果蔬表面有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测

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1 目 录 一 意义...2 二 适用范围...3 三 准备工作及注意事项 微生物快速检测所需的基本条件 样品稀释液的配制与移液器的消毒 无菌操作和注意事项 检测流程图...4 四 试纸片操作 菌落总数测试片 餐饮具用大肠菌群测试片 大肠菌群大肠杆菌测试片 沙门氏菌测试片 金黄色葡萄球菌测试片 大肠杆菌 O157 测试片 副溶血孤菌测试片 阪崎肠杆菌测试片 蜡样芽胞杆菌测试片 食品大肠菌群检测试剂盒 (9 管法 ) 水质大肠菌群检测试剂盒 (5 管法 ) 六种致病菌和大肠菌检测试剂盒

2 一 意义 食品在生产 加工 储存 运输和销售等各个环节都有可能受到有害微生物的污染, 从而引起食品腐败变质和食源性食物中毒的发生, 而且一些危险的致病菌不断涌现出来 据世界卫生组织估计, 在全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中,70% 是由于食用了各种致病性微生物污染的食品和饮水造成的 中国社科院发布的首部食品安全绿皮书 中国食品安全报告 (2007) 指出, 当前我国食品安全的形式依然严峻, 其中微生物污染和化学性食物中毒是影响我国食品安全的最主要因素 微生物污染包括细菌性污染 病毒和真菌及其毒素的污染 2000 年至 2002 年, 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉 熟肉 乳和乳制品 水产品 蔬菜中的致病菌污染状况的监测结果表明, 微生物性食物中毒仍居首位, 占 %; 化学性食物中毒占 38.56%; 动植物性和原因不明的食物中毒均占 10% 左右 为了减少和防止由微生物污染事件的发生, 对食品采用有效的检验方法进行检测和监督是非常必要的 利用传统的检测方法, 主要包括形态检查和生化方法, 其准确性和灵敏性均较高, 但涉及的实验较多 操作繁琐 需要时间较长 准备和收尾工作繁重 有条件的实验室采用了 PCR 仪 全自动细菌鉴定仪 全自动荧光酶标免疫测试系统等先进设备进行检验, 具有快速 灵敏 准确的优点, 但这些先进设备价值昂贵, 基层检测监管单位和食品生产企业一般难以配备 1955 年德国学者 F.J.Forg 发明了一种简单快速的大肠菌群快速检测法 纸片法, 使原来的检测周期由 72 小时缩短到 15 小时, 材料成本降低了四分之三, 同时大大简化了操作程序 从此, 这种集化学 高分子学和微生物学于一体的检测方法开始发展起来, 近十几年来发展更为快速 纸片法或测试片法是基于微生物具有复杂多样的酶系统, 通过加入特异性酶的底物, 在酶的作用下游离出发色基团, 直接观察菌落颜色即可对菌类做出鉴定 从而使传统方法需要几步不同反应 几天甚至更长时间才能完成的检测过程简化为一步完成, 检测时间缩短到 24 小时以内, 不但能够大大提高检测工作的效率, 还可减少大量人工成本 目前国外已有一些知名品牌, 国内一些企业出品的此类产品其质量也是越来越好, 为此项工作的开展与普及奠定了基础 另外, 在国标检测方法基础上研发出的大肠菌检测试剂盒以及致病菌增菌检测试剂盒, 采用包被技术将干燥培养基包被在试剂盒中, 随时取用, 也大大简化了实验前的准备工作 而且, 大肠菌检测试剂盒秉承了国标方法中大肠菌阳性结果时的产酸产气的观察理念, 保证了检 2

