前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 修改了范围 ; 修改了设备和材料 ; 修改了培养基和试剂 ; 修改了检验程序 ; 规范了样品制备过程 ; 修改

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1 中华人民共和国国家标准 GB xxxx 食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 ( 征求意见稿 ) xxxx-xx-xx 发布中华人民共和国卫生部 xxxx-xx-xx 实施发布

2 前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 修改了范围 ; 修改了设备和材料 ; 修改了培养基和试剂 ; 修改了检验程序 ; 规范了样品制备过程 ; 修改了嗜盐性试验的盐浓度 I

3 食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 1 范围本标准规定了食品中副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 的检验方法本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验 2 设备和材料设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : 2.1 恒温培养箱 :36 ±1 2.2 冰箱 :2 ~5 7 ~ 恒温水浴箱 :36 ±1 2.4 均质器或无菌乳钵 2.5 天平 : 感量 0.1 g 2.6 无菌试管 :18 mm 180 mm 15 mm 100 mm 2.7 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 2.8 无菌锥形瓶 : 容量 250 ml 500 ml 1000 ml 2.9 无菌培养皿 : 直径 90 mm 2.10 全自动微生物生化鉴定系统 2.11 无菌手术剪镊子 3 培养基和试剂 3.1 3% 碱性蛋白胨水 : 见附录 A 中 A 硫代硫酸盐 - 柠檬酸盐 - 胆盐 - 蔗糖 (TCBS) 琼脂 : 见附录 A 中 A % 胰蛋白胨大豆琼脂 : 见附录 A 中 A % 三糖铁琼脂 : 见附录 A 中 A 嗜盐性试验培养基 : 见附录 A 中 A % 甘露醇试验培养基 : 见附录 A 中 A % 赖氨酸脱羧酶试验培养基 : 见附录 A 中 A.7 1

4 3.8 3% MR-VP 培养基 : 见附录 A 中 A % 溶液 : 见附录 A 中 A 我妻氏血琼脂 : 见附录 A 中 A 氧化酶试剂 : 见附录 A 中 A 革兰氏染色液 : 见附录 A 中 A ONPG 试剂 : 见附录 A 中 A Voges-Proskauer(V-P) 试剂 : 见附录 A 中 A 弧菌显色培养基 3.16 生化鉴定试剂盒 4 检验程序副溶血性弧菌检验程序见图 1 2

5 样品 25 g(ml)+225 ml 3% 碱性蛋白胨水 3% 碱性蛋白胨水 3 管 3 个合适的稀释度如果进行定性检测, 则不需要进行此步骤 36 ±1,8 h~18 h TCBS 或弧菌显色培养基 36 ±1,18 h~24 h 挑取可疑菌落, 接种于 3% 胰蛋白胨大豆琼脂 36 ±1,18 h~24 h 筛选试验氧化酶试验, 革兰氏染色, 3% 三糖铁琼脂, 嗜盐性试验生化试验或选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统血清学试验神奈川试验 ( 可选作项 ) 结果与报告图 1 副溶血性弧菌检验程序 5 操作步骤 5.1 样品制备非冷冻样品采集后应立即置 7 ~10 冰箱保存, 尽可能及早检验 ; 冷冻样品应在 45 以下不超过 15 min 或在 2 ~5 不超过 18 h 解冻鱼类和头足类动物取表面组织肠或鳃贝类取全部内容物, 包括贝肉和体液 ; 甲壳类取整个动物, 或者动物的中心部分, 包括肠和鳃如为带壳贝类或甲壳类, 则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分, 然后以无菌操作打开外壳, 按上述要求取相应部分以无菌操作取样品 25 g(ml), 加入 3% 碱性蛋白胨水 225 ml, 用旋转刀片式均质器以 r/min 均质 1 min, 或拍击式均质器拍击 2 min, 制备成 1:10 的样品匀液如无均质器, 则将样品放入无菌乳钵, 自 225 ml 3% 碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵, 样品磨碎后放入 500 ml 无菌锥形瓶, 再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品 1~2 次, 洗液放入锥形瓶, 最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶, 充分振荡, 制备 1:10 的样品匀液 5.2 增菌定性检测 3

