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1 ICS 备案号 : SN/T 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 进出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法 Method for detection of bacillus cereus in food for import and export ( 征求意见稿 ) - - 发布 - - 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

2 前言本标准的修改参照了国际分析家学会 (AOAC INTERNATIONNAL)AOAC 98.,98.6; 国际标准化组织 (ISO)ISO 79:4 食品和动物饲料的微生物学蜡样芽孢杆菌计数的水平方法 -- 时菌落计数技术 (Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus Colony-count technique at C); ISO 87:6 食品和动物饲料的微生物学少量推定的蜡样芽孢杆菌测定的水平方法 -- 最大可能数技术的检测方法 (Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the determination of low numbers of presumptive Bacillus cereus Most probable number technique and detection method) 本标准与 SN 76-9 相比主要变化如下 : 将样品制备时取样量 5g( 或 5mL) 修改为 5g( 或 5mL); 对平板菌落计数的计算公式进行了修改 ; 生化试验的培养温度由 6 ± 代替 5 ; 增加 API 5CHB 诊断试剂条及全自动细菌生化鉴定仪 VITEK 本标准的附录 A 附录 B 为规范性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位 : 黑龙江出入境检验检疫局本标准主要起草人 : 张泓刘新亮庞钧予李铁柱高勇本标准所代替标准的历次版本发布情况为 : SN 76-9 II

3 进出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法. 范围本标准规定了进出口食品中蜡样芽孢杆菌的检验方法本标准适用于各类食品和食物样品中蜡样芽孢杆菌的检验. 定义术语和缩略语蜡样芽孢杆菌依照本标准在选择性培养基表面, 形成典型或非典型菌落, 在特定条件下发生相应反应的微生物. 设备和材料. 烘干箱 :8. 培养箱 : ± 和 6 ±. 厌氧培养箱 :6 ±.4 水浴锅 :46 ±.5 接种环.6 PH 计 :5 测量, 精度 ±.ph 单位.7 试管.8 旋转混合器.9 培养皿 : 直径 9mm 或 mm 或者是 4mm. 吸量管 : 容量. ml 和. ml, 具.5 和. ml 刻度. 显微镜. 载玻片. 滤纸.4 微量移液器 : 容量. ml 和. ml, 具. ml 刻度.5 均质器 : 拍击式或蠕动式.6 涂布棒.7 量筒.8 高压蒸汽灭菌器.9 API 5 CHB 或 VITEK 全自动微生物鉴定系统 4. 培养基和试剂 4. 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂 (MYP): 见第 A. 章 4. 胰蛋白胨大豆多粘菌素肉汤 (TSPB): 见第 A. 章 4. 胰蛋白胨大豆羊血琼脂平板 (TSSB): 见第 A. 章 4.4 酚红葡萄糖肉汤 : 见第 A.4 章 ) API 5 CHB 和 VITEK 全自动微生物鉴定系统由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名给出这一信息是为了方便本标准的使用者, 并不表示对该产品的认可如果其他等效产品具有相同的效果, 则可使用这些等效的产品

4 4.5 硝酸盐肉汤 : 见第 A.5 章 4.6 营养琼脂 : 见第 A.6 章 4.7 L- 酪氨酸营养琼脂 : 见第 A.7 章 4.8 溶菌酶营养肉汤 : 见第 A8 章 4.9 改良 V-P 培养基 : 见第 A9 章 4. 磷酸盐缓冲液 : 见第 A. 章 4. 碱性复红液 : 见第 A 章 4..85% 生理盐水 : 见第 A. 章 4. 亚硝酸盐试剂 : 见第 A. 章 4.4 V P 试剂 : 见第 A.4 章 4.5 甲醇 4.6 二甲苯 4.7 香柏油第一法蜡样芽孢杆菌平板计数法 5. 检验程序蜡样芽孢杆菌平板计数法的检验程序见图