3 测结果的准确性 至于致病菌增菌检测试剂盒, 除日常卫生指标的控制外, 更加有利于食物中毒因子的筛选和卫生保障应急处理时使用 二 适用范围 适用于食物中毒样品中致病菌的快速筛查, 常规样品中卫生指标菌与致病菌的日常监测以及检测样品的采集 三 准备工作及注意事项 3.1 微生物快速检测所需的基本条件 (1) 一间通风良好 面积不需要很大的独立房间, 房间里最好备有紫外线消毒灯, 洗手盆, 实验台 应急检测时, 临时性的房间应注意工作环境的的消毒 ( 如采用 84 消毒液消毒等 ), 并备好酒精灯 (2) 一台高压锅或红外线消毒柜 ( 家用消毒碗柜也可, 用于消毒取样罐 均质杯 吸管 培养皿和其他取样工具, 在消毒柜内放一小杯水可使消毒效果更有保证, 注意消毒物品不要接触到红外发热管 ); 应急检测时, 应备好消毒液和酒精, 含氯消毒液的浓度在 200ppm 时, 器皿消毒应保持 5 分钟以上 (3) 一台小型恒温培养箱 ; (4) 有条件时, 配备一台普通冰箱, 用于存放样品 ; (5) 食品微生物采样检测箱, 箱内备有采样用具与实验用的一些工具和器皿 ; (6) 检测用试纸与试剂盒 3.2 样品稀释液的配制与移液器的消毒 ⅰ 生理盐水的配置与灭菌 : 取 8.5g 氯化钠 (NaCl) 到三角烧瓶中, 加入 1000mL 蒸馏水或纯净水, 煮沸 10min, 盖上消毒棉后放至室温 ⅱ 移液器管头的消毒 : 将管头放入锡箔袋或用锡箔纸包好, 放入民用红外线消毒柜中消毒 ; 或将管头放入消毒液中浸泡, 取用时注意甩干消毒液并用无菌生理盐水冲洗三次 ⅲ 消毒效果观察 : 用移液器取 1mL 配制好的生理盐水加入到菌落总数检测纸片上, 放入培养箱, 恒温 36 ±1, 培养 15~24h, 观察消毒效果是否良好 此操作可与样品检测同时进行 3

4 3.3 无菌操作和注意事项 北京智云达科技有限公司 1 点燃酒精灯, 营造局部无菌环境 取样和加样时尽量靠近酒精灯操作 能用火焰消毒的操作工具如镊子 剪子 长柄勺 小刀等尽量在酒精灯上消毒后使用 2 用 75% 酒精棉球将手和样品开口处周围抹擦消毒 3 将无菌袋或无菌器皿放在天平上, 称量 25g 样品 ( 液体样品采用移液枪或移液管量取 ), 加入 225mL 生理盐水将样品溶解, 混匀 ( 此为 10 倍样品稀释液 ), 从中取 1mL 加入到无菌试管中, 加入 9mL 生理盐水, 混匀 ( 此为 100 倍样品稀释液 ) 4 若不能及时检验, 应将冷冻样品置于 -15 保存, 非冷冻而易腐的食品, 应置于 4 冰箱保存 检验前冷冻样品可于 2~5 18h 内解冻, 或在 45 以下 15min 内解冻 5 检测用纸片或测试片一般应放在 4~10 冰箱中, 保质期为一年, 铝箔袋打开后, 未用完的纸片要放回铝箔袋中封好, 放到冰箱中, 一个月内用完 在高湿度的环境中可能出现冷凝水, 最好在拆封前将整包回温至室温 6 检测用纸片或测试片接种时, 为防止菌落聚集在一起不方便计数, 最好缓慢均匀地将样品匀液加到加样区的各个部分 加完液稍等片刻, 待液体渗透差不多时再将上盖膜轻轻盖下, 以免液体外溢造成结果误差 7 检测用纸片或测试片培养时, 一定要将测试片放回原来的自封袋中, 将袋口密封好再放入培养箱中, 否则水分蒸发使滤纸变得很干燥, 影响菌落的生长 8 大肠菌检测试剂盒培养前, 注意排气泡 从培养箱中取出时注意平拿平放, 防止集气孔中反应产生的气泡溢出 9 致病菌出现阳性样本时, 需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理 3.4 检测流程图 1. 食物中毒样品的快速筛查 4

5 固体样品 : 取 1:10 溶解稀释液 液体样品 : 取原液 致病菌检测试剂盒 36 培养 6h~18h 如果某增菌液发生混浊, 即预示含有 某种致病菌 可将混浊的增菌液接种到相应测试片上,36 培养 18~24h 验证结果 2. 卫生指示菌与致病菌的日常监测固体样品 : 取 1:10 1:100 或 1:1000 溶解稀释液液体样品 : 取原液 1:10 或 1:100 稀释液 加入到各测试片或试剂盒中 36 培养, 根据各测试片或试剂盒的 培养时间观察检测结果 3. 具体操作详见产品说明书 四 试纸片操作 4.1 菌落总数测试片 1 适用范围 : 可用于各类食品及原料中菌落总数的测定 也可用于与食品接触的容器 操作台和其他设备表面的卫生检测 2 方法原理 : 将营养培养基 凝胶和氯化三苯基四氮唑 (TTC) 显色剂等加载在试纸片, 经加样 培养后, 细菌菌落在测试片上显现出红色菌斑, 通过计数报告结果 3 操作方法 5