6 将上述 1:10 样品匀液于 36 ±1 培养 8 h~18 h 定量检测用无菌吸管吸取 1:10 样品匀液 1 ml, 注入含有 9 ml 3% 碱性蛋白胨水的试管内, 振摇试管混匀, 制备 1:100 的样品匀液另取 1 ml 无菌吸管, 按操作程序, 依次制备 10 倍系列稀释样品匀液, 每递增稀释一次, 换用一支 1 ml 无菌吸管根据对检样污染情况的估计, 选择三个连续的适宜稀释度, 每个稀释度接种三支含有 9 ml 3% 碱性蛋白胨水的试管, 每管接种 1 ml 置 36 ±1 恒温箱内, 培养 8 h~18 h 5.3 分离对所有显示生长的增菌液, 用接种环在距离液面以下 1 cm 内沾取一环增菌液, 于 TCBS 平板或弧菌显色培养基平板上划线分离一支试管划线一块平板于 36 ±1 培养 18 h~24 h 典型的副溶血性弧菌在 TCBS 上呈圆形半透明表面光滑的绿色菌落, 用接种环轻触, 有类似口香糖的质感, 直径 2 mm~3 mm 从培养箱取出 TCBS 平板后, 应尽快 ( 不超过 1 h) 挑取菌落或标记要挑取的菌落典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定 5.4 纯培养挑取三个或以上可疑菌落, 划线接种 3% 胰蛋白胨大豆琼脂平板,36 ±1 培养 18 h~ 24 h 5.5 初步鉴定氧化酶试验 : 挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验, 副溶血性弧菌为氧化酶阳性涂片镜检 : 将可疑菌落涂片, 进行革兰氏染色, 镜检观察形态副溶血性弧菌为革兰氏阴性, 呈棒状弧状卵圆状等多形态, 无芽胞, 有鞭毛挑取纯培养的单个可疑菌落, 转种 3% 三糖铁琼脂斜面并穿刺底层,36 ±1 培养 24 h 观察结果副溶血性弧菌在 3% 三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑, 无气泡, 斜面颜色不变或红色加深, 有动力嗜盐性试验 : 挑取纯培养的单个可疑菌落, 分别接种 0% 6% 8% 和 10% 不同浓度的胰胨水,36 ±1 培养 24 h, 观察液体混浊情况副溶血性弧菌在无和 10% 的胰胨水中不生长或微弱生长, 在 6% 和 8% 的胰胨水中生长旺盛 5.6 确定鉴定取纯培养物分别接种含 3% 的甘露醇试验培养基赖氨酸脱羧酶试验培养基 MR-VP 培养基, 36 ±1 培养 24 h~48 h 后观察结果 ;3% 三糖铁琼脂隔夜培养物进行 ONPG 试验可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统 6 血清学分型 ( 可选择项 ) 6.1 制备 : 接种两管 3% 胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面,36 ±1 培养 18 h~24 h 用含 3% 的 5% 甘油溶液冲洗 3% 胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养物, 获得浓厚的菌悬液 6.2 K 抗原的鉴定 : 取一管上述制备好的菌悬液, 首先用多价 K 抗血清进行检测, 出现凝集反应时再用单个的抗血清进行检测用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对照间隔在每个间隔内各滴加一滴菌悬液, 并对应加入一滴 K 抗血清在对照间隔内加一滴 3% 溶液轻微倾斜玻片, 使各成分相混合, 再前后倾动玻片 1 min 阳性凝集反应应可以立即观察到 6.3 O 抗原的鉴定 : 将另外一管的菌悬液转移到离心管内,121 灭菌 1 h 灭菌后 r/min 离心 15 min, 弃去上层液体, 沉淀用生理盐水洗三次, 每次 r/min 离心 15 min, 最后一次离心后留少 4

