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锻穆
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1 中华人民共和国国家标准 GB 食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验发布实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布

2 前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 标准名称修改为食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 ; 增加了术语和定义缩略语 ; 增加了血清学试验中 H 抗原鉴定 ; 增加了 PCR 确认试验 ; 增加了附录 A; 修改了设备和材料 ; 修改了培养基和试剂 ; 修改了检验程序 ; 修改了血清学试验中致泻大肠埃希氏菌所包括的 O 抗原群 ; 删除了肠毒素试验 Ⅰ

3 食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 1 范围本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌 (diarrheagenic) 的检验方法本标准适用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检验 2 术语和定义缩略语 2.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件致泻大肠埃希氏菌 Diarrheagenic 一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌, 可经过污染食物引起人类发病常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌肠道侵袭性大肠埃希氏菌产肠毒素大肠埃希氏菌产志贺毒素大肠埃希氏菌 ( 包括肠道出血性大肠埃希氏菌 ) 和肠道集聚性大肠埃希氏菌肠道致病性大肠埃希氏菌 Enteropathogenic 能够引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤, 且不产生志贺毒素的大肠埃希氏菌该菌是婴幼儿腹泻的主要病原菌, 有高度传染性, 严重者可致死肠道侵袭性大肠埃希氏菌 Enteroinvasive 能够侵入肠道上皮细胞而引起痢疾样腹泻的大肠埃希氏菌该菌无动力不发生赖氨酸脱羧反应不发酵乳糖, 生化反应和抗原结构均近似痢疾志贺氏菌侵入上皮细胞的关键基因是侵袭性质粒上的抗原编码基因及其调控基因, 如 ipah 基因 ipar 基因 ( 又称为 inve 基因 ) 产肠毒素大肠埃希氏菌 Enterotoxigenic 能够分泌热稳定性肠毒素或 / 和热不稳定性肠毒素的大肠埃希氏菌该菌可引起婴幼儿和旅游者腹泻, 一般呈轻度水样腹泻, 也可呈严重的霍乱样症状, 低热或不发热腹泻常为自限性, 一般 2d~3d 即自愈产志贺毒素大肠埃希氏菌 Shigatoxin-producing( 肠道出血性大肠埃希氏菌 Enterohemorrhagic) 能够分泌志贺毒素引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤的大肠埃希氏菌有些产志贺毒素大肠埃希氏菌在临床上引起人类出血性结肠炎 (HC) 或血性腹泻, 并可进一步发展为溶血性尿毒综合征 (HUS), 这类产志贺毒素大肠埃希氏菌为肠道出血性大肠埃希氏菌 1