5 溶血试验溶菌酶试葡萄糖发酵试酸盐还原试验 /T 5g(mL) 样品 +5mL 稀释液, 均质倍系列稀释每皿中加入 5-mL MYP 琼脂, 取适当稀释倍数的.mL 样品匀液, 加入培养皿, 涂布选取 ~5 个典型菌落验硝改良 V P L- 酪氨酸分验蛋白色毒素结晶试验染试解验试验计算和报告图蜡样芽孢杆菌平板计数法的检验程序 6. 操作步骤 6. 样品的稀释 6.. 固体和半固体样品 : 称取 5g 样品置于盛有 5mL 磷酸盐缓冲液或.85% 的生理盐水的无菌均质杯中,8~ r/min 均质 min~ min, 或放入盛有 5mL 稀释液的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打 min~min, 制成 l : 样品匀液 6.. 液体样品 : 以无菌吸管吸取 5mL 样品置于盛有 5mL 磷酸盐缓冲液或.85% 的生理盐水的无菌稀释瓶 ( 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ) 中充分混匀, 制成 l : 样品匀液 6.. 用 ml 的无菌吸管或微量移液器吸取 l : 样品匀液 ml, 加到盛有 9 ml 磷酸盐缓冲液或.85% 的生理盐水的试管中, 充分混匀, 制成 : 的样品匀液 6..4 按 6.. 操作程序, 制备倍系列稀释样品匀液, 直至适宜稀释倍数

6 6. 样品的接种根据对样品污染状况的估计, 选择个 ~ 个适宜稀释度的样品匀液 ( 液体样品可包括原液 ), 在进行倍递增稀释时, 每个稀释度分别吸取.mL 样品匀液加入 MYP 琼脂平板, 然后用无菌 L 棒均匀涂布于整个平板, 注意不要触及平板边缘, 每稀释度接种两个 MYP 琼脂平板 6. 培养 6.. 在通常情况下, 涂布之后将平皿静置 min, 待样品匀液吸收后翻转平板, ± 培养 4h 如果培养物的菌落特征不显著, 则可继续培养 4h 6.. 蜡样芽孢杆菌在 MYP 琼脂平板上生长的典型菌落为直径 mm ~5 mm, 菌落表面粗糙, 在深红色背景下呈现粉红色或微粉红色, 环绕产生 5 mm 宽的卵磷脂酶沉淀环没有根状生长的特性 ( 唯独蕈状芽孢杆菌形成根状生长的特征 ) 6.4 菌落计数选取菌落数在 5~5 CFU 的典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板, 进行计数注 : 如果有很多发酵甘露醇的细菌, 会影响到典型菌落, 使之减少或消失少量的蜡样芽孢杆菌无卵磷脂酶沉淀环, 这些菌同样需要证实试验 6.5 营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑取 5 个典型菌落, 如无典型菌落则挑取可疑菌落用接种针接触菌落中心部位, 分别接种于营养琼脂斜面或平板, ± 培养 4h, 取培养物进行革兰氏染色和证实试验 6.6 证实试验 6.6. 葡萄糖发酵试验 : 将培养物接种到酚红葡萄糖肉汤中, 置于厌氧培养箱中 6 ±, 培养 4h, 振摇后肉汤由红变黄, 表明在厌氧条件下蜡样芽孢杆菌分解葡萄糖产酸 6.6. 硝酸盐肉汤还原实验 : 将培养物接种到硝酸盐肉汤中,6 ± 培养 4h, 加.5mL 亚硝酸盐试剂 A 和.5mL 亚硝酸盐试剂 B, 在 min 内变为红色为阳性反应 6.6. 改良 V-P 试验 : 将培养物接种到改良 v-p 培养基中,6 ± 培养 4h, 取 ml 培养物置于灭菌空试管中加入.mL 4% KOH 溶液和.6mL 5%α- 萘酚乙醇溶液和少量结晶肌酸静置 h 出现伊红粉红色为阳性 L- 酪氨酸分解试验 : 将培养物接种到 L- 酪氨酸琼脂培养基上,6 ± 培养 48h, 培养基在靠近菌落生长的地方为透明的, 则表明酪氨酸被分解, 阴性则继续培养 7h, 仍为阴性的弃去溶菌酶试验 : 将培养物接种到含有.% 溶菌酶的营养肉汤中, 另取培养物接种到普通营养肉汤中作对照,6 ± 培养 4h, 蜡样芽孢杆菌在本培养基中能生长, 为阳性反应如出现阴性反应继续培养 4h, 仍为阴性弃去符合 MYP 琼脂上的典型菌落形态, 镜检为革兰氏染色阳性大杆菌, 呈链状, 芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端, 并且在厌氧条件下发酵葡萄糖产酸, 还原硝酸盐为亚硝酸盐, 改良 v-p 试验阳性, 分解 L- 酪氨酸, 能在.% 溶菌酶中生长的可暂认定为蜡样芽孢杆菌菌群蜡样芽孢杆菌与类似菌的鉴别试验动力试验 : 用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中, 培养 4h 有动力的蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长, 而蕈状芽孢杆菌常呈绒毛状生长也可用悬滴法检查溶血试验 : 将疑似菌点种在绵羊血琼脂表面, 培养 4h 蜡样芽孢杆菌会观察到强烈的 β- 溶血反应苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象, 而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血蛋白毒素结晶试验 : 取经培养 4h 并于室温放置 ~ 天的营养琼脂培养物少许于载玻片上, 用灭菌蒸馏水做显微涂片待干燥后将涂片慢慢通过火焰, 短暂加热固定待冷却后, 用甲醇盖满涂片,s 后弃去甲醇, 通过火焰使其充分干燥, 再将涂片盖满.5% 碱性复红水溶液或石碳酸复红 ZN 染色液用微火轻轻从底部加热玻片至产生蒸气为止过 ~min, 再重复这个步骤静置 s, 弃去染液用蒸馏水充分冲洗玻片, 待其自然干燥在显微镜油镜下观察是否有游离的芽孢和毒素结晶体 4

