前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 增加了第二法蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法 ; 将选择性分离培养基 (MYP) 培养条件由 37 培养 12

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妍买丁
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1 中华人民共和国国家标准 GB 食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验发布实施

2 前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 增加了第二法蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法 ; 将选择性分离培养基 (MYP) 培养条件由 37 培养 12 h~20 h 改为 30 ±1 培养 24 h~ 48 h; 增加了溶菌酶试验 ; 修改了操作步骤 ; 增加了附录 A 附录 B I

3 食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验 1 范围本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌 (Bacillus cereus) 的检验方法本标准第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品中蜡样芽胞杆菌的计数 ; 第二法适用于蜡样芽胞杆菌含量较低的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数 2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : a) 冰箱 :2 ~5 ; b) 恒温培养箱 :30 ±1 36 ±1 ; c) 均质器 ; d) 电子天平 : 感量 0.1 g ; e) 无菌锥形瓶 :100 ml 500 ml; f) 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 ; g) 无菌平皿 : 直径 90 mm; h) 无菌试管 :18 mm 180 mm; i) 显微镜 :10 倍 ~100 倍 ( 油镜 ); j) L 涂布棒 3 培养基和试剂 3.1 磷酸盐缓冲液 (PBS): 见附录 A 中 A 甘露醇卵黄多黏菌素 (MYP) 琼脂 : 见附录 A 中 A 胰酪胨大豆多黏菌素肉汤 : 见附录 A 中 A 营养琼脂 : 见附录 A 中 A 过氧化氢溶液 : 见附录 A 中 A 动力培养基 : 见附录 A 中 A 硝酸盐肉汤 : 见附录 A 中 A 酪蛋白琼脂 : 见附录 A 中 A 硫酸锰营养琼脂培养基 : 见附录 A 中 A % 碱性复红 : 见附录 A 中 A 动力培养基 : 见附录 A 中 A 糖发酵管 : 见附录 A 中 A V-P 培养基 : 见附录 A 中 A 胰酪胨大豆羊血 (TSSB) 琼脂 : 见附录 A 中 A 溶菌酶营养肉汤 : 见附录 A 中 A 西蒙氏柠檬酸盐培养基 : 见附录 A 中 A 明胶培养基 : 见附录 A 中 A.17 1

4 4 蜡样芽胞杆菌平板计数法 ( 第一法 ) 4.1 检验程序蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序见图 1 图 1 蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序检样 25 g( 或 25mL) 样品 +225 ml 稀释液, 均质 10 倍系列稀释选取 2 个 ~3 个适宜的连续稀释度的样品匀液, 涂布 MYP 琼脂平板 30 ±1 24 h~48 h 典型菌落计数及确定鉴定报告图 1 蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序 4.2 操作步骤样品处理冷冻样品应在 45 以下不超过 15 min 或在 2 ~5 不超过 18 h 解冻, 若不能及时检验, 应放于 -10 ~ -20 保存 ; 非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验, 若不能及时检验, 应置于 2 ~5 冰箱保存,24 h 内检验样品制备称取样品 25 g, 放入盛有 225 ml PBS 或生理盐水的无菌均质杯内, 用旋转刀片式均质器以 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min, 或放入盛有 225 ml PBS 或生理盐水的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打 1 min~2 min 若样品为液态, 吸取 25 ml 样品至盛有 225 ml PBS 或生理盐水的无菌锥形瓶 ( 瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠 ) 中, 振荡混匀, 作为 1:10 的样品匀液样品的稀释吸取中 1:10 的样品匀液 1 ml 加到装有 9 ml PBS 或生理盐水的稀释管中, 充分混匀制成 1:100 的样品匀液跟据对样品污染状况的估计, 按上述操作, 依次制成十倍递增系列稀释样品匀液每递增稀释 1 次, 换用 1 支 1mL 无菌吸管或吸头 2