4 2.1.6 肠道集聚性大肠埃希氏菌 Enteroaggregative 肠道集聚性大肠埃希氏菌不侵入肠道上皮细胞, 但能引起肠道液体蓄积不产生热稳定性肠毒素或热不稳定性肠毒素, 也不产生志贺毒素唯一特征是能对 Hep-2 细胞形成集聚性黏附, 也称 Hep-2 细胞黏附性大肠埃希氏菌 2.2 缩略语下列缩略语适用于本文件 DEC: 致泻大肠埃希氏菌 Diarrheagenic EPEC: 肠道致病性大肠埃希氏菌 Enteropathogenic EIEC: 肠道侵袭性大肠埃希氏菌 Enteroinvasive ETEC: 产肠毒素大肠埃希氏菌 Enterotoxigenic STEC: 产志贺毒素大肠埃希氏菌 Shigatoxin-producing EHEC: 肠道出血性大肠埃希氏菌 Enterohemorrhagic EAEC: 肠道集聚性大肠埃希氏菌 Enteroaggregative escv: 蛋白分泌物调节基因,geneencodingLEE-encodedtypeⅢsecretionsystemfactor eae: 紧密素基因,geneencodingintiminforatachingandefacing bfpb: 束状菌毛 B 基因,bundle-formingpilusB; stx1: 志贺毒素 Ⅰ 基因,Shigatoxinone stx2: 志贺毒素 Ⅱ 基因,Shigatoxintwo lt: 热不稳定性肠毒素基因,heat-labileenterotoxin st: 热稳定性肠毒素基因,heat-stableenterotoxin stp (stia): 猪源热稳定性肠毒素基因,heat-stableenterotoxinsinitialydiscoveredinthe isolatesfrompigs sth(stib): 人源热稳定性肠毒素基因,heat-stableenterotoxinsinitialydiscoveredinthe isolatesfromhuman inve: 侵袭性质粒调节基因,invasiveplasmidregulator ipah : 侵袭性质粒抗原 H 基因,invasiveplasmidantigenHḡene aggr: 集聚黏附菌毛调节基因,aggregativeadhesivefimbriaeregulator uida: β - 葡萄糖苷酶基因, β ḡlucuronidasegene asta: 集聚热稳定性毒素 A 基因,enteroaggregativeheat-stableenterotoxinA pic: 肠定植因子基因,proteininvolvedinintestinalcolonization LEE: 肠细胞损伤基因座,Locusofenterocyteefacement EAF:EPEC 黏附因子,EPECadhesivefactor 3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : 3.1 恒温培养箱 :36 ±1,42 ±1 3.2 冰箱 :2 ~5 3.3 恒温水浴箱 :50 ±1,100 或适配 1.5mL 或 2.0mL 金属浴 (95 ~100 ) 3.4 电子天平 : 感量为 0.1g 和 0.01g 3.5 显微镜 :10 ~100 2

5 3.6 均质器 3.7 振荡器 3.8 无菌吸管 :1mL( 具 0.01mL 刻度 ),10mL( 具 0.1mL 刻度 ) 或微量移液器及吸头 3.9 无菌均质杯或无菌均质袋 : 容量 500mL 3.10 无菌培养皿 : 直径 90mm 3.11 ph 计或精密 ph 试纸 3.12 微量离心管 :1.5mL 或 2.0mL 3.13 接种环 :1μL 3.14 低温高速离心机 : 转速 13000r/min, 控温 4 ~ 微生物鉴定系统 3.16 PCR 仪 3.17 微量移液器及吸头 :0.5μL~2μL,2μL~20μL,20μL~200μL,200μL~1000μL 3.18 水平电泳仪 : 包括电源电泳槽制胶槽 ( 长度 >10cm) 和梳子联排管和 8 联排盖 ( 平盖 / 凸盖 ) 3.20 凝胶成像仪 4 培养基和试剂 4.1 营养肉汤 : 见 A 肠道菌增菌肉汤 : 见 A 麦康凯琼脂 (MAC): 见 A 伊红美蓝琼脂 (EMB): 见 A 三糖铁 (TSI) 琼脂 : 见 A 蛋白胨水靛基质试剂 : 见 A 半固体琼脂 : 见 A 尿素琼脂 (ph7.2): 见 A 氰化钾 (KCN) 培养基 : 见 A 氧化酶试剂 : 见 A 革兰氏染色液 : 见 A BHI 肉汤 : 见 A 福尔马林 ( 含 38%~40% 甲醛 ) 4.14 鉴定试剂盒 4.15 大肠埃希氏菌诊断血清 4.16 灭菌去离子水 % 灭菌生理盐水 4.18 TE(pH8.0): 见 A PCR 反应缓冲液 : 见 A mmol/l MgCl dntps:datp dttp dgtp dctp 每种浓度为 2.5mmol/L U/LTaq 酶 4.23 引物 TAE 电泳缓冲液 : 见 A 琼脂糖 3

6 4.26 溴化乙锭 (EB) 或其他核酸染料上样缓冲液 : 见 A Marker: 分子量包含 100bp 200bp 300bp 400bp 500bp 600bp 700bp 800bp 900bp 1000bp 1500bp 条带 4.29 致泻大肠埃希氏菌 PCR 试剂盒 5 检验程序致泻大肠埃希氏菌检验程序见图 1 图 1 致泻大肠埃希氏菌检验程序 4