6 (1) 样品处理 : 无菌称取样品 25g( 或 25mL) 放入含有 225mL 无菌生理盐水的采样瓶或均质杯内, 经充分振摇 ( 均质 ) 做成 1:10 的稀释液 用 1mL 灭菌吸管吸取 1:10 稀释液 1mL, 注入含有 9mL 灭菌生理盐水的试管内, 用 1mL 灭菌吸管反复吸吹制成 1:100 的稀释液 以此类推, 做出 1:1000 等稀释度的稀释液, 每个稀释度更换一支灭菌吸管 (2) 接种 : 一般食品选 2~3 个稀释度进行检测, 含菌量少的液体样品 ( 如食用纯水和矿泉水等 ) 可直接用原液检测 将测试片放在水平台面上, 揭开上面的透明薄膜, 用灭菌吸管吸取样品原液或稀释液 1mL, 均匀加到中央的纸片上, 轻轻将上盖膜放下, 静置 5 min 使培养基凝固, 最后用手轻轻地压一下 每个稀释度接种两片 (3) 培养 : 将测试片叠在一起放回原自封袋中, 透明面朝上水平置于恒温培养箱内, 堆叠片数不超过 12 片 培养温度为 36 ±1, 培养 15~24h 4 结果判断与计数 : (1) 细菌在纸片上生长后会显示红色斑点, 选择菌落数适中 (10 个 ~100 个 ) 的纸片进行计数, 乘以稀释倍数后即为每克 ( 或毫升 ) 样品中所含的细菌菌落总数 菌落数在 100 以内时, 按实有数报告 大于 100 时, 用二位有效数字, 二位有效数字后面的数字, 以四舍五入方法计算, 并以 10 的指数来表示 (2) 计数原则与报告方式 1 通常选择菌落在 10 个 ~100 个之间的纸片进行计数, 乘以稀释倍数报告之 ( 见下表中例次 1) 国家标准菌落总数报告方式术语为 cfu/g 或 ml,cfu 的含义为菌落形成单位 2 若有两个稀释度的菌落数在 10 个 ~100 个之内, 两者的比值小于 2, 则取其平均数, 若大于 2, 则采用稀释度小者报告 ( 见下表中例次 2 和例次 3) 3 若三个稀释度的菌落数都有在 10 个 ~100 个之内时, 应选择二个低数值的平均数 ( 见下表中例次 4) 4 若三个稀释度的菌落数均小于 10 个或大于 100 个时, 应重新试用更低或更高的稀释度进行菌落计数 ; 或采用均小于数量标准的最小值, 或采用均大于数量标准的最大值 ( 见下表中例次 5 和例次 6) 6

7 例次 稀释度 两稀释度之比 选定计数稀释度 报告方式 ( 个 /g 或个 /ml) 表面取样方法 : 加 1mL 灭菌生理盐水在测试片上, 静置至少 1h 使培养基凝固 ; 提起上层膜, 使中央滤纸部分贴到待测物表面, 用手在外侧轻压 ; 然后将上盖膜合上, 置培养箱内培养 6 注意事项 : 使用过的纸片上带有活菌, 需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理 菌落数少时的情况 菌落数多时的情况 4.2 餐饮具用大肠菌群测试片 1 适用范围 : 适用于餐 ( 饮 ) 具 食品加工器具等表面卫生状况的测定 2 采样 (1) 随机抽取消毒后准备使用的各类食具 ( 碗 盘 杯等 ), 取样量可根据大 中 小不同饮食行业每次采样 6 件 ~10 件, 每件贴纸片两张, 每张纸片面积 25cm 2 (5cm 5cm) 用无菌生理盐水湿润大肠菌群检测用纸片后, 立即贴于食具内侧表面,30s 后取下, 置于无菌塑料袋内 (2) 筷子以 5 只为一件样品, 用灭菌 1mL 吸管吸取无菌生理盐水湿润纸片后, 立即将筷子进口端 ( 约 5cm) 抹试纸片, 每件样品抹拭两张, 放入无菌塑料袋内 3 培养 : 将已采样的纸片置于 37 恒温培养箱中培养 16 h~18h, 取出观察结果 4 结果判断 : 若纸片保持紫蓝色不变, 或有红色斑点但斑点周围无黄晕者为大肠菌群阴性 ; 在红色斑点周围有黄晕, 或纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性 国家标准规定 : 在 50cm 2 的纸片上 ( 即两片纸片上 ), 大肠菌群不得检出 7

