leica),5424SZX7-93 光学显微镜 ( 日本 Olympus 公司 ), 冷冻干燥机 ( 上海析宇 ), 放免 γ 检测仪 ( 芬兰 Hidex) 2 实验方法 2.1 分组 造模及给药大鼠适应性喂养 1 周, 按体质量随机分为 6 组, 选取其中 1 组为 ( 只 ), 其余 5 组 ( 只 ) 为高脂组 予正常饲料喂养, 高脂组给予高脂饲料喂养,8 周后高脂组大鼠腹腔注射 STZ 35 mg/kg, 7 d 后尾静脉检测随机血糖, 随机血糖 16.7 mmol/l 为成模大鼠, 大鼠在造模过程中死亡 5 只 将成模大鼠按血糖值随机分为 和两色金鸡菊高 中 ( 高 中 ) 予二甲双胍 mg/kg 灌胃, 高 中 分别予两色金鸡菊 1 mg/kg 灌胃, 和予等量生理盐水灌胃 给药体积为 2 ml/kg, 连续 4 周 造模及药物干预期间, 大鼠共死亡 6 只 2.2 指标检测于干预前和干预 4 周时收集尿样, 尿样中加 1% 叠氮钠, 于 - 冰箱保存, 用于肾功能各项指标检测 尿微量白蛋白 α1-mg β2-mg 送新疆医科大学第一附属医学放射免疫科, 采用放免法进行检测 2.3 Masson 染色干预 4 周取大鼠肾脏经石蜡包埋 切片脱蜡至水, 苏木素染色 5 min 后, 置于 95% 乙醇中洗 2 次, 在苦味酸乙醇溶液中分色 1 min 用自来水 蒸馏水冲洗 min, 经丽春红酸性复红液中染色水洗后, 置于磷钼酸中染色 5 min 及醋酸苯胺蓝溶液染色 min 于乙醇溶液中梯度脱水 透明, 风干, 封片 结果可见胶原纤维阳性染色呈蓝色, 肌纤维 纤维素 红细胞呈红色, 细胞核呈黑蓝色 每张切片中随机选择 个肾小球, 对每个肾小球中胶原纤维染色面积进行 4 个等级评分 分 : 正常肾小球 ;1 分 : 肾小球胶原纤维染色面积约 %;2 分 : 肾小球胶原纤维染色面积 %~75%;3 分 : 肾小球胶原纤维染色面积 75%~ % 2.4 免疫组化染色切片经脱蜡 水化 水洗后, 羊血清封闭 min 抗体与 TBST(RhoA p-mypt NOX4 α-sma) 按照 1 比例稀释, 滴于切片上, 以 PBS 作为阴性对照, 置于湿盒中 4 过夜 室温放置 1 h 后清洗, 滴加 1 比例的二抗稀释液,37 孵育 min

3 19 年 1 月第 26 卷第 卷 1期 中国中医药 药信息杂志 59 经显色剂显 显色 苏木素复染 PBS 返蓝 树胶封 返 封片 小管 小 肾间质胶 胶原纤维表达 达基本正常 与比较 较 结果可见细 细胞核呈蓝色 色 阳性反应区 区域为棕黄色 色 将 大鼠肾 模 小球基底膜有 有一定程度增 增厚 胶原纤 纤维 染色后切片 片置于显微镜下观察 拍照 照 对每张切 切片中 染色明显 部分 染 分肾小管基底 底膜增厚 出 出现一定程度 度扩 阳性染色区 区域进行评估 并作 4 个等级评分 分 张及空泡样病 张 变 肾间质胶 胶原纤维沉积 积明显 差异 异均 无阳性染色 色或阳性染色 色面积 25% 1 分 阳性 性染色 有统计学意义 有 P.1 与比 比较 中 高 高剂 面积 25% % 2 分 阳性染色面 面积 % 755% 3 球 肾间质胶 量组大鼠肾小 量 胶原纤维沉积 积明显改善 差 分 阳性染 染色面积 75% % % 异均有统计学 异 意义 P.5 P.1 结果见图 图 1 3 图 2 统计学方 方法 采用 SPSS16. S 统计 计软件进行分 分析 实验数 数据以 x±s 表示 采用方差分析 两组间比较用独立样 样本 t Rh hoa p-myp PT 和 Nox4 蛋 蛋白表达的影 影响 检验 P.5 表示差异 异有统计学意 意义 4 免疫组化染色显示 R RhoA 蛋白在 在大鼠肾组织 织中 结果 4.1 两色金鸡 鸡菊乙酸乙酯 酯提取物对模 模型大鼠肾组 组织 主要表达于肾 主 小管 而肾小 小球区域则未 未见明显表达 达 两色金 金鸡菊乙酸乙 乙酯提取物对 对模型大鼠肾 肾脏损 p-m MYPT 蛋白 白在大鼠肾小 小管 肾小球 球中均有表达 达 No ox4 在大鼠肾 肾小管 肾间 间质的表达量 量显著高于肾 肾小 伤标志物的 的影响 与正常 常组比较 模 大鼠尿 尿蛋白水平显 显著升 球 与 球 比较 组大鼠 