7 6 操作步骤 6.1 样品制备固态或半固态样品固体或半固态样品, 以无菌操作称取检样 25g, 加入装有 225 ml 营养肉汤的均质杯中, 用旋转刀片式均质器以 8000r/min~10000r/min 均质 1min~2min; 或加入装有 225mL 营养肉汤的均质袋中, 用拍击式均质器均质 1min~2min 液态样品以无菌操作量取检样 25mL, 加入装有 225mL 营养肉汤的无菌锥形瓶 ( 瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠 ), 振荡混匀 6.2 增菌将 6.1 制备的样品匀液于 36 ±1 培养 6h 取 10μL, 接种于 30mL 肠道菌增菌肉汤管内, 于 42 ±1 培养 18h 6.3 分离将增菌液划线接种 MAC 和 EMB 琼脂平板, 于 36 ±1 培养 18h~24h, 观察菌落特征在 MAC 琼脂平板上, 分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色, 不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色 ; 在 EMB 琼脂平板上, 分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽, 不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色 6.4 生化试验选取平板上可疑菌落 10 个 ~20 个 (10 个以下全选 ), 应挑取乳糖发酵, 以及乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落, 分别接种 TSI 斜面同时将这些培养物分别接种蛋白胨水尿素琼脂 (ph7.2) 和 KCN 肉汤于 36 ±1 培养 18h~24h TSI 斜面产酸或不产酸, 底层产酸, 靛基质阳性,H2S 阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌 TSI 斜面底层不产酸, 或 H2S KCN 尿素有任一项为阳性的培养物, 均非大肠埃希氏菌必要时做革兰氏染色和氧化酶试验大肠埃希氏菌为革兰氏阴性杆菌, 氧化酶阴性如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统, 可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落用无菌稀释液制备成浊度适当的菌悬液, 使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定 6.5 PCR 确认试验取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行 PCR 确认试验注 :PCR 实验室区域设计工作基本原则及注意事项应参照疾病预防控制中心建设标准 ( 建标 ) 和国家卫生和计划生育委员会 ( 原卫生部 )(2010) 医疗机构临床基因扩增管理办法附录 ( 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 ) 使用 1μL 接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养 18h~24h 的菌落, 悬浮在 200μL0.85% 灭菌生理盐水中, 充分打散制成菌悬液, 于 13000r/min 离心 3min, 弃掉上清液加入 1mL 灭菌去离子水充分混匀菌体, 于 100 水浴或者金属浴维持 10min; 冰浴冷却后,13000r/min 离心 3min, 收集上清液 ; 按 1 10 的比例用灭菌去离子水稀释上清液, 取 2μL 作为 PCR 检测的模板 ; 所有处理后的 DNA 5

8 模板直接用于 PCR 反应或暂存于 4 并当天进行 PCR 反应 ; 否则, 应在 -20 以下保存备用 (1 周内 ) 也可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌 DNA, 操作方法按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行每次 PCR 反应使用 EPEC EIEC ETEC STEC/EHEC EAEC 标准菌株作为阳性对照同时, 使用大肠埃希氏菌 ATCC25922 或等效标准菌株作为阴性对照, 以灭菌去离子水作为空白对照, 控制 PCR 体系污染致泻大肠埃希氏菌特征性基因见表 1 表 1 五种致泻大肠埃希氏菌特征基因致泻大肠埃希氏菌类别特征性基因 EPEC STEC/EHEC EIEC ETEC EAEC escv 或 eae bfpb escv 或 eae stx1 stx2 inve 或 ipah lt stp sth asta aggr pic uida PCR 反应体系配制每个样品初筛需配置 12 个 PCR 扩增反应体系, 对应检测 12 个目标基因, 具体操作如下 : 使用 TE 溶液 (ph8.0) 将合成的引物干粉稀释成 100μmol/L 储存液根据表 2 中每种目标基因对应 PCR 体系内引物的终浓度, 使用灭菌去离子水配制 12 种目标基因扩增所需的 10 引物工作液 ( 以 uida 基因为例, 如表 3) 将 10 引物工作液 10 PCR 反应缓冲液 25 mmol/l MgCl2 2.5mmol/LdNTPs 灭菌去离子水从 -20 冰箱中取出, 融化并平衡至室温, 使用前混匀 ;5 U/ μ L Taq 酶在加样前从 -20 冰箱中取出每个样品按照表 4 的加液量配制 12 个 25μL 反应体系, 分别使用 12 种目标基因对应的 10 引物工作液表 2 五种致泻大肠埃希氏菌目标基因引物序列及每个 PCR 体系内的终浓度 c 引物名称引物序列 c 菌株编号及对应 Genbank 编码引物所在位置终浓度 n PCR 产物 ( μ mol/l) 长度 (bp) uida-f 5 -ATG CCA GTC CAG CGT TTT TGC-3 uida-r 5 -AAA GTG TGG GTC AAT AATCAG GAA GTG-3 escv-f escv-r eae-f a eae-r a 5 -ATT CTG GCT CTC TTC TTCTTT ATG GCT G-3 5 -CGT CCC CTT TTA CAA ACT TCA TCGC-3 5 -ATT ACC ATC CAC ACA GACGGT-3 5 -ACA GCG TGG TTG GAT CAACCT-3 DH1Ec169 (accessionno. CP ) E2348/69 (accessionno. FM ) EHEC (accessionno. Z ) bfpb-f 5 -GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3 E2348/69 (accession no.fm )