8 4.3 大肠菌群大肠杆菌测试片 大肠菌群 (17 个 ) 大肠菌群 ( 满视野 ) 1 原理及适用范围 : 大肠杆菌 ( Escherichia coli ) 和大肠菌群 (Coliform) 都是存在于温血动物肠道和粪便的细菌, 是条件性致病菌, 主要造成水体污染, 也可能引起食物中毒的发生 大肠杆菌大肠菌群测试片 (E.coli / Coliform Count Plate) 是一种预先制备好的一次性培养基产品, 可以同时检测大肠杆菌和大肠菌群, 含有大肠菌选择性培养基 冷水可溶性的吸水凝胶和半乳糖苷酶 (GAL) 和葡萄糖醛酸酶 (GUD) 指示剂 大肠杆菌显蓝色, 其他大肠菌群显红色, 蓝点加上红点为总的大肠菌群数 本产品适合于食品及原料中大肠菌群的计数, 如消毒牛乳 冷饮和调味品等样品的检测, 也可用于表面的卫生检测 2 操作方法 (1) 样品处理 : 取样品 25 ml(g) 放入含有 225 ml 灭菌生理盐水的取样罐或均质杯内, 制成 1:10 的样品匀液, 用 1mL 灭菌吸管吸取 1:10 稀释液 1mL, 注入含有 9mL 灭菌生理盐水的试管内, 振摇后成为 1:100 的稀释液 (2) 接种 : 一般食品选 1~2 个稀释度进行检测, 含菌量少的液体样品 ( 如饮用纯水和矿泉水等 ) 可直接吸取原液进行检测 将大肠杆菌大肠菌群测试片 (BE203) 置于平坦实验台面, 揭开上层膜, 用无菌吸管吸取 1mL 样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上, 然后再将上层膜缓慢盖下, 静置 5 min 使培养基凝固, 最后用手轻轻地压一下, 每个稀释度接种两片 (3) 培养 : 将测试片叠在一起放回原自封袋中, 透明面朝上水平置于恒温培养箱内, 堆叠片数不超过 12 片 培养温度为 36 ±1, 培养 15~24h 3 结果判读 : 培养后大肠杆菌显蓝色, 其他大肠菌群显红色, 蓝点加上红点为总的大肠菌群数 选择有阳性菌落的最高稀释度的测试片进行计数, 然后乘以稀释倍数即为样品中每毫升 ( 克 ) 含有大肠菌群数 4 附加说明 8

9 (1) 我国的食品卫生标准大多都以大肠菌群 ( Coliform ) 作为检测指标, 而欧盟等许多国家则以大肠杆菌 (E.coli) 作为检测对象, 因此, 本产品对于出口食品和国际航空配餐等企业具有更广泛的应用前景 (2) 如果样品的酸碱度 ph 7.0 以下时, 应先用灭过菌的碱性溶液 ( 如 1mol/LNaOH) 调节到 ph7.0~8.0 (3) 大肠杆菌大肠菌群测试片对纯菌的检测灵敏度可达 0.15 cfu/ml (4) 一般食品对于大肠菌群的要求都比较严格, 如果测试片上有成片的红点, 或者中央没有红点, 但边缘有很多红点, 一定是已经严重超标, 建议按多不可计来报告 4.4 沙门氏菌测试片 1 适用范围 : 可用于各类食品和原料中沙门氏菌的定性和初筛检测 以及突发事件应急检测需要 2 方法原理 : 将选择性培养基中加入专一性的辛酯酶显色剂, 并将其加载在纸片上, 通过培养, 如果样品中含有沙门氏菌, 即可在纸片上呈紫红色的菌落 3 操作方法 (1) 样品处理 : 无菌称取待测样品 25g( 或 25mL) 放入含有 225mL 无菌生理盐水的采样瓶或均质杯内, 经充分振摇或置均质器中做成 1 10 的样品匀液 (2) 接种 : 将测试片置于平坦实验台面, 揭开上层膜, 用无菌吸管吸取 1mL 样品匀液慢慢均 匀地滴加到纸片上, 然后再将上层膜缓慢盖下, 使培养基凝固, 最后用手轻轻地压一下 每个样 静置 5 min 品接种两 片 (3) 培养 : 将测试片叠在一起放回原自封袋中, 堆叠片数不 超过 12 片, 透明面朝上水平置于恒温培养箱内 培养温度为 36 ±1, 培养 15~24h (4) 结果观察 : 对测试片进行观察, 呈紫红色的菌落为沙门氏菌 ; 呈蓝色的菌落为其他大肠菌, 葡萄球菌不生长 4 附加说明 (1) 有关验证试验表明, 测试片具有较强的敏感性, 在 稀释时仍可检出菌落 临床实际应用结果显示阳性检出率高于分离培养法 1.84, 复查准确率提高约 13.0%( 中国卫 9