5 4.2.4 样品接种根据对样品污染状况的估计, 选择 2 个 ~3 个适宜稀释度的样品匀液 ( 液体样品可包括原液 ), 以 0.3 ml 0.3 ml 0.4 ml 接种量分别移入三块 MYP 琼脂平板, 然后用无菌 L 棒涂布整个平板, 注意不要触及平板边缘使用前, 如 MYP 琼脂平板表面有水珠, 可放在 25 ~50 的培养箱里干燥, 直到平板表面的水珠消失分离培养分离在通常情况下, 涂布后, 将平板静置 10 min 如样液不易吸收, 可将平板放在培养箱 30 ±1 培养 1 h, 等样品匀液吸收后翻转平皿, 倒置于培养箱,30 ±1 培养 24 h±2 h 如果菌落不典型, 可继续培养 24 h±2 h 再观察在 MYP 琼脂平板上, 典型菌落为微粉红色 ( 表示不发酵甘露醇 ), 周围有白色至淡粉红色沉淀环 ( 表示产卵磷脂酶 ) 纯培养从每个平板 ( 符合要求的平板 ) 中挑取至少 5 个典型菌落 ( 小于 5 个全选 ), 分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养,30 ±1 培养 24 h±2 h, 进行确证实验在营养琼脂平板上, 典型菌落为灰白色, 偶有黄绿色, 不透明, 表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状, 边缘常呈扩展状, 直径为 4 mm~10 mm 4.3 确定鉴定染色镜检挑取纯培养的单个菌落, 革兰氏染色镜检蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞杆菌, 大小为 (1 μm~ 1.3 μm) (3 μm~5 μm), 芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端, 不膨大于菌体, 菌体两端较平整, 多呈短链或长链状排列生化鉴定概述挑取纯培养的单个菌落, 进行过氧化氢酶试验动力试验硝酸盐还原试验酪蛋白分解试验溶菌酶耐性试验 V-P 试验葡萄糖利用 ( 厌氧 ) 试验根状生长试验溶血试验蛋白质毒素结晶试验蜡样芽胞杆菌生化特征与其他芽胞杆菌的区别见表 1 表 1 蜡样芽胞杆菌生化特征与其他芽胞杆菌的区别苏云金芽胞杆菌蕈状芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌炭疽芽胞杆菌巨大芽胞杆菌项目 Bacillus Bacillus Bacillus cereus Bacillus anthracis Bacillus megaterium thuringiensis mycoides 革兰氏染色过氧化氢酶动力 +/- +/ /- 硝酸盐还原 + +/ /+ 酪蛋白分解 + + +/- -/+ +/- 溶菌酶耐性卵黄反应