9 表 2 ( 续 ) 引物名称引物序列 c 菌株编号及对应 Genbank 编码引物所在位置终浓度 n PCR 产物 ( μ mol/l) 长度 (bp) bfpb-r 5 -CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC stx1-f stx1-r 5 -CGA TGT TAC GGT TTG TTACTG TGACAGC-3 5 -AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3 EDL933 (accessionno. AE ) stx2-f stx2-r 5 -GTT TTG ACC ATC TTC GTCTGA TTA TTG AG-3 5 -AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGAC-3 EDL933 (accessionno. AE ) lt-f lt-r 5 -GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3 5 -CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3 E24377A (accessionno. CP ) stp-f stp-r 5 -CCT CTT TTA GYC AGA CARCTG AATCASTTG-3 5 -CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCACAG-3 EC2173 (accessionno. AJ )/// F7682 (accessionno. AY ) /// /// sth-f sth-r 5 -TGT CTT TTT CAC CTT TCGCTC-3 5 -CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3 E24377A (accession no.cp ) inve-f 5 -CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATCCCG-3 inve-r 5 -CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC AC-3 serotypeo164 (accessionno. AF ) ipah-f b 5 -TTG ACC GCC TTT CCG ATACC (accessionno. CP )

10 表 2 ( 续 ) 引物名称引物序列 c 菌株编号及对应 Genbank 编码引物所在位置终浓度 n PCR 产物 ( μ mol/l) 长度 (bp) ipah-r 5 -ATC CGC ATC ACC GCT b CAG AC aggr-f 5 -ACG CAG AGT TGC CTG ATA AAG aggr-r 5 -AAT ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC-3 enteroaggregative17-2 (accessionno.z ) pic-f pic-r 5 -AGC CGT TTC CGC AGA AGCC-3 5 -AAA TGT CAG TGA ACC GACGAT TGG (accessionno. AF ) asta-f asta-r 5 -TGC CAT CAA CAC AGT ATA TCCG-3 5 -ACG GCT TTG TAG TCC TTCCAT-3 ECOR33 (accession no.af ) S 5 -GGA GGC AGC AGT GGG rdna-f AAT A-3 16S 5 -TGA CGG GCG GTG TGT rdna-r ACA AG-3 strain ST2747 (accessionno. CP ) a escv 和 eae 基因选作其中一个 ; b inve 和 ipah 基因选作其中一个 ; c 表中不同基因的引物序列可采用可靠性验证的其他序列代替表 3 每种目标基因扩增所需 10 引物工作液配制表引物名称体积 / μ L 100μmol/LuidA-F 10 n 100μmol/LuidA-R 10 n 灭菌去离子水 (10 n) 总体积 100 注 :n 每条引物在反应体系内的终浓度 ( 详见表 2) 8