10 生检验杂志 2006, 16(8): ) (2) 本法还可应用于从业人员体检 中毒样品和物体表面的检测, 用取样棉签涂抹被测物体表面, 放入装有 3mL 灭菌生理盐水的试管中, 摇晃 10s, 然后取 1mL 接种到测试片上 (3) 注意使用过的测试片上带有活菌, 需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理 4.5 金黄色葡萄球菌测试片 1 适用范围 : 可用于各类食品和原料中金黄色葡萄球菌的检测以及突发事件应急需要 2 方法原理 : 将选择性培养基中加入专一性的酶显色剂, 并将其加载在纸片上, 通过培养, 如果样品中含有黄色葡萄球菌, 即可在纸片上呈现紫红色的菌落 3 操作方法 (1) 样品处理 : 无菌操作取 25g(25mL) 样品放入含有 225mL 无菌生理盐水的采样瓶或均质杯内, 充分振摇或置均质器中制成样品匀液, 静置片刻 (2) 接种 : 将测试片置于平坦实验台面, 揭开上层膜, 用无菌吸管吸取 1mL 样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上, 然后再将上层膜缓慢盖下, 静置 5 min 使培养基凝固, 最后用手轻轻地压一下 每个样品接种两片 (3) 培养 : 将加了样的测试片叠放在一起, 放入原来的自封袋中, 堆叠片数不超过 12 片, 透明膜向上平放在 37 培养箱内培养 15h~24h 10

11 (4) 结果观察 : 对测试片进行观察, 紫红色菌落为金黄色葡萄球菌, 大肠埃希氏菌, 普通大肠杆菌呈蓝色菌落, 而溶血性链球菌, 沙门氏菌, 变形杆菌在试片上不生长 4 附加说明 (1) 山东省疾病预防控制中心的验证结果表明, 当金黄色葡萄球菌在 0~9 个菌落范围内时, 测试片与血平板均能检出, 作为致病菌不得捡出的标准要求, 可以作为金黄色葡萄球菌检验应用 (2) 本法还可应用于从业人员体检 中毒样品和物体表面的检测, 用取样棉签涂抹被测物体表面, 放入装有 3mL 灭菌生理盐水的试管中, 摇晃 10s, 然后取 1mL 接种到测试片上 (3) 试验后纸片应及时按生物安全要求进行无害化处理 (4) 出现阳性菌落的样本, 最好用其他更为可靠的方法进行验证, 没有条件的话至少再取样重复检验一次 4.6 大肠杆菌 O157 测试片 1 适用范围 : 用于各类食品以及人体体检样品中大肠杆菌 O157:H7 的检测 以及突发事件应急检测需要 2 方法原理 : 采用选择性显色培养基作为主要原料, 加入专一性酶显色剂, 运用微生物测试片技术, 做成一次性快速检验产品, 通过接种 培养, 如果样品中含有大肠杆菌 O157:H7, 即可在纸片上呈现紫红色的菌落 3 操作方法 (1) 样品处理 : 无菌操作取 25g(mL) 样品放入含有 225mL 无菌生理盐水的采样瓶或均质杯内, 充分振摇或置均质器中制成样品匀液, 静置片刻 (2) 接种 : 将测试片水平放在台面上, 小心揭开上盖膜, 用灭菌吸管吸取 1 ml 样品上清液或增菌液, 均匀加到中央的滤纸片上, 然后轻轻将上盖膜放下, 静置 5min 每个样品接种两片 (3) 培养 : 将加了样的测试片叠放在一起, 放入原来的自封袋中, 堆叠片数不超过 12 片, 透明膜向上平放在 37 培养箱内培养 15h~24h 11