7 如果未见游离芽孢, 可将培养物在室温下多放置几天后再进行试验苏云金芽孢杆菌产生四角晶形 ( 菱型 ) 的暗色蛋白毒素结晶, 蜡样芽孢杆菌不产生毒素结晶体符合蜡样芽孢菌群特征的, 呈现强烈溶血, 不产生蛋白毒素结晶的培养物, 可确定为蜡样芽孢杆菌 6.7 如选择 API 5 CHB 生化鉴定试剂盒或 VITEK 全自动微生物鉴定系统, 可按照 6.5 从营养琼脂斜面或平板上挑取培养物, 用生理盐水制备成浊度适当 ( 根据仪器要求 ) 的菌悬液, 使用 API 5 CHB 生化鉴定试剂盒或 VITEK 全自动微生物鉴定系统进行鉴定 7. 结果计算根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数 (b), 比上进行证实实验的菌落数 (A), 乘以平板上的菌落数 (C), 得出的是平板上的有效菌落数 (a) 公式: 蜡样芽孢杆菌的菌数 (N) 可表示为 : N = Σa/(V. d) a = b/a C 式中 : N 样品中蜡样芽孢杆菌菌落数 Σa 连续两个稀释度的有效菌落数的和 V 加样量 (.ml 或 ml) d 连续两个稀释度中较低的那个稀释倍数例 : 将检样 -5-6 连续两个梯度稀释液. ml 涂布于 MYP 琼脂平板上, 生成的可疑菌落数分别为 7 48 和 7 个, 各取 5 个进行鉴定, 证实为蜡样芽孢杆菌的分别为 4 和 4 4 个, 则 g 样品中蜡样芽孢杆菌数为 : (/ / / /5 )/(.. -5 )=/(. -6 )= 蜡样芽孢杆菌平板计数的报告根据 MYP 琼脂平板上蜡样芽孢杆菌的典型菌落数, 按第 7 章中公式计算, 报告每克 ( 或毫升 ) 样品中蜡样芽孢杆菌数, 以 CFU/g( 或 CFU/mL) 表示 ; 如果最低稀释倍数的两个培养皿均没有菌生长, 则结果可以表述为每克 ( 或每毫升 ) 样品中蜡样芽孢杆菌数小于乘以最低稀释倍数 ( 如果是液态样品的原液, 则结果可以表述为每毫升样品中蜡样芽孢杆菌数小于 ) 第二法蜡样芽孢杆菌 MPN 计数 9 检验程序蜡样芽孢杆菌 MPN 计数法检验程序见图 5