11 表 4 五种致泻大肠埃希氏菌目标基因扩增体系配制表试剂名称加样体积 / μ L 灭菌去离子水 PCR 反应缓冲液 mmol/L MgCl mmol/LdNTPs 引物工作液 2.5 5U/ μ LTaq 酶 0.4 DNA 模板 2.0 总体积 PCR 循环条件预变性 94 5min; 变性 94 30s, 复性 63 30s, 延伸 min,30 个循环 ;72 延伸 5min 将配制完成的 PCR 反应管放入 PCR 仪中, 核查 PCR 反应条件正确后, 启动反应程序称量 4.0g 琼脂糖粉, 加入至 200mL 的 1 TAE 电泳缓冲液中, 充分混匀使用微波炉反复加热至沸腾, 直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液待琼脂糖溶液冷却至 60 左右时, 加入溴化乙锭 (EB) 至终浓度为 0.5μg/mL, 充分混匀后, 轻轻倒入已放置好梳子的模具中, 凝胶长度要大于 10cm, 厚度宜为 3mm~5mm 检查梳齿下或梳齿间有无气泡, 用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后, 轻轻拔出梳子, 小心将胶块和胶床放入电泳槽中, 样品孔放置在阴极端向电泳槽中加入 1 TAE 电泳缓冲液, 液面高于胶面 1mm~2mm 将 5μLPCR 产物与 1μL6 上样缓冲液混匀后, 用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔, 小心上样于孔中 ; 阳性对照的 PCR 反应产物加入到最后一个泳道 ; 第一个泳道中加入 2μL 分子量 Marker 接通电泳仪电源, 根据公式 : 电压 = 电泳槽正负极间的距离 (cm) 5V/cm 计算并设定电泳仪电压数值 ; 启动电压开关, 电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准电泳 30min~45min 后, 切断电源取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果, 拍照并记录数据结果判定电泳结果中空白对照应无条带出现, 阴性对照仅有 uida 条带扩增, 阳性对照中出现所有目标条带,PCR 试验结果成立根据电泳图中目标条带大小, 判断目标条带的种类, 记录每个泳道中目标条带的种类, 在表 5 中查找不同目标条带种类及组合所对应的致泻大肠埃希氏菌类别表 5 五种致泻大肠埃希氏菌目标条带与型别对照表致泻大肠埃希氏菌类别 EAEC EPEC STEC/EHEC ETEC 目标条带的种类组合 aggr,asta,pic 中一条或一条以上阳性 bfpb(+/-),escv a (+),stx1(-),stx2(-) escv a (+/-),stx1(+),stx2(-),bfpb(-) escv a (+/-),stx1(-),stx2(+),bfpb(-) escv a (+/-),stx1(+),stx2(+),bfpb(-) lt,stp,sth 中一条或一条以上阳性 uida c (+/-) EIEC inve b (+) a 在判定 EPEC 或 SETC/EHEC 时,escV 与 eae 基因等效 ; b 在判定 EIEC 时,invE 与 ipah 基因等效 c 97% 以上大肠埃希氏菌为 uida 阳性 9