6 表 1 ( 续 ) 苏云金芽胞杆菌蕈状芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌炭疽芽胞杆菌巨大芽胞杆菌项目 Bacillus Bacillus Bacillus cereus Bacillus anthracis Bacillus megaterium thuringiensis mycoides 葡萄糖利用 ( 厌氧 ) V-P 试验甘露醇产酸溶血 ( 羊红细胞 ) /+ - 根状生长蛋白质毒素晶体注 :+ 表示 90%~100% 的菌株阳性 ;- 表示 90%~100% 的菌株阴性 ;+/- 表示大多数的菌株阳性 ;-/+ 表示大多数的菌株阴性动力试验用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中,30 培养 24h 有动力的蜡样芽胞杆菌应沿穿刺线呈扩散生长, 而蕈状芽孢杆菌常呈绒毛状生长也可用悬滴法检查溶血试验挑取纯培养的单个可疑菌落接种于 TSSB 琼脂平板上,30 ±1 培养 24 h±2 h 蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色, 不透明, 似白色毛玻璃状, 有草绿色溶血环或完全溶血环苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血现象, 而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血, 巨大芽胞杆菌为不溶血根状生长试验挑取单个可疑菌落按间隔 2 cm~3 cm 左右距离划平行直线于经室温干燥 1d~2d 的营养琼脂平板上, 30 ±1 培养 24 h~48 h, 不能超过 72h 用蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌标准株作为对照进行同步试验蕈状芽胞杆菌呈根状生长的特征蜡样芽胞杆菌菌株呈粗糙山谷状生长的特征溶菌酶耐性试验用接种环取纯菌悬液一环, 接种于溶菌酶肉汤中,36 ±1 培养 24 h 蜡样芽胞杆菌在本培养基 ( 含 0.001% 溶菌酶 ) 中能生长如出现阴性反应, 应继续培养 24 h 巨大芽胞杆菌不生长蛋白质毒素结晶试验挑取纯培养的单个可疑菌落接种于硫酸锰营养琼脂平板上,30 ±1 培养 24 h±2 h, 并于室温放置 3 d~4 d, 挑取培养物少许于载玻片上, 滴加混匀并涂成薄膜经自然干燥, 微火固定后, 加甲醇作用 30 s 后倾去, 再通过火焰干燥, 于载玻片上滴满 0.5% 碱性复红, 放火焰上加热 ( 微见蒸气, 勿使染液沸腾 ) 持续 1 min~2 min, 移去火焰, 再更换染色液再次加温染色 30 s, 倾去染液用洁净自来水彻底清洗晾干后镜检观察有无游离芽胞 ( 浅红色 ) 和染成深红色的菱形蛋白结晶体如发现游离芽胞形成的不丰富, 应再将培养物置室温 2 d~3 d 后进行检查除苏云金芽胞杆菌外, 其他芽胞杆菌不产生蛋白结晶体生化分型 ( 选做项目 ) 根据对柠檬酸盐利用硝酸盐还原淀粉水解 V-P 试验反应明胶液化试验, 将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别, 见表 2 4

7 表 2 蜡样芽胞杆菌生化分型试验生化试验型别柠檬酸盐硝酸盐淀粉 V-P 明胶注 :+ 表示 90%~100% 的菌株阳性 ;- 表示 90%~100% 的菌株阴性 4.4 结果计算典型菌落计数和确认选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板, 且同一稀释度 3 个平板所有菌落数合计在 20 CFU~200 CFU 之间的平板, 计数典型菌落数如果出现 a)~f) 现象按中公式 (1) 计算, 如果出现 g) 现象则按中公式 (2) 计算 ; a) 只有一个稀释度的平板菌落数在 20 CFU~200 CFU 之间且有典型菌落, 计数该稀释度平板上的典型菌落 ; b)2 个连续稀释度的平板菌落数均在 20 CFU~200 CFU 之间, 但只有一个稀释度的平板有典型菌落, 应计数该稀释度平板上的典型菌落 ; c) 所有稀释度的平板菌落数均小于 20 CFU 且有典型菌落, 应计数最低稀释度平板上的典型菌落 ; d) 某一稀释度的平板菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落, 但下一稀释度平板上没有典型菌落, 应计数该稀释度平板上的典型菌落 ; e) 所有稀释度的平板菌落数均大于 200 CFU 且有典型菌落, 应计数最高稀释度平板上的典型菌落 ; f) 所有稀释度的平板菌落数均不在 20 CFU~200 CFU 之间且有典型菌落, 其中一部分小于 20 CFU 或大于 200 CFU 时, 应计数最接近 20 CFU 或 200 CFU 的稀释度平板上的典型菌落 g) 2 个连续稀释度的平板菌落数均在 20 CFU~200 CFU 之间且均有典型菌落从毎个平板中至少挑取 5 个典型菌落 ( 小于 5 个全选 ), 划线接种于营养琼脂平板做纯培养, 30 ±1 培养 24 h±2 h 计算公式菌落计算公式 (1) 5