7 许上层液体, 混匀制成菌悬液用蜡笔将玻片划分成相等的间隔在每个间隔内加入一滴菌悬液, 将 O 群血清分别加一滴到间隔内, 最后一个间隔加一滴生理盐水作为自凝对照轻微倾斜玻片, 使各成分相混合, 再前后倾动玻片 1 min 阳性凝集反应应可以立即观察到如果未见到与 O 群血清的凝集反应, 将菌悬液 121 再次高压 1 h 后, 重新检测如果仍旧为阴性, 则培养物的 O 抗原属于未知根据表 3 报告血清学分型结果表 3 副溶血性弧菌的抗原 O 群 K 型 1 1,5,20,25,26,32,38,41,56,58,60,64,69 2 3,28 3 4,5,6,7,25,29,30,31,33,37,43,45,48,54,56,57,58,59,72,75 4 4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67,68, ,17,30,47,60,61, , ,21,22,39,41,70, , , ,36,40,46,50,51, ,52,61, 神奈川试验 ( 可选择项 ) 神奈川试验是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素神奈川试验阳性结果与副溶血性弧菌分离株的致病性显著相关用接种环将测试菌株的 3% 胰蛋白胨大豆琼脂 18 h 培养物点种表面干燥的我妻氏血琼脂平板每个平板上可以环状点种几个菌 36 ±1 培养不超过 24 h, 并立即观察阳性结果为菌落周围呈半透明环的 β 溶血 8 结果与报告当检出的可疑菌落生化性状符合表 1 要求时, 报告 25 g(ml) 样品中检出副溶血性弧菌如果进行定量检测, 根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数, 查最可能数 (MPN) 检索表, 报告每 g(ml) 副溶血性弧菌的 MPN 值副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表 2 表 1 副溶血性弧菌的生化性状试验项目革兰氏染色镜检氧化酶动力蔗糖葡萄糖甘露醇分解葡萄糖产气乳糖结果阴性, 无芽胞

8 试验项目硫化氢赖氨酸脱羧酶 V-P ONPG 注 :+ 阳性 ;- 阴性结果名称氧化酶赖氨酸精氨酸表 2 副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别鸟氨酸明胶脲酶 V P 42 生长蔗糖 D 纤维二糖乳糖阿拉伯糖 D 甘露糖 D 甘露醇 ONPG 嗜盐性试验含量 /% 副溶血性弧菌 V V V parahaemolyticus 创伤弧菌 V. vulnificus V 溶藻弧菌 V. alginolyticus 霍乱弧菌 V. cholerae V 拟态弧菌 V. mimicus 河弧菌 V. fluvialis V V - 弗氏弧菌 V. furnissii 梅氏弧菌 V. metschnikovii V V - 霍利斯弧菌 V. hollisae nd 注 :nd 表示未试验 ;V 表示可变 6

9 附录 A 培养基与试剂 A.1 3% 碱性蛋白胨水 A.1.1 成分蛋白胨 30.0 g ph 8.5±0.2 A.1.2 制法将上述成分溶于中, 调节 ph,121 高压灭菌 10 min A.2 硫代硫酸盐 - 柠檬酸盐 - 胆盐 - 蔗糖 (TCBS) 琼脂 A.2.1 成分蛋白胨酵母浸膏柠檬酸钠 (C 6 H 5 O 7 Na 3 2H 2 O) 硫代硫酸钠 (Na 2 S 2 O 3 5H 2 O) 牛胆汁粉柠檬酸铁 1.0 g 胆酸钠 3.0 g 蔗糖 20.0 g 溴麝香草酚蓝 0.04 g 麝香草酚蓝 0.04 g 琼脂 1 ph 8.6±0.2 A.2.2 制法将上述成分溶于中, 调节 ph, 加热煮沸至完全溶解冷至 50 左右倾注平板备用 A.3 3% 胰蛋白胨大豆琼脂 A.3.1 成分胰蛋白胨 1 大豆蛋白胨 30.0 g 琼脂 1 ph 7.3±0.2 A.3.2 制法将上述成分溶于中, 调节 ph,121 高压灭菌 15 min A.4 3% 三糖铁琼脂 7