RhoA A p-mypt T 和 高 差异有 有统计学意义 P.1 与比 比较 No ox4 蛋白表达 达显著升高 差异有统计 计学意义 P P 中 高剂量 量组大鼠尿微量 量白蛋白水平 平 早期肾脏 脏损伤. 1 与 组比较 中 大鼠肾组织 RhhoA 指标 α1-mg G β2-mg 显著降低 差 显 差异有统计学 学意义 降低 差异有 蛋白表达显著 蛋 有统计学意义 义 P.5 P.5 P.1 结果见表 1 大鼠 低 肾组织 p-my YPT 蛋白表达 达显著降低 差 4.2 异有统计学意 异 义 P.11 低 高剂 剂量组大鼠肾 肾组 两色金 金鸡菊乙酸乙 乙酯提取物对 对模型大鼠肾 肾脏胶 织 Nox4 蛋白表 表达显著降低 低 差异有统 统计学意义 P P 原纤维沉积 积的影响 Massonn 染色结果显 显示 组大鼠肾小球 球 肾. 5 P.1 结果见图 图 3 图 8 表 1 各组大鼠肾脏损伤标志物 物水平比较 x±ss 组别 剂量/ mg/kg 只数 尿微量白蛋 蛋白/ mg/24 h 4.95± ± ± ±2.42 α1-m MG/ ng/l β2-m MG/ ng/l.322± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±25.43 注 与 组比较 P.1 与比较 较 P.5 P P.1 组 胶原纤维染色率/% 高 图 1 各组大鼠肾组织 织形态 Masson 染色 染 注 与比较 注 较 P.1 与 与比较 P.5 P.1 图 2 各组 组大鼠肾脏胶原纤 纤维染色率比较 x±s n 4 x

4 Chinese Joournal of Information on TCM 模型 型组 高剂 剂量组 低 组 阳 Nox4 阳性表达率/% RhoA阳性表达率/% 组织 Nox4 阳性表达 免疫组化染色 色 图 7 各组大鼠肾组 图 3 各组大鼠肾组织 RhoA 阳性 性表达 免疫组化 化染色 Jaan.19 Vol.26 No.1 注 与正常 常组比较 P.1 与比 比较 P.5 图 4 各组大 大鼠肾组织 RhoA A 蛋白表达比较 x±s n 4 注 与 与比较 #P.1 与模型 型组比较 P.5 P.1 图 8 各组大鼠肾组织 Nox4 蛋白 白表达比较 x±s n 两色金鸡菊 菊乙酸乙酯提 提取物对模型 型大鼠肾组织 织 纤维化 化成分平滑肌 肌肌动蛋白-α α 蛋白表达的 的影响 免疫组化染色 免 色显示 纤维 维蛋白 α-sm MA 在大鼠肾 肾 模型 型组 组织中 中主要表达于 于肾小球和肾 肾小管 其中 中肾小管中表 表 达最为 为显著 与 与比较 较 大 大鼠肾组织 织 α-sm MA 表达显著升 升高 差异有 有统计学意义 义 P.1 与模型 型组比较 中 大鼠 鼠肾组织 α-s SMA 蛋白表 表 达显著 著降低 差异 异有统计学意 意义 P. 1 结果见 见 图 9 图 高剂 剂量组 p-mypt 阳性表达率/% 图 5 各组大鼠肾 肾组织 p-mypt 阳性表达 免疫组 阳 组化染色 注 与比较 P..1 与比较 P.1 鼠肾组织 p-mypt 蛋白表达比较 x±s n 4 图 6 各组大鼠 低 组 阳 图 9 各组大鼠肾组织 α-sma 阳性表 表达 免疫组化染 染色

5 19 年 1 月第 26 卷第 1 期中国中医药信息杂志 61 5 讨论 α-sma 阳性表达率 /% 注 : 与比较,P<.1; 与比较,P<.1 图 各组大鼠肾组织 α-sma 蛋白表达比较 ( x±s,n=4) 糖尿病肾病 (DN) 是临床最常见的 严重的糖 尿病微血管并发症, 是以肾脏纤维化病变为特征的一种继发性肾脏疾病, 也是导致终末期肾病的主要因素 [6] DN 发病机制比较复杂, 目前尚未完全阐明 目前研究认为, 糖尿病发病过程中, 伴随糖脂代谢紊乱 胰岛素抵抗, 引发血液流变学改变 糖基化终末产物聚集等, 进而导致肾脏氧化应激反应, 与 DN 的发生发展密切相关 [7-] 尿微量白蛋白是一种主要的血清蛋白质 正常情况下, 微量白蛋白可通过肾小球基底膜, 被近曲小管重吸收, 是早期 DM 引起的肾小管损伤的重要标志物之一 本实验结果表明, 两色金鸡菊乙酸乙酯提取物低 中 