8 T = AB (1) Cd 式中 : T 样品中蜡样芽胞杆菌菌落数 ; A 某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数 ; B 鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数 ; C 用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数 ; d 稀释因子菌落计算公式 (2) A1 B1 A2 B 2 C1 C2 (2) T 1.1d 式中 : T 样品中蜡样芽胞杆菌菌落数 ; A 1 第一稀释度 ( 低稀释倍数 ) 蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数 ; A 2 第二稀释度 ( 高稀释倍数 ) 蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数 ; B 1 第一稀释度 ( 低稀释倍数 ) 鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数 ; B 2 第二稀释度 ( 高稀释倍数 ) 鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数 ; C 1 第一稀释度 ( 低稀释倍数 ) 用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数 ; C 2 第二稀释度 ( 高稀释倍数 ) 用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数 ; 1.1 计算系数 ( 如果第二稀释度蜡样芽胞杆菌鉴定结果为 0, 计算系数采用 1); d 稀释因子 ( 第一稀释度 ) 4.5 结果与报告根据 MYP 平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数, 按 4.4 中公式 (1) 公式 (2) 计算, 报告每 g(ml) 样品中蜡样芽胞杆菌菌数, 以 CFU/g(mL) 表示 ; 如 T 值为 0, 则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告必要时报告蜡样芽胞杆菌生化分型结果 5 蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法 ( 第二法 ) 5.1 检验程序蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法检验程序见图 2 6

9 检样 25 g( 或 25mL) 样品 +225 ml 稀释液, 均质 10 倍系列稀释选取 3 个适宜连续稀释度的样品匀液, 各吸取 1mL, 分别接种于 3 管胰酪胨大豆多黏菌素肉汤 30 ±1 48 h±2 h 接种 MYP 琼脂平板 30 ±1 24 h~48 h 确定鉴定查 MPN 表报告结果图 2 蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法检验程序 5.2 操作步骤样品处理同样品制备同样品的稀释同样品接种 7

10 取 3 个适宜连续稀释度的样品匀液 ( 液体样品可包括原液 ), 接种于 10 ml 胰酪胨大豆多黏菌素肉汤中, 每一稀释度接种 3 管, 每管接种 1 ml( 如果接种量需要超过 1 ml, 则用双料胰酪胨大豆多黏菌素肉汤 ) 于 30 ±1 培养 48 h±2 h 培养用接种环从各管中分别移取 1 环, 划线接种到 MYP 琼脂平板上,30 ±1 培养 24 h±2 h 如果菌落不典型, 可继续培养 24 h±2 h 再观察确定鉴定从每个平板选取 5 个典型菌落 ( 小于 5 个全选 ), 划线接种于营养琼脂平板做纯培养,30 ±1 培养 24 h±2 h, 进行确证实验, 见结果与报告根据证实为蜡样芽胞杆菌阳性的试管管数, 查 MPN 检索表 ( 见附录 B), 报告每 g(ml) 样品中蜡样芽胞杆菌的最可能数, 以 MPN/g(mL) 表示 8

11 附录 A 培养基和试剂 A.1 磷酸盐缓冲液 (PBS) A.1.1 成分磷酸二氢钾 34.0 g ml A.1.2 制法贮存液 : 称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500 ml 中, 用大约 175 ml 的 1mol/L 氢氧化钠溶液调节 ph 至 7.2, 用稀释至 1000 ml 后贮存于冰箱稀释液 : 取贮存液 1.25 ml, 用稀释至 ml, 分装于适宜容器中,121 高压灭菌 15 min A.2 甘露醇卵黄多黏菌素 (MYP) 琼脂 A.2.1 成分蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 1.0 g D- 甘露醇 10.0 g 氯化钠 10.0 g 琼脂粉 12.0~1 0.2 % 酚红溶液 13.0 ml 50 % 卵黄液 50.0 ml 多黏菌素 B 100,000 IU ml A.2.2 制法将 A.2.1 前五种成分加入于 950 ml 中, 加热溶解, 校正 ph 至 7.3±0.1, 加入酚红溶液分装, 每瓶 95 ml,121 高压灭菌 15 min 临用时加热溶化琼脂, 冷却至 50, 每瓶加入 50% 卵黄液 5 ml 和浓度为 IU 的多黏菌素 B 溶液 1 ml, 混匀后倾注平板 A % 卵黄液取鲜鸡蛋, 用硬刷将蛋壳彻底洗净, 沥干, 于 70% 酒精溶液中浸泡 30 min 用无菌操作取出卵黄, 加入等量灭菌生理盐水, 混匀后备用 A 多黏菌素 B 溶液在 50 ml 灭菌中溶解 IU 的无菌硫酸盐多黏菌素 B A.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉汤 9