12 6.5.8 如用商品化 PCR 试剂盒或多重聚合酶链反应 (MPCR) 试剂盒, 应按照试剂盒说明书进行操作和结果判定 6.6 血清学试验 ( 选做项目 ) 取 PCR 试验确认为致泻大肠埃希氏菌的菌株进行血清学试验注 : 应按照生产商提供的使用说明进行 O 抗原和 H 抗原的鉴定当生产商的使用说明与下面的描述可能有偏差时, 按生产商提供的使用说明进行 O 抗原鉴定假定试验 : 挑取经生化试验和 PCR 试验证实为致泻大肠埃希氏菌的营养琼脂平板上的菌落, 根据致泻大肠埃希氏菌的类别, 选用大肠埃希氏菌单价或多价 OK 血清做玻片凝集试验当与某一种多价 OK 血清凝集时, 再与该多价血清所包含的单价 OK 血清做凝集试验致泻大肠埃希氏菌所包括的 O 抗原群见表 6 如与某一单价 OK 血清呈现凝集反应, 即为假定试验阳性证实试验 : 用 0.85% 灭菌生理盐水制备 O 抗原悬液, 稀释至与 MacFarland3 号比浊管相当的浓度原效价为 1 160~1 320 的 O 血清, 用 0.5% 盐水稀释至 1 40 将稀释血清与抗原悬液于 10mm 75mm 试管内等量混合, 做单管凝集试验混匀后放于 50 ±1 水浴箱内, 经 16h 后观察结果如出现凝集, 可证实为该 O 抗原表 6 致泻大肠埃希氏菌主要的 O 抗原 DEC 类别 EPEC STEC/EHEC EIEC ETEC EAEC DEC 主要的 O 抗原 O26O55O86O111abO114O119O125acO127O128abO142O158 等 O4O26O45O91O103O104O111O113O121O128O157 等 O28acO29O112acO115O124O135O136O143O144O152O164O167 等 O6O11O15O20O25O26O27O63O78O85O114O115O128acO148O149O159 O166O167 等 O9O62O73O101O134 等 H 抗原鉴定取菌株穿刺接种半固体琼脂管,36 ±1 培养 18h~24h, 取顶部培养物 1 环接种至 BHI 液体培养基中, 于 36 ±1 培养 18h~24h 加入福尔马林至终浓度为 0.5%, 做玻片凝集或试管凝集试验若待测抗原与血清均无明显凝集, 应从首次穿刺培养管中挑取培养物, 再进行 2 次 ~3 次半固体管穿刺培养, 按照进行试验 7 结果报告 7.1 根据生化试验 PCR 确认试验的结果, 报告 25g( 或 25mL) 样品中检出或未检出某类致泻大肠埃希氏菌 7.2 如果进行血清学试验, 根据血清学试验的结果, 报告 25g( 或 25 ml) 样品中检出的某类致泻大肠埃希氏菌血清型别 10

13 附录 A 培养基和试剂 A.1 营养肉汤 A.1.1 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 氯化钠 5.0g 1000mL A min 将以上混合加热溶解, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.4±0.2, 分装适当的容器 121 灭菌 A.2 肠道菌增菌肉汤 A.2.1 蛋白胨 10.0g 葡萄糖 5.0g 牛胆盐 20.0g 磷酸氢二钠 8.0g 磷酸二氢钾 2.0g 煌绿 0.015g 1000mL A min 将以上混合加热溶解, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.2±0.2, 分装每瓶 30 ml 115 灭菌 A.3 麦康凯琼脂 (MAC) A.3.1 蛋白胨 20.0g 乳糖 10.0g 3 号胆盐 1.5g 氯化钠 5.0g 中性红 0.03g 结晶紫 0.001g 琼脂 15.0g 11

14 1000mL A.3.2 将以上混合加热溶解, 校正 ph 至 7.2± 高压灭菌 15 min 冷却至 45 ~50, 倾注平板注 : 如不立即使用, 在 2 ~8 条件下可储存两周 A.4 伊红美蓝 (EMB) 琼脂 A.4.1 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 磷酸氢二钾 (K2HPO4) 2.0g 琼脂 15.0g 2% 伊红 Y 水溶液 20.0mL 0.5% 美蓝水溶液 13.0mL 1000mL A.4.2 在 1000 ml 中煮沸溶解蛋白胨磷酸盐和乳糖, 加水补足, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.1±0.2 再加入琼脂,121 高压灭菌 15min 冷至 45 ~50, 加入 2% 伊红 Y 水溶液和 0.5% 美蓝水溶液, 摇匀, 倾注平皿 A.5 三糖铁琼脂 (TSI) A.5.1 蛋白胨 20.0g 牛肉浸膏 5.0g 乳糖 10.0g 蔗糖 10.0g 葡萄糖 1.0g 硫酸亚铁铵 [(NH4) 2Fe(SO4) 2 6H2O] 0.2g 氯化钠 5.0g 硫代硫酸钠 0.2g 酚红 0.025g 琼脂 12.0g 1000mL A.5.2 除酚红和琼脂外, 将其他加于 400mL 水中, 搅拌均匀, 静置约 10min, 加热使完全溶化, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.4±0.2 另将琼脂加于 600 ml 水中, 静置约 10 min, 加热使完全溶化将两溶液混合均匀, 加入 5% 酚红水溶液 5 ml, 混匀, 分装小号试管, 每管约 3 ml 于 121 灭菌 12