12 (4) 结果观察 : 对测试片进行观察, 呈紫红色的菌落为大肠杆菌 O157:H7; 呈蓝色的菌落为其他大肠菌群 4 附加说明 (1) 本法还可应用于从业人员体检 中毒样品和物体表面的检测, 用取样棉签涂抹被测物体表面, 放入装有 3mL 灭菌生理盐水的试管中, 摇晃 10s, 然后取 1mL 接种到测试片上 (2) 注意使用过的纸片上带有活菌, 需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理 (3) 出现阳性菌落的样本, 最好用其他更为可靠的方法进行验证, 没有条件的话至少再取样重复检验一次 4.7 副溶血孤菌测试片 1 适用范围 : 用于各类食品和原料中副溶血弧菌的检测, 以及突发事件应急检测需要 2 方法原理 : 采用一种商品化的一次性培养基产品, 含有高选择性培养基 吸水凝胶和特异酶指示剂等重要成分, 培养 15~24 小时就可确认是否有副溶血弧菌的存在 3 操作方法 (1) 样品处理 : 取样品 25 ml(g) 放入含有 225 ml 灭菌生理盐水的取样罐或均质杯内, 充分振摇或置均质器中制成 1 10 的样品匀液 (2) 接种 : 将测试片置于平坦实验台面, 揭开上层膜, 用无菌吸管吸取 1mL 样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上, 然后再将上层膜缓慢盖下, 静置 5 min 使培养基凝固, 最后用手轻轻地压一下 每个样品接种 2 片 (3) 培养 : 将测试片叠在一起放回原自封袋中, 透明面朝上水平置于恒温培养箱内, 堆叠片数不超过 12 片 培养温度为 36 ±1, 培养 15~24h (4) 结果判别 : 呈紫红色的菌落为副溶血弧菌 多数非目的菌在测试片上不生长, 少数能生长, 如创伤弧菌和霍乱弧菌, 但菌落呈蓝色, 明显区别于目的菌 对于出现阳性菌落的样品, 最好用其他方法作进一步的鉴定 12

13 4 附加说明 (1) 汕头出入境检验检疫局技术中心的对比试验结果表明, 副溶血弧菌测试片具有较高的检测灵敏度和准确性, 对纯菌的检测灵敏度达到 8cfu/mL, 与 SN 标准方法符合率达到 90% 以上 (2) 注意使用过的测试片上带有活菌, 需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理 (3) 出现阳性菌落的样本, 最好用其他更为可靠的方法进行验证, 没有条件的话至少再取样重复检验一次 4.8 阪崎肠杆菌测试片 1 适用范围 : 可用于各类食品和原料中阪崎肠杆菌菌的检测以及突发事件应急需要 2 方法原理 : 测试片是一种预先制备好的一次性培养基产品, 由阪崎肠杆菌选择性培养基 吸水凝胶和特异性酶显色剂等组成, 一步培养 15~24 小时就可确定出目标菌的存在 3 操作方法 (1) 样品处理 : 取样品 25 ml(g) 放入含有 225 ml 灭菌生理盐水的取样罐或均质杯内, 充分振摇或置均质器中制成 1 10 的样品匀液 (2) 接种 : 将测试片置于平坦实验台面, 揭开上层膜, 用无菌吸管吸取 1mL 样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上, 然后再将上层膜缓慢盖下, 静置 5 min 使培养基凝固, 最后用手轻轻地压一下 每个样品接种 2 片 (3) 培养 : 将测试片叠在一起放回原自封袋中, 透明面朝上水平置于恒温培养箱内, 堆叠片数不超过 12 片 培养温度为 36 ±1, 培养 15~24h (4) 结果判别 : 对测试片进行观察, 呈蓝绿色的菌落为阪崎肠杆菌 对于出现阳性菌落的样品, 最好用其他方法作进一步的鉴定 4 附加说明 (1) 阪崎肠杆菌纯菌株产生典型的蓝绿色点, 接种一些肠道 13