12 A.3.1 成分胰酪胨 ( 或酪蛋白胨 ) 17.0g 植物蛋白胨 ( 或大豆蛋白胨 ) 3.0 g 氯化钠无水磷酸氢二钾 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 多黏菌素 B 100 IU/mL A.3.2 制法将 A.3.1 前五种成分加入于中, 加热溶解, 校正 ph 至 7.3±0.2,121 高压灭菌 15 min 临用时加入多黏菌素 B 溶液混匀即可多黏菌素 B 溶液制法同附录 A A.4 营养琼脂 A.4.1 成分蛋白胨牛肉膏氯化钠琼脂粉 10.0 g 12.0~1 A.4.2 制法备用将 A.4.1 所述成分溶解于内, 校正 ph 至 7.2±0.2, 加热使琼脂溶化 121 高压灭菌 15 min, A.5 过氧化氢溶液 A.5.1 试剂 3% 过氧化氢溶液 : 临用时配制, 用 H 2 O 2 配制 A.5.2 试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落, 置于洁净试管内, 滴加 3% 过氧化氢溶液 2 ml, 观察结果 A.5.3 结果于 30s 内发生气泡者为阳性, 不发生气泡者为阴性 A.6 动力培养基 A.6.1 成分胰酪胨 ( 或酪蛋白胨 ) 10.0 g 10

13 酵母粉葡萄糖无水磷酸氢二钠琼脂粉 2.5 g 2.5 g 3.0 ~5.0g A.6.2 制法将 A.6.1 所述成分于, 校正 ph 至 7.2±0.2, 加热溶解分装每管 2 ml~3 ml 115 高压灭菌 20 min, 备用 A.6.3 试验方法用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中,30 ±1 培养 48 h±2 h 蜡样芽胞杆菌应沿穿刺线呈扩散生长, 而蕈状芽胞杆菌常常呈绒毛状生长, 形成蜂巢状扩散动力试验也可用悬滴法检查蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌通常运动极为活泼, 而炭疽杆菌则不运动 A.7 硝酸盐肉汤 A.7.1 成分蛋白胨硝酸钾 0.2 g A.7.2 制法将 A.7.1 所述成分溶解于校正 ph 至 7.4, 分装每管 5 ml,121 高压灭菌 15 min A.7.3 硝酸盐还原试剂甲液 : 将对氨基苯磺酸 0.8 g 溶解于 2.5 mol/l 乙酸溶液 100 ml 中乙液 : 将甲萘胺 0.5 g 溶解于 2.5 mol/l 乙酸溶液 100 ml 中 A.7.4 试验方法接种后在 36 ±1 培养 24 h~72 h 加甲液和乙液各 1 滴, 观察结果, 阳性反应立即或数分钟内显红色如为阴性, 可再加入锌粉少许, 如出现红色, 表示硝酸盐未被还原, 为阴性反之, 则表示硝酸盐已被还原, 为阳性 A.8 酪蛋白琼脂 A.8.1 成分酪蛋白牛肉粉无水磷酸氢二钠氯化钠琼脂粉 10.0 g 3.0 g 2.0 g 12.0~1 11