10 A.4.1 成分蛋白胨 1 月示蛋白胨牛肉膏 3.0 g 酵母浸膏 3.0 g 30.0 g 乳糖蔗糖葡萄糖 1.0 g 硫酸亚铁 (FeSO 4 ) 0.2 g 苯酚红 g 硫代硫酸钠 (Na 2 S 2 O 3 ) 0.3 g 琼脂 12.0 g 水 ph 7.4±0.2 A.4.2 制法将上述成分溶于中, 调节 ph 分装到适当容量的试管中 121 高压灭菌 15 min 制成高层斜面, 斜面长 4 cm~5 cm, 高层深度为 2 cm~3 cm A.5 嗜盐性试验培养基 A.5.1 成分胰蛋白胨按不同量加入 ph 7.2±0.2 A.5.2 制法将上述成分溶于中, 调节 ph, 共配制 5 瓶, 每瓶 100 ml 每瓶分别加入不同量的: (1) 不加 ;(2)3 g;(3)6 g;(4)8g;( 5)10 g 分装试管,121 高压灭菌 15 min A.6 3% 甘露醇试验培养基 A.6.1 成分牛肉膏蛋白胨 30.0 g 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 12H 2 O) 2.0 g 溴麝香草酚蓝.024 g ph7.4±0.2 A.6.2 制法将上述成分溶于中, 调节 ph, 分装每瓶 100 ml,121 高压灭菌 10 min 另配 10% 甘露醇溶液, 同时高压灭菌将 5 ml 糖溶液加入于 100 ml 培养基内, 以无菌操作分装小试管 A.6.3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种, 于 36 ±1 培养不少于 24 h, 观察结果甘露醇阳性者培养物 8

11 呈黄色, 阴性者为绿色或蓝色 A.7 3% 赖氨酸脱羧酶试验培养基 A.7.1 成分蛋白胨酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 溴甲酚紫 0.02 g L- 赖氨酸 30.0 g ph6.8±0.2 A.7.2 制法除赖氨酸以外的成分溶于中, 调节 ph 再按 0.5% 的比例加入赖氨酸, 对照培养基不加赖氨酸分装小试管, 每管 0.5 ml,121 高压灭菌 15 min A.7.3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种, 于 36 ±1 培养不少于 24 h, 观察结果赖氨酸脱羧酶阳性者由于产碱中和葡萄糖产酸, 故培养基仍应呈紫色阴性者无碱性产物, 但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色对照管应为黄色 A.8 3% MR-VP 培养基 A.8.1 成分多胨 7.0 g 葡萄糖磷酸氢二钾 (K 2 HPO 4 ) 30.0 g ph 6.9±0.2 A.8.2 制法将上述成分溶于中, 调节 ph, 分装试管,121 高压灭菌 15 min A.9 3% 溶液 A.9.1 成分 30.0 g ph 7.2±0.2 A.9.2 制法将溶于中,121 高压灭菌 15 min A.10 我妻氏血琼脂 A.10.1 成分酵母浸膏蛋白胨 3.0 g 9

12 70.0 g 磷酸氢二钾 (K 2 HPO 4 ) 甘露醇结晶紫 g 琼脂 1 ph 8.0±0.2 A.10.2 制法将上述成分溶于中, 调节 ph, 加热至 100, 保持 30 min, 冷至 45 ~50, 与 50 ml 预先洗涤的新鲜人或兔红细胞 ( 含抗凝血剂 ) 混合, 倾注平板彻底干燥平板, 尽快使用 A.11 氧化酶试剂 A.11.1 成分 N,N,N',N'- 四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0 g ml A.11.2 制法少量新鲜配制, 于 2 ~5 冰箱内避光保存, 在 7 d 之内使用 A.11.3 试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑取新鲜 (24 h) 菌落, 涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上如果滤纸在 10 s 之内呈现粉红或紫红色, 即为氧化酶试验阳性不变色为氧化酶试验阴性 A.12 革兰氏染色液 A.12.1 结晶紫染色液 A 成分结晶紫 1.0 g 95% 乙醇 20.0 ml 1% 草酸铵水溶液 80.0 ml A 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中, 然后与草酸铵溶液混合 A.12.2 革兰氏碘液 A 成分碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g ml A 制法将碘与碘化钾先进行混合, 加入少许充分振摇, 待完全溶解后, 再加至 300 ml A.12.3 沙黄复染液 A 成分沙黄 0.25 g 95% 乙醇 10.0 ml 90.0 ml A 制法将沙黄溶解于乙醇中, 然后用稀释 10