8 蛋白毒素结晶试验溶血试溶菌酶试验硝酸盐还原试验染色萄糖发酵试验 /T 5g(ml) 样品 +5ml 稀释液, 均质倍系列稀释选择适宜三个连续稀释度的样品匀液, 接种 TSPB 肉汤 48h MYP 琼脂平板上划线, 4h 选取 ~5 个典型菌落验葡改良 V P 试验 L- 酪氨酸分解试验计算和报告 ( 查 MPN 表 ) 图蜡样芽孢杆菌 MPN 计数检验程序操作步骤. 样品的稀释按 6. 进行. 样品的接种和培养每个样品选择三个适宜的连续稀释度的样品匀液 ( 液体样品可选择原液 ), 每个稀释度接种管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤 (TSPB), 每管接种 ml ( 如接种量超过 ml, 则用双料 TSPB, 每管接种毫升 ) ± 培养 48h 6

9 . 分离从出现浑浊的试管取培养物划线接种到 MYP 琼脂上, ± 培养 4h 如果培养物特征不显著, 可延长培养 4h 蜡样芽孢杆菌在 MYP 琼脂平板上典型的菌落为表面粗糙, 在深红色背景下呈现粉红色或微粉红色, 环绕产生 5 mm 宽的卵磷脂酶沉淀环, 没有根状生长的特性.4 营养琼脂斜面或平板培养从每个 MYP 琼脂平板上挑取 5 个典型菌落, 如无典型菌落则挑取可疑菌落用接种针接触菌落中心部位, 分别接种于营养琼脂斜面或平板, ± 培养 4h, 取培养物进行革兰氏染色和证实试验.5 证实试验按 6.6 进行蜡样芽孢杆菌 MPN 计数结果报告根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数, 只要有个菌落鉴定为蜡样芽孢杆菌, 其所代表的 TSPB 管即为蜡样芽孢杆菌阳性依据 TSPB 阳性管数查 MPN 表 ( 见附录 B), 报告每克 ( 或毫升 ) 样品中蜡样芽孢杆菌 MPN 值 7