14 0.4 % 溴麝香草酚蓝溶液 12.5 ml A.8.2 制法除溴麝香草酚蓝溶液外, 将 A.8.1 所述各成分溶于中加热溶解 ( 酪蛋白不会溶解 ) 校正 ph 至 7.4±0.2, 加入溴麝香草酚蓝溶液,121 高压灭菌 15 min 后倾注平板 A.8.3 试验方法用接种环挑取可疑菌落, 点种于酪蛋白琼脂培养基上,36 ±1 培养 48 h±2 h, 阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区 ( 表示产生酪蛋白酶 ) 阴性反应时应继续培养 72 h 再观察 A.9 硫酸锰营养琼脂培养基 A.9.1 成分胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏磷酸氢二钾 4.0 g 3.08% 硫酸锰 (MnSO 4 H 2 O) 1.0 ml 琼脂粉 12.0~1 A.9.2 制法将 A.9.1 所述成分溶解于校正 ph 至 7.2± 高压灭菌 15 min, 备用 A % 碱性复红 A.10.1 成分碱性复红乙醇 0.5 g 20.0 ml 80.0 ml A.10.2 制法取碱性复红 0.5 g 溶解于 20 ml 乙醇中, 再用稀释至 100 ml, 滤纸过滤后储存备用 A.11 动力培养基 A.11.1 成分蛋白胨牛肉浸粉琼脂 10.0 g 3.0 g 4.0 g 12

15 氯化钠 A.11.2 制法用将 A.11.1 所述成分溶解于校正 ph 至 7.2±0.2, 分装小试管,121 高压灭菌 15 min, 备 A.12 糖发酵管 A.12.1 成分牛肉粉蛋白胨 10.0 g 氯化钠 3.0 g 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 12H 2 O) 2.0 g 0.2 % 溴麝香草酚蓝溶液 12.0 ml A.12.2 制法 A 糖发酵管按 A.12.1 所述成分配好后, 校正 ph 至 7.2±0.2, 按 0.5 % 加入葡萄糖, 分装于一个有倒置小管的小试管内,115 高压灭菌 15 min A 其他各种糖发酵管可按 A.12.1 所述成分配好后, 分装每瓶 100 ml,115 高压灭菌 15 min 另将各种糖类分别配好 10 % 溶液, 同时 115 高压灭菌 15 min 将 5 ml 糖溶液加入于 100 ml 培养基内, 以无菌操作分装小试管注 : 蔗糖不纯, 加热后会自行水解者, 应采用过滤法除菌 A.12.3 试验方法挑取可疑菌落接种于葡萄糖发酵管中, 厌氧条件下 36 ±1 培养 24 h±2 h 培养基由红色变为黄色者表明该菌在厌氧条件下能发酵葡萄糖 A.13 V-P 培养基 A.13.1 成分磷酸氢二钾蛋白胨葡萄糖氯化钠 7.0 g A.13.2 制法备用将 A.13.1 所述成分溶解于校正 ph 至 7.0±0.2, 分装每管 1 ml 115 高压灭菌 20 min, A.13.3 试验方法 13

16 用营养琼脂培养物接种于本培养基中,36 ±1 培养 48 h~72 h 加入 6 %α- 萘酚 - 乙醇溶液 0.5 ml 和 40 % 氢氧化钾溶液 0.2 ml, 充分振摇试管, 观察结果, 阳性反应立即或于数分钟内出现红色如为阴性, 应放在 36 ±1 培养 4 h 再观察 A.14 胰酪胨大豆羊血 (TSSB) 琼脂 A.14.1 成分胰酪胨 ( 或酪蛋白胨 ) 植物蛋白胨 ( 或大豆蛋白胨 ) 氯化钠无水磷酸氢二钾葡萄糖琼脂粉 g 2.5 g 12.0~1 A.14.2 制法将 A.14.1 所述各成分于中加热溶解校正 ph 至 7.2±0.2, 分装每瓶 100 ml 121 高压灭菌 15 min 水浴中冷却至 45 ~50, 毎 100 ml 加入 5~10 ml 无菌脱纤维羊血, 混匀后倾注平板 A.15 溶菌酶营养肉汤 A.15.1 成分牛肉粉 3.0 g 蛋白胨 ml 0.1% 溶菌酶溶液 10.0 ml A.15.2 制法除溶菌酶溶液外, 将 A.15.1 所述成分溶解于校正 ph 至 6.8±0.1, 分装每瓶 99 ml 121 高压灭菌 15 min 每瓶加入 0.1 % 溶菌酶溶液 1 ml, 混匀后分装灭菌试管, 每管 2.5 ml 0.1% 溶菌酶溶液配制 : 在 65 ml 灭菌的 0.1 mol/l 盐酸中加入 0.1 g 溶菌酶, 隔水煮沸 20 min 溶解后, 再用灭菌的 0.1 mol/l 盐酸稀释至 100 ml 或者称取 0.1 g 溶菌酶溶于 100 ml 的无菌后, 用孔径为 0.45 μm 硝酸纤维膜过滤使用前测试是否无菌 A.15.3 试验方法用接种环取纯菌悬液一环, 接种于溶菌酶肉汤中,36 ±1 培养 24 h 蜡样芽胞杆菌在本培养基 ( 含 % 溶菌酶 ) 中能生长如出现阴性反应, 应继续培养 24 h A.16 西蒙氏柠檬酸盐培养基 A.16.1 成分氯化钠 14