15 15min, 制成高层斜面冷却后呈桔红色如不立即使用, 在 2 ~8 条件下可储存一个月 A.6 蛋白胨水靛基质试剂 A.6.1 胰蛋白胨 20.0g 氯化钠 5.0g 1000mL A min 将以上混合加热溶解, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.4±0.2, 分装小试管,121 高压灭菌注 : 此试剂在 2 ~8 条件下可储存一个月 A.6.3 靛基质试剂 A 柯凡克试剂 : 将 5g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 75mL 戊醇中然后缓慢加入浓盐酸 25mL A 欧 - 波试剂 : 将 1g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 ml95% 乙醇内然后缓慢加入浓盐酸 20mL A.6.4 试验方法挑取少量培养物接种, 在 36 ±1 培养 1d~2d, 必要时可培养 4d~5d 加入柯凡克试剂约 0.5mL, 轻摇试管, 阳性者于试剂层呈深红色 ; 或加入欧 - 波试剂约 0.5 ml, 沿管壁流下, 覆盖于培养液表面, 阳性者于液面接触处呈玫瑰红色 A.7 半固体琼脂 A.7.1 蛋白胨 1.0g 牛肉膏 0.3g 氯化钠 0.5g 琼脂 0.3g~0.5g 100.0mL A.7.2 按以上配好, 加热溶解, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.4±0.2, 分装小试管 121 灭菌 15min, 直立凝固备用 A.8 尿素琼脂 (ph7.2) A.8.1 蛋白胨 1.0g 氯化钠 5.0g 13

16 葡萄糖 1.0g 磷酸二氢钾 2.0g 0.4% 酚红 3.0mL 琼脂 20.0g 20% 尿素溶液 100.0mL 1000mL A.8.2 除酚红尿素和琼脂外的其他加热溶解, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.2±0.2, 加入酚红指示剂, 混匀, 于 121 灭菌 15min 冷至约 55, 加入用 0.22μm 过滤膜除菌后的 20% 尿素水溶液 100 ml, 混匀, 以无菌操作分装灭菌试管, 每管约 3mL~4mL, 制成斜面后放冰箱备用 A.8.3 试验方法为红色挑取琼脂培养物接种, 在 36 ±1 培养 24h, 观察结果尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变 A.9 氰化钾 (KCN) 培养基 A.9.1 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 磷酸二氢钾 0.225g 磷酸氢二钠 5.64g 0.5% 氰化钾 20.0mL 1000mL A.9.2 将除氰化钾以外的加入中, 煮沸溶解, 分装后 121 高压灭菌 15 min 放在冰箱内使其充分冷却每 100mL 培养基加入 0.5% 氰化钾溶液 2.0mL( 最后浓度为 ), 分装于无菌试管内, 每管约 4mL, 立刻用无菌橡皮塞塞紧, 放在 4 冰箱内, 至少可保存两个月同时, 将不加氰化钾的培养基作为对照培养基, 分装试管备用 A.9.3 试验方法将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液, 挑取 1 环接种于氰化钾 (KCN) 培养基并另挑取 1 环接种于对照培养基在 36 ±1 培养 1d~2d, 观察结果如有细菌生长即为阳性 ( 不抑制 ), 经 2d 细菌不生长为阴性 ( 抑制 ) 注 : 氰化钾是剧毒药, 使用时应小心, 切勿沾染, 以免中毒夏天分装培养基应在冰箱内进行试验失败的主要原因是封口不严, 氰化钾逐渐分解, 产生氢氰酸气体逸出, 以致药物浓度降低, 细菌生长, 因而造成假阳性反应试验时对每一环节都要特别注意 A.10 氧化酶试剂 A.10.1 N,N - 二甲基对苯二胺盐酸盐或 14