10 附录 A ( 规范性附录 ) 培养基和试剂 A. 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养甚 (MYP) A.. 成分牛肉膏.g 蛋白陈.g D- 甘露醇.g 氯化钠.g 琼脂 5.g 酚红.5g( 配成溶液加入 ) 蒸馏水稀释至 9 ml 5% 卵黄液 5 ml 多粘菌素 B liu/ml A.. 制法将前 5 种成分加入蒸馏水中加热溶解, 校正 ph 至 7. 士., 加入酚红溶液, 混匀后分装烧瓶中, 每瓶 5mL 高压灭菌 5min 用时加热溶化, 冷至 47 后每瓶加入 5% 卵黄液.5mL 和.5mL 多粘菌素 B 溶液, 混匀后倾注灭菌平皿, 每皿 5~8 ml 平板通常放置干燥处, 在 ± 下可保存 4 天在用之前, 平皿应倒置在干燥的通风橱或培养箱中 5-5, 直至琼脂表面干燥 5% 卵黄液 : 取鲜鸡蛋, 用硬刷将蛋壳彻底洗净, 沥干, 放于 7% 酒精溶液中浸泡 s 晾干以无菌操作取出卵黄, 加入等量灭菌生理盐水, 混匀后备用多粘菌素 B 溶液 : 在 5mL 灭菌蒸馏水中溶解 5 国际单位的无菌硫酸盐多粘菌素 B A. 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤 (TSPB) A.. 成分胰酪胨 7.g 植物胨.g 氯化钠 5.g 磷酸氢二钾.5g 葡萄糖.5g 蒸馏水稀释至 lml 5% 卵黄液 5 ml 多粘菌素 B liu/ml A.. 制法将上述各成分溶解在蒸馏水中, 煮沸 min, 校正 ph 至 7. 士., 分装大试管, 每管 5 ml, 高压灭菌 5min 临用时每管加入.5% 多粘菌素 B 溶液.mL 混匀即可多粘菌素 B 溶液 : 在.mL 灭菌蒸馏水中溶解 5 国际单位无菌硫酸盐多粘菌素 B A. 胰酪陈大豆羊血琼脂 (TSSB) A.. 成分胰酩胨 5.g 植物胨 5.g 氯化钠 5.g 8

11 琼脂 5.g 蒸馏水稀释至 ImL A.. 制法将上述各成分于蒸馏水中加热溶解校正 ph7. 士. 分装烧瓶, 每瓶 ml 高压灭菌 5min 浴中冷至 45~5 加入 5mL 无菌脱纤维羊血, 混匀后倾注平板, 每皿 8~mL A.4 酚红葡萄糖肉汤 A.4. 成分朊胨.g 牛肉膏.g 氯化钠 5.g 葡萄糖 5.g 酚红.8g( 配成溶液加入 ) 蒸馏水稀释至 ml A.4. 制法将除酚红以外的成分溶解至蒸馏水中, 校正 ph 7.4 士., 然后加入酚红, 混匀分装至试管, 每管 ml, 高压灭菌 min A.5 硝酸盐肉汤 A.5. 成分牛肉膏.g 蛋白胨 5.g 硝酸钾.g 蒸馏水稀释至 lml A.5. 制法将上述所有成分溶解至蒸馏水中, 校正 ph 7. 士., 校正后混匀分装至试管, 每管 5mL, 高压灭菌 5min A.6 营养琼脂 A.8. 成分牛肉膏.g 蛋白陈 5.g 琼脂 5.g 蒸馏水稀释至 OmL A.6. 制法将各成分于蒸馏水中加热溶解校正 ph7. 士. 后分装试管, 每管 5~7mL; 或分装烧瓶, 每瓶 ~5mL 高压灭菌 5min 将试管取出, 制成斜面 ; 如制平板, 可将灭菌的琼脂冷至 45~ 5 倾注灭菌平皿, 每皿 8~mL A.7 L- 酩氨酸营养琼脂 A.7. 成分营养琼脂 ml 5% 灭菌 L- 酪氨酸悬液 ml A.7. 制法 9