17 硫酸镁 (MgSO 4 7 H 2 O) 0.2 g 磷酸二氢氨 1.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 柠檬酸钠 1.0 g 琼脂粉 12.0~1 0.2 % 溴麝香草酚蓝溶液 40.0 ml A.16.2 制法除溴麝香草酚蓝溶液和琼脂外, 将 A.16.1 所述各成分溶解于 ml 内, 校正 ph 至 6.8, 再加琼脂, 加热溶化然后加入溴麝香草酚蓝溶液, 混合均匀后分装试管,121 高压灭菌 15 min 制成斜面 A.16.3 试验方法挑取少量琼脂培养物接种于西蒙氏柠檬酸培养基,36 ±1 培养 4d 每天观察结果, 阳性者斜面上有菌落生长, 培养基从绿色转为蓝色 A.17 明胶培养基 A.17.1 成分蛋白胨牛肉粉明胶 3.0 g g A.17.2 制法将 A.17.1 所述成分混合, 置流动蒸汽灭菌器内, 加热溶解, 校正 ph 至 7.4~7.6, 过滤分装试管, 121 高压灭菌 10 min, 备用 A.17.3 试验方法挑取可疑菌落接种于明胶培养基,36 ±1 培养 24 h±2 h, 取出,2 ~8 放置 30 min, 取出, 观察明胶液化情况 15

18 附录 B 蜡样芽胞杆菌最可能数 (MPN) 检索表每 g(ml) 检样中蜡样芽胞杆菌最可能数 (MPN) 的检索见表 B.1 表 B.1 蜡样芽胞杆菌最可能数 (MPN) 检索表阳性管数 95% 置信区间阳性管数 95% 置信区间 MPN MPN 下限上限下限上限 < , , , , > 注 1: 本表采用 3 个稀释度 [0.1 g(ml) 0.01 g(ml) 和 g(ml)] 每个稀释度接种 3 管注 2: 表内所列检样量如改用 l g(ml) 0.1 g(ml) 和 0.01 g(ml) 时, 表内数字应相应降低 10 倍 ; 如改用 0.01 g(ml) g(ml) g(ml) 时, 则表内数字应相应增高 10 倍, 其余类推 16

前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 增加了第二法蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法 ; 将选择性分离培养基 (MYP) 培养条件由 37 培 12

前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 增加了第二法蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法 ; 将选择性分离培养基 (MYP) 培养条件由 37 培 12 中华人民共和国国家标准 GB 4789.14 xxxx 食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验 ( 征求意见稿 ) xxxx-xx-xx 发布中华人民共和国卫生部 xxxx-xx-xx 实施发布前言本标准代替 GB/T 4789.14-2003 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验本标准与 GB/T 4789.14-2003 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ;

前 言 本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验 本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 增加了第二法蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法 ; 将选择性分离培养基 (MYP) 培养条件由 37 培养 12

前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 增加了第二法蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法 ; 将选择性分离培养基 (MYP) 培养条件由 37 培养 12