14 菌如大肠杆菌 肠炎沙门氏菌等时, 一加样下去就会出现有紫色的点或晕状, 此为产品本身显色剂的原因, 不影响产品的使用和结果判读 ; 而金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 O157 和副溶血性弧菌等均被抑制 (2) 本法还可应用于从业人员体检 中毒样品和物体表面的检测, 用取样棉签涂抹被测物体表面, 放入装有 3mL 灭菌生理盐水的试管中, 摇晃 10s, 然后取 1mL 接种到测试片上 (3) 注意使用过的测试片上带有活菌, 需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理 4.9 蜡样芽胞杆菌测试片 1 适用范围 : 用于各类食品以及人体体检样品中蜡样芽胞杆菌的检测 以及突发事件应急检测需要 2 方法原理 : 采用一种商品化的一次性培养基产品, 含有高选择性培养基 吸水凝胶和特异酶指示剂等重要成分, 培养 15~24 小时就可确认是否有目标菌的存在 3 操作方法 (1) 样品处理 : 取样品 25 ml(g) 放入含有 225 ml 灭菌生理盐水的取样罐或均质杯内, 充分振摇或置均质器中制成 1 10 的样品匀液 (2) 接种 : 将测试片置于平坦实验台面, 揭开上层膜, 用无菌吸管吸取 1mL 样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上, 然后再将上层膜缓慢盖下, 静置 5 min 使培养基凝固, 最后用手轻轻地压一下 每个样品接种 2 片 (3) 培养 : 将测试片叠在一起放回原自封袋中, 透明面朝上水平置于恒温培养箱内, 堆叠片数不超过 12 片 培养温度为 36 ±1, 培养 15~24h (4) 结果判别 : 对测试片进行观察, 蜡样芽胞杆菌产生典型的蓝绿色点, 而大部分非目标菌如大肠杆菌 大肠杆菌 O157 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 副溶血性弧菌和阪崎肠杆菌等均被抑制 4 附加说明 (1) 本法还可应用于从业人员体检 中毒样品和物体表面的检测, 用取样棉签涂抹被测物体表面, 放入装有 3mL 灭菌生理盐水的试管中, 摇晃 10s, 然后取 1mL 接种到测试片上 (2) 注意使用过的测试片上带有活菌, 需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理 14

15 (3) 出现阳性菌落的样本, 最好用其他更为可靠的方法进行验证, 没有条件的话至少再取样重复检验一次 4.10 食品大肠菌群检测试剂盒 (9 管法 ) 1. 适用范围 : 适用于各类食品 纯净水等样品中大肠菌群数检测 2. 方法原理 : 与国标法相同 事先将浓缩乳糖胆盐培养基包被在试剂盒中, 随时取用 3. 操作方法 : (1) 样品处理 : 按 食品卫生微生物学检验 GB/T (2) 加样 : 将试剂盒放在台面上, 打开盒盖, 以无菌手续分别取 3 个 1 10 稀释液 10mL 置试剂盒大孔中, 分别取 3 个 1mL 置三个小孔中, 取 3 个 稀释液 1mL 置另三个小孔中 (3) 排气泡 : 加样后集气窗内如有气泡存在, 可将试剂盒以 30~45 度角倾斜, 必要时可轻轻用力在桌面敲击数下即可排出集气窗内气泡 (4) 培养 : 将加样后的试剂盒置 36 ±1 温箱中, 培养 18h~24h (5) 观察结果 : 样液变为黄色 集气窗中有气泡产生时为阳性结果 参照国标 GB/T 的方法查 MPN 检索表报告结果 4. 注意事项 : (1) 加入样品后不需摇匀, 平拿平放 (2) 加样时可用一次性无菌塑料吸管, 将样品稀释液加至试剂盒所标刻度处 (3) 在培养箱中取试剂盒时应平托出来, 不要倾斜以免由于试剂盒的倾斜将阳性管集气窗中的气泡排出而影响结果 (4) 试剂盒为一次性无菌用品, 供一次性使用 加样后排气泡阳性阴性试管为国标法结果 4.11 水质大肠菌群检测试剂盒 (5 管法 ) 1 适用范围 : 适用于饮用水中总大肠菌群的快速检验 15