17 N,N,N,N - 四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g 100mL A.10.2 少量新鲜配制, 于 2 ~8 冰箱内避光保存, 在 7d 内使用 A.10.3 试验方法用无菌棉拭子取单个菌落, 滴加氧化酶试剂,10s 内呈现粉红或紫红色即为氧化酶试验阳性, 不变色者为氧化酶试验阴性 A.11 革兰氏染色液 A.11.1 A 结晶紫染色液结晶紫 1.0g 95% 乙醇 20.0mL 1% 草酸铵水溶液 80.0mL A 将结晶紫完全溶解于乙醇中, 然后与草酸铵溶液混合 A.11.2 A 革兰氏碘液碘 1.0g 碘化钾 2.0g 300mL A 将碘与碘化钾先行混合, 加入少许充分振摇, 待完全溶解后, 再加至 300mL A.11.3 A 沙黄复染液沙黄 0.25g 95% 乙醇 10.0mL 90.0mL A 将沙黄溶解于乙醇中, 然后用稀释 A.11.4 A 染色法涂片在火焰上固定, 滴加结晶紫染液, 染 1min, 水洗 15

18 A A A 滴加革兰氏碘液, 作用 1min, 水洗滴加 95% 乙醇脱色约 15s~30s, 直至染色液被洗掉, 不要过分脱色, 水洗滴加复染液, 复染 1min, 水洗待干镜检 A.12 BHI 肉汤 A.12.1 小牛脑浸液牛心浸液 200g 250g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 葡萄糖 2.0g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 2.5g 1000mL A min 按以上配好, 加热溶解, 冷却至 25 左右校正 ph 至 7.4±0.2, 分装小试管 121 灭菌 A.13 TE(pH8.0) A mol/ltris-hcl(ph8.0) 10.0 ml 0.5 mol/ledta(ph8.0) 2.0 ml 灭菌去离子水 988mL A.13.2 将 1mol/LTris-HCl 缓冲液 (ph8.0) 0.5mol/LEDTA 溶液 (ph8.0) 加入约 800mL 灭菌去离子水均匀, 再定容至 1000mL,121 高压灭菌 15min,4 保存 A PCR 反应缓冲液 A mol/ltris-hcl(ph8.5) 840 ml 氯化钾 (KCl) 37.25g 灭菌去离子水 160mL A.14.2 保存将氯化钾溶于 1mol/LTris-HCl(pH8.5), 定容至 1000mL,121 高压灭菌 15min, 分装后

19 A TAE 电泳缓冲液 A.15.1 Tris 242.0g EDTA-2Na(Na2EDTA 2H2O) 37.2g 冰乙酸 (CH3COOH) 57.1mL 灭菌去离子水 942.9mL A.15.2 Tris 和 EDTA-2Na 溶于 800mL 灭菌去离子水, 充分搅拌均匀 ; 加入冰乙酸, 充分溶解 ; 用 1 mol/l NaOH 调 ph 至 8.3, 定容至 1L 后, 室温保存使用时稀释 50 倍即为 1 TAE 电泳缓冲液 A.16 6 上样缓冲液 A.16.1 溴酚蓝 0.5g 二甲苯氰 FF 0.5g 0.5 mol/ledta(ph8.0) 0.06 ml 甘油 360mL 灭菌去离子水 640mL A mol/LEDTA(pH8.0) 溶于 500mL 灭菌去离子水中, 加入溴酚蓝和二甲苯氰 FF 溶解, 与甘油混合, 定容至 1000mL, 分装后 4 保存 17

实验室常用培养基的配制方法

实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin( 氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 配制方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 ; 2. 加入 40 ml 灭菌水, 充分混合溶解后, 定容至 50 ml; 3. 用 0.22 µm 过滤膜过滤除菌 ; 4. 小份分装 (1 ml/ 份 ) 后,-20 保存 IPTG(