高剂量均能显著抑制 DM 大鼠 24 h 尿微量白蛋白排泄, 对早期 DM 肾小管损伤有预防与改善作用 但由于微量白蛋白水平并非肾脏损伤的特异性指标, 泌尿道炎症 出血 发烧 应激等症状均可出现微量白蛋白水平升高现象 因此需要其他生物标记物进一步佐证肾脏损伤情况 [11] β2-mg 是全身存在的一种多肽蛋白质,α1-MG 是一种糖蛋白 以上 2 种蛋白均从肾小球滤过并大部分在肾小管被重吸收和酶解, 正常人尿液中含量较少 在肾小球出现高过滤状态和肾小管重吸收功能的下降初期,β2-MG 与 α1-mg 的重吸收与异化作用显著降低, 尿液中大量出现, 因而成为肾小球与肾小管损伤初期的灵敏特异性标志物 [12-13] 采用的造模方法主要模拟 DN 早期病理生理特征, 选择 β2-mg 与 α1-mg 为较为敏感的成模指标是可行的 结果显示, 两色金鸡菊乙酸乙酯提取物高 中 低剂量均能显著抑制大鼠尿液中 β2-mg 和 α1-mg 表达水平, 说明对早期 DM 大鼠肾脏功能异常具有预防与延缓作用, 对早期肾损伤有一定抑制作用 Masson 染色是通过对肾小球沉淀的免疫复合物 基 底膜 系膜基质及胶原纤维等的特异性染色, 观察肾小球上免疫复合物的沉积程度, 对判断肾组织纤维化病变程度的病理诊断至关重要 [14] 本实验结果显示, 两色金鸡菊乙酸乙酯提取物可显著抑制大鼠肾组织纤维物质沉积 DN 氧化应激的分子作用机制比较复杂, 目前尚未完全阐明, 近年来,RhoA/ROCK 信号通路对 DN 的影响作用受到广泛关注和高度重视 [15] RhoA 属 Rho-GTP 酶家族成员之一, 又被称为 分子调控枢纽, 在与 GTP 和 GDP 结合过程中发挥多生物活性调控作用 ROCK 为丝氨酸 / 苏氨酸激酶, 是 RhoA 下游第一个信号蛋白酶 ROCK 活性用 p-mypt 蛋白表达表示 在 STZ 诱导的糖尿病大鼠肾脏中和高糖诱导的肾小球系膜细胞中,RhoA 在细胞膜上的表达显著增加, 同时, 氧化应激反应 高血糖等均可激活 RhoA/ ROCK 信号通路 Nox4 为 NADPH 氧化酶主要亚基, 其广泛表达于大鼠及小鼠 DN 模型肾组织的肾小球系膜细胞 足细胞 肾小管细胞中 研究发现,RhoA/ ROCK 信号通路的激活可通过介导 Nox4 引发肾组织多种细胞释放大量活性氧, 进而诱导多种纤维化蛋白如 α-sma Ⅳ 型胶原等的表达 [16-17] 免疫组化染色结果显示, 两色金鸡菊可能通过 RhoA/ROCK/Nox4 信号通路抑制肾小球系膜细胞 足细胞 内皮细胞等多种细胞中 α-sma 的表达, 延缓 DM 大鼠肾组织纤维化物质沉积, 防治 DM 肾脏纤维化 但由于免疫组化实验对肾组织中蛋白表达的检测存在局限性, 并未能很好显示出两色金鸡菊在大鼠肾组织的具体作用部位与作用靶点 后期我们将进一步研究两色金鸡菊及其主要成分对大鼠肾组织不同细胞中纤维化蛋白表达的影响, 以进一步明确其作用机制 参考文献 : [1] 木合布力 阿布力孜, 张燕, 毛新民, 等. 新疆昆仑雪菊化学成分的初步定性研究 [J]. 新疆医科大学学报,,33(6): [2] 王梓霏, 许松姬, 宋春梅. 昆仑雪菊化学成分及药理研究进展 [J]. 吉林中医药,17,38(3): [3] 宋烨威, 金红娜, 徐洁, 等. 昆仑雪菊中黄酮类化合物的提取分离及抗氧化活性评价 [J]. 食品与发酵工业,16,42(4): [4] 兰卫, 赵保胜, 李玉清, 等. 昆仑雪菊中多种成分的含量测定 [J]. 中国实验方剂学杂志,12,18():1-3. [5] 潘英, 李宁, 倪慧, 等. 金鸡菊属植物化学成分和药理活性研究进展 [J]. 现代药物与临床,12,27(5): [6] XIE X, HE Q H. Polydatin ameliorates experimental diabetesinduced fibronectin through inhibiting the activation of NF-kappaB signaling pathway in rat glomerular mesangial cells[j].

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