16 2 方法原理 : 将乳糖 显色剂和选择性培养基加载在纸片上, 经培养后能够在纸片上生长并发酵乳糖产酸的即为大肠菌群阳性, 记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数, 根据大肠菌群 MPN 表查出相应的大肠菌群数 3 操作方法 (1) 用灭菌吸管吸取 10mL 水样插入装有大纸片的塑料薄膜袋中, 均匀涂布, 共做 5 个重复 ; (2) 将接种好的纸片平放于培养箱中,36 ±1, 培养 15~24h 观察结果 (3) 观察每片颜色变化, 若纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性, 纸片变黄或在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为大肠菌群阳性 (4) 根据每个稀释度的阳性反应纸片数, 查 MPN 表可得出水样中总大肠菌群的 MPN 值 ( 见表 2) 如所有纸片均为阴性时, 可报告总大肠菌群未检出 (5) 对于阳性纸片, 应进一步检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群 用无菌镊子在阳性菌斑处挑取少许带菌滤纸, 用 3mL 无菌水混匀, 接种到大肠埃希氏菌耐热大肠菌群测试片上, 进行 44.5 培养和检验 表 2 用 5 份 10mL 水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数 (MPN) 阳性管或纸片数最可能数 (MPN/100mL) 0 < > 六种致病菌和大肠菌检测试剂盒 1 适用范围 : 本品适用于食品及水中致病性沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 副溶血弧菌 致泻大肠埃希菌 腊样芽孢杆菌 板奇肠杆菌检测的前期增菌预实验观察以及大肠菌群污染程度的检测 2 方法原理 : 依据国标 GB/T 方法, 采用包被技术将相对应培养基 包被在试剂盒底部, 随时取用 省去了实验前的大量准备工作, 方便 快捷 16

17 3 样品稀释 : 同国标法 固体或半固体样品用灭菌生理盐水配制成 1:10 和 1:100 的稀释液 液体样品取原液 4 致病菌检测 (1) 加样 : 用灭菌吸管吸取原液或 1:10 样品稀释液 4mL~10 ml( 不得少于 4mL) 分别加入到标号为 A B C 的增菌格 ( 孔 ) 内 加样后的 号分别为副溶血弧菌 致泻大肠埃希菌 板奇肠杆菌增菌液 ;A B C 分别为金黄色葡萄球菌 沙门菌 腊样芽孢杆菌增菌液 (2) 培养 : 将加样后的试剂盒盖上盖, 平放在 36 ±1 培养箱内培养 6~18 小时 (3) 观察结果 : 如果某致病菌的增菌液发生浑浊, 即预示含有此种致病菌 可将浑浊液接种于各相对应的选择性培养基上或接种于相对应的测试片上 置 36 ±1 培养箱内培养,18~24 小时观察验证结果 5 大肠菌检测 (1) 加样 : 将试剂盒放在试验台面上, 打开盒盖, 用灭菌吸管分别吸取 3 个原液或 1:10 样品稀释液 1mL 加到标号为 的小培养基孔内 另用灭菌吸管分别吸取 3 个 1:10 或 1:100 的样品稀释液 1mL 加到标号为 的小培养基孔内, 标号为 10 的小培养基孔内可加入 1mL 灭菌生理盐水作为培养基阴性对照孔使用 (2) 排气泡 : 加样后集气窗内如有气泡存在, 可将试剂盒以 30~45 度角倾斜使气泡排出, 必要时可轻轻用力在桌面上敲击数下排出气泡 (3) 培养 : 将加样后的试剂盒盖上盖, 平放在 36 ±1 培养箱内培养 18~24 小时 (4) 观察结果 : 样液变为黄色为产酸 集气窗中有气泡为产气, 产酸产气者为阳性结果, 阳性结果的孔数越多, 说明污染越严重 6 注意事项 (1) 致病菌检测与大肠菌检测可同时进行 ; 加入样品后不需摇匀 ; 大肠菌检测培养前一定要排气泡 ; 在培养箱中取试剂盒时注意平托出来, 避免由于试剂盒的倾斜使大肠菌阳性集气窗中的气泡流失而影响结果判断 (2) 试剂盒为一次性无菌包装用品, 供一次性即开即用 7 保存条件和有效期 : 避光保存于阴凉干燥处, 最佳温度为 2~8, 有效期 18 个月 17

18 18

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