13 A.12.4 染色法 A 将涂片在酒精灯火焰上固定, 滴加结晶紫染色液, 染 1 min, 水洗 A 滴加革兰氏碘液, 作用 1 min, 水洗 A 滴加 95% 乙醇脱色, 约 15 s~30 s, 直至染色液被洗掉, 不要过分脱色, 水洗 A 滴加复染液, 复染 1 min 水洗待干镜检 A.13 ONPG 试剂 A.13.1 缓冲液 A 成分磷酸二氢钠 (NaH 2 PO 4 H 2 O) 6.9 g 用加至 50.0 ml A 制法将磷酸二氢钠溶于中, 调节 ph 值至 7.0 缓冲液置 2 ~5 冰箱保存 A.13.2 ONPG 溶液 A 成分邻硝基酚 -β-d- 半乳糖苷 (ONPG) 0.08 g 15.0 ml 缓冲液 5.0 ml A 制法将 ONPG 在 37 的中溶解, 加入缓冲液 ONPG 溶液置 2 ~5 冰箱保存, 试验前, 将所需用量的 ONPG 溶液加热至 37 A.13.3 试验方法将待检培养物接种 3% 三糖铁琼脂, 36 ±1 培养 18 h 挑取 1 满环新鲜培养物接种于 0.25 ml 3% 溶液, 在通风橱中, 滴加 1 滴甲苯, 摇匀后置 37 水浴 5 min 加 0.25 ml ONPG 溶液,36 ±1 培养观察 24 h 阳性结果呈黄色阴性结果则 24 h 不变色 A.14 Voges-Proskauer(V-P) 试剂 A.14.1 成分甲液 α- 萘酚 5.0g 无水乙醇 ml 乙液氢氧化钾 40.0g 用加至 ml A.14.2 试验方法将 3% 胰蛋白胨大豆琼脂生长物接种 3% MR-VP 培养基,36 ±1 培养 48 h 取 1 ml 培养物, 转放到一个试管内, 加 0.6 ml 甲液, 摇动加 0.2 ml 乙液, 摇动随意加一点肌酸结晶, 4 h 后观察结果阳性结果呈现伊红的粉红色 11

14 附录 B 副溶血性弧菌最可能数 (MPN) 检索表 B.1 副溶血性弧菌最可能数 (MPN) 检索表每 g(ml) 检样中副溶血性弧菌最可能数 (MPN) 的检索见表 B.1 表 B.1 副溶血性弧菌最可能数 (MPN) 检索表阳性管数 95% 可信限阳性管数 95% 可信限 MPN MPN 下限上限下限上限 < , , , , > 注 1: 本表采用 3 个稀释度 [0.1g(mL) 0.01g(mL) 和 0.001g(mL)], 每个稀释度接种 3 管注 2: 表内所列检样量如改用 lg(ml) 0.1g(mL) 和 0.01g(mL) 时, 表内数字应相应降低 10 倍 ; 如改用 0.01g(mL) 0.001g(mL) g(mL) 时, 则表内数字应相应增加 10 倍, 其余类推 12

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<4D F736F F D203636CAB3C6B7CEA2C9FACEEFD1A7BCECD1E92020DAE6C6E9B3A6B8CBBEFABCECD1E92E646F63> 中华人民共和国国家标准食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验 National food safety standard Food microbiological examination:enterobacter sakazakii 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施中华人民共和国卫生部发布前言本标准代替 GB/T 4789.40-2008 食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验