12 将 ml 营养琼脂溶化, 冷至 45, 加入 5% 的灭菌 L- 酪氨酸悬液 ml, 充分混匀后, 制成平板, 每皿 8~mL 平皿应迅速冷却, 防止 L- 酪氨酸分离而出 L- 酩氨酸悬液 : 将.5g 酪氨酸加 ml 蒸馏水混匀, 高压灭菌 5min A.8 溶菌酶营养肉汤 A.8. 成分牛肉膏.g 蛋白陈 5.g 蒸馏水稀释至 OmL.% 溶菌酶溶液.mL A.8. 制法将上述成分 ( 溶菌酶溶液除外 ) 溶解于蒸馏水并稀释至 ml 校正 ph 6.8 士. 后, 分装于烧瓶中, 每瓶 99mL 高压灭菌 5min 于每瓶中加入.% 溶菌酶溶液 ml, 混匀后分装灭菌试管, 每管.5mL 溶菌酶溶液, 在 65mL 灭菌的.mol/L 盐酸中加.g 溶菌酶煮沸 min 溶解后, 再用灭菌的.mol/L 盐酸稀释至 ml. A.9 改良 V-P 培养基 A.9. 成分蛋白胨 7.g 葡萄糖 5.g 氯化钠 5.g A.9. 制法将上述各成分溶解于蒸馏水并稀释至 ml 校正 ph6.5 士. 后分装试管, 每管 5 ml 高压灭菌 min 备用 A. Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液 A.. 制法在 5mL 蒸馏水中溶解磷酸二氢钾 (KH PO 4 )4.g, 用 mol/l 氢氧化钠溶液约 75mL 校正 ph 至 7., 再用蒸馏水稀释至 ml, 制成储存液于冰箱中储存取原液.5 ml, 用蒸馏水稀释至 ml. 分装试管, 每管 9mL, 高压灭菌 5min A. 革兰氏染色液 A.. 结晶紫染色液制法取结晶紫 g 溶解于 ml 95% 乙醇中, 再与 % 草酸铵水溶液 8mL 混合 A.. 碘液制法将 g 碘与 g 碘化钾先进行混合, 加入蒸馏水少许, 充分振摇, 待完全溶解后, 再加蒸馏水至 ml A.. 沙黄复染液将.5g 沙黄溶解于 ml 95% 乙醇中, 再加入 9 ml 蒸馏水稀释 A..4 染色法将涂片在火焰上固定, 滴加结晶紫染色液, 染 min 水洗滴加碘液, 作用 min 水洗滴加 95% 乙醇脱色 s( 或将乙醇涂满整个涂片, 立即倾去, 再用乙醇滴满整个涂片, 脱色 s)

13 A. 碱性复红染色液 A.. 制法取碱性复红.5g 溶解于 ml 乙醇中, 再用蒸馏水稀释至 ml, 滤纸过滤后储存备用 A..85% 盐水 A.. 制法取氯化钠 8.5g 溶解于蒸馏水中稀释至 ml A.4 亚硝酸盐试剂 A.4. 试剂 A: 对氨基苯磺酸 8.g, 溶解于 5mol/L 乙酸 ml 中 A.4. 试剂 B:α- 萘酚.5g 溶解于 5mol/L 乙酸 ml 中 A.5 V-P 试剂 A.5. 5% α- 萘酚溶液 : 取 α- 萘酚 5.g 溶解于 ml 无水乙醇中 A.5. 4% 氢氧化钾溶液, 将氢氧化钾 4g 于蒸馏水中溶解并稀释至 ml A.5. 肌氨酸结晶

14 附录 B ( 规范性附录 ) g 样品中最近似值 (MPN) 检索表三管法采用...g 阳性管数 95% 置信区间阳性管数 95% 置信区间 MPN MPN 注. 注. 注. 下限上限注. 注. 注. 下限上限 < > 4 注 : 本表采用个稀释度. g( 或. ml). g( 或. ml) 和. g( 或. ml), 每个稀释度接种管注 : 表内所列检样量如改用 g( 或 ml). g( 或. ml) 和. g( 或. ml) 时, 表内数字应相应降低倍 ; 如改用. g( 或. ml). g( 或. ml) 和. g( 或. ml) 时, 则表内数字应相应增高倍, 其余类推

前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 增加了第二法蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法 ; 将选择性分离培养基 (MYP) 培养条件由 37 培 12

前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 增加了第二法蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法 ; 将选择性分离培养基 (MYP) 培养条件由 37 培 12 中华人民共和国国家标准 GB 4789.14 xxxx 食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验 ( 征求意见稿 ) xxxx-xx-xx 发布中华人民共和国卫生部 xxxx-xx-xx 实施发布前言本标准代替 GB/T 4789.14-2003 食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验本标准与 GB/T 4789.14-2003 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ;