第一章 流式细胞术结构和原理

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1 和 细 胞 因 子 检 测 试 剂 盒 这 里 所 使 用 的 检 测 仪 器 就 是 传 统 的 流 式 细 胞 仪, 为 了 使 上 样 更 为 方 便,BD 公 司 开 发 了 与 流 式 细 胞 仪 配 套 的 自 动 上 样 系 统, 可 以 更 方 便 的 从 微 孔 板 中 自 动 连 续 上 样 从 传 统 意 义 上 讲, 流 式 细 胞 术 通 过 检 测 细 胞 表 面 或 细 胞 内 抗 原, 对 细 胞 进 行 计 数 分 型 或 分 选 流 式 细 胞 仪 (FCM) 仅 能 对 类 似 细 胞 大 小 的 颗 粒 物 和 荧 光 颜 色 进 行 分 析, 而 对 其 他 物 质 ( 如 液 相 蛋 白 等 ) 无 能 为 力 而 近 年 发 展 起 来 的 CBA 则 是 一 种 将 待 测 物 结 合 于 类 似 细 胞 大 小 的 颗 粒 上, 并 利 用 FCM 进 行 蛋 白 定 量 的 液 相 蛋 白 检 测 技 术 1 CBA 的 作 用 原 理 图 CBA 反 应 微 球 探 针 复 合 体 结 构 模 式 图 CBA 由 具 有 不 同 荧 光 强 度 包 被 了 特 异 性 捕 获 单 抗 (Capture Antibody) 的 多 个 捕 获 微 球 (Capture Bead) 群 组 成 CBA 的 每 一 微 球 提 供 一 个 针 对 某 一 特 定 蛋 白 的 捕 获 表 面, 就 如 同 ELISA 板 的 各 个 包 被 孔 加 入 待 测 样 本 后, 微 球 上 的 捕 获 抗 体 就 与 相 应 的 液 相 蛋 白 结 合, 再 加 入 荧 光 标 记 的 检 测 单 抗 (Detection Antibody), 形 成 三 明 治 夹 心 复 合 物 ( 见 图 2-9-3), 在 流 式 细 胞 仪 FL2 通 道 检 测 荧 光 信 号 就 能 定 量 可 溶 性 被 检 物 可 同 时 检 测 多 种 液 相 蛋 白 物 质 ( 见 图 2-9-4) Various Antibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensities Antibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc. 图 CBA 技 术 反 应 原 理 图 2 CBA 技 术 与 传 统 的 ELISA 相 比 有 下 列 优 点 : (1)CBA 所 需 样 本 体 积 仅 为 ELISA 分 析 所 必 需 样 本 量 的 1/6;(2)CBA 的 灵 敏 度 达 到 2-7pg/ml, 而 ELISA 通 常 为 pg/ml;(3)CBA 一 致 性 和 稳 定 性 更 好, 符 合 细 胞 因 子 检 测 的 国 际 标 准 ( 经 美 国 NIBSC 的 gold 标 准 测 试 );(4) 对 标 准 品 混 合 物 做 一 次 流 式 检 测, 就 可 得 到 样 本 中 各 种 被 分 析 物 相 应 的 标 准 曲 线 ;(5) 能 避 免 由 于 酶 联 放 大 技 术 使 信 号 失 61

2 真 导 致 的 假 象 ;(6)CBA 实 验 时 间 比 单 次 ELISA 大 大 缩 短, 而 且 能 提 供 需 要 做 6 次 ELISA 才 能 得 到 结 果 3 CBA 的 技 术 的 操 作 (. 以 BD-Pharmingen 公 司 的 Th1/Th2 为 例 ):Th1/Th2 CBA Kit 包 含 了 具 有 不 同 荧 光 强 度 的 6 个 微 球 群, 分 别 包 被 了 针 对 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α, IFN-γ 的 特 异 性 捕 获 抗 体 上 述 的 捕 获 微 球 和 PE 标 记 的 检 测 抗 体 混 合 后, 与 重 组 标 准 品 或 待 测 样 本 孵 育 形 成 三 明 治 复 合 物 用 FCM 采 集 样 本 数 据 后,BD CBA 分 析 软 件 就 以 图 表 的 形 式 产 生 分 析 结 果 ( 见 图 和 表 2-9-1) 图 TH1/TH2 细 胞 因 子 CBA 检 测 结 果 由 于 人 TH1/TH2 细 胞 因 子 CBA 中 的 各 种 抗 体 经 过 优 化 及 严 格 测 试, 因 此 与 传 统 的 ELISA 技 术 相 比, 无 论 是 灵 敏 度 恢 复 度 稀 释 线 性 度, 还 是 特 异 性 和 准 确 性 都 有 了 很 大 的 提 高 CBA 检 测 的 灵 敏 度 如 下 表 表 细 胞 因 子 的 平 均 荧 光 强 度 标 准 差 和 灵 敏 度 分 析 此 外 用 人 TH1/TH2 细 胞 因 子 CBA 每 次 仅 对 一 个 重 组 细 胞 因 子 蛋 白 做 分 析, 结 果 在 其 他 捕 获 微 球 群 未 发 现 交 叉 反 应 和 背 景 这 表 明 CBA 检 测 具 有 极 好 的 特 异 性 第 10 节 流 式 细 胞 术 在 其 他 相 关 指 标 中 的 应 用 62

3 一 RNA 含 量 样 品 的 制 备 方 法 派 若 宁 Y(Pyronin Y,PY) 荧 光 染 色 法 :PY 是 一 种 硷 性 的 荧 光 染 料, 它 可 与 细 胞 浆 核 仁 中 的 RNA 进 行 特 异 性 结 合 RNA 的 多 核 苷 酸 链 多 为 单 链 结 构, 而 呈 现 出 红 色 荧 光 是 流 式 细 胞 术 进 行 单 参 数 定 量 RNA 的 一 种 极 好 的 荧 光 染 料, 激 发 波 长 与 488nm 相 匹 配, 它 发 射 的 波 长 为 580nm 然 而 PY 也 可 以 与 解 链 的 DNA 单 链 结 合 因 此, 在 用 PY 荧 光 染 色 RNA 时, 要 避 免 DNA 解 链 效 应 的 干 扰 1 试 剂 配 制 : 1 PY 试 剂 的 配 制 :PY 1.0g, 以 100ml 蒸 馏 水 溶 解, 配 成 母 液, 置 4 冰 箱 保 存 PY 工 作 液 : 取 1ml PY 母 液, 加 入 1nol/L ph4.7 的 醋 酸 缓 冲 液 100ml, 稀 释 为 0.01% 的 浓 度 mol/l ph4.7 醋 酸 缓 冲 液 的 配 制 : 冰 醋 酸 11.55ml 加 蒸 馏 水 至 1000ml; 无 水 醋 酸 钠 16.4g 加 蒸 馏 水 至 1000ml; 分 别 取 上 述 两 种 液 体 255ml 和 245ml, 再 加 入 200ml 蒸 馏 水 即 成 3 配 制 ph7.2 的 磷 酸 缓 冲 液 ; 4 DNA 酶 消 化 液 的 制 备 :DNA 酶 0.05mg/ml,0.25mol/L 枸 橼 酸,2.5mmol/L Tris-HCl, 调 ph 为 染 色 程 序 :1 制 备 单 细 胞 悬 液, 浓 度 为 /ml;2 加 入 DNA 酶 液 0.5ml,37, 消 化 20 min, 弃 去 DNA 酶 ;3 加 入 0.01% 的 PY 工 作 液 1.0ml, 室 温 下 染 色 30 min, 离 心 沉 淀 (800prm,5min);4 去 染 色 液, 以 PBS 液 洗 3 次,, 再 加 入 1.0 ml PBS, 上 机 检 测 3 检 测 分 析 : 用 Cellquest 软 件 程 序 获 取 个 细 胞, 用 ModiFit LT 软 件 分 析 细 胞 RNA 含 量 RNA 含 量 用 RNA 指 数 (RNA Index,RI) 表 示 在 RNA 直 方 图 上,RI=( 被 检 测 细 胞 峰 荧 光 道 数 / 正 常 细 胞 峰 荧 光 道 数 ) 10, 所 得 的 值 则 为 RNA 指 数 RI 为 了 与 DI 相 区 别, 又 以 10 来 表 示 二 蛋 白 质 总 量 样 品 制 备 测 定 细 胞 总 蛋 白 量 能 够 检 测 一 个 细 胞 群 体 生 长 和 代 谢 的 状 态, 也 可 区 别 具 有 不 同 蛋 白 质 含 量 恶 性 肿 瘤 时, 肿 瘤 细 胞 的 蛋 白 质 总 量 往 往 增 加 1 检 测 原 理 : 异 硫 氰 酸 荧 光 素 (Fluorescein isothiocyanate,fitc) 是 检 测 细 胞 总 蛋 白 量 最 常 用 的 荧 光 探 针 它 是 酸 性 染 料, 以 共 价 键 方 式 结 合 到 蛋 白 的 带 正 电 核 的 基 上 ; 当 以 蓝 色 激 光 激 发 后, 发 出 明 亮 的 绿 色 继 发 荧 光 绿 色 继 发 荧 光 的 强 度, 与 细 胞 的 蛋 白 质 含 量 成 严 格 的 正 相 关 关 系 2 染 色 方 法 :: 取 20 mg 异 硫 氰 基 荧 光 素, 加 20ml 无 水 酒 精, 使 FITC 充 分 溶 解, 即 为 染 色 液 的 原 液, 保 存 于 4 冰 箱 待 用 具 体 荧 光 染 色 步 骤 如 下 :1 TITC 贮 存 液 的 稀 释 : 用 ph 7.4 的 PBS 液 稀 释 成 50μg /ml 浓 度 的 工 作 液, 备 用 ;2 被 染 色 细 胞 首 先 用 70% 酒 精 破 膜,10imn, 使 FITC 染 料 能 进 入 到 细 胞 中 ;3 用 离 心 法 以 PBS 液 洗 去 破 膜 剂, 离 心 收 集 细 胞 ;4 再 取 FITC 工 作 液 2ml 加 入 样 品 中, 混 匀, 置 4 冰 箱 中 反 应 30 min; 5 用 PBS 液 以 1500prm 离 心 5min, 洗 去 染 色 液, 再 离 心 去 上 清 ;6 再 加 0.5 ml PBS, 混 匀, 上 机 检 测 3 检 测 分 析 : 用 Cellquest 软 件 程 序 获 取 个 细 胞, 用 ModiFit LT 软 件 分 析 细 胞 总 蛋 白 质 含 量 用 蛋 白 质 指 数 (protein Index,PI) 表 示 在 蛋 白 质 直 方 图 上,PI= 被 检 测 细 胞 峰 荧 光 道 数 / 正 常 细 胞 峰 荧 光 道 数, 所 得 的 值 三 网 织 红 细 胞 样 品 的 制 备 63

4 1 染 色 原 理 网 织 红 细 胞 是 一 种 未 完 全 成 熟 红 细 胞 在 细 胞 成 熟 过 程 中, 其 胞 浆 中 的 RNA 含 量 逐 渐 被 血 红 蛋 白 所 取 代, 因 此, 检 测 红 细 胞 中 RNA 的 含 量 多 少, 就 代 表 了 红 细 胞 的 成 熟 程 度 从 而 成 为 检 测 网 织 红 细 胞 的 重 要 方 法 网 织 红 细 胞 计 数 可 以 判 断 骨 髓 红 细 胞 系 统 造 血 情 况 溶 血 性 贫 血 时 由 于 大 量 网 织 红 细 胞 进 入 血 循 环, 可 使 网 织 红 细 胞 高 达 0.20 或 更 高 急 性 失 血 后 5-10 天, 网 织 红 细 胞 达 高 峰 2 周 后 恢 复 正 常 典 型 再 生 障 碍 性 贫 血 病 例 网 织 红 细 胞 百 分 比 常 网 织 红 细 胞 数 低 于 /L 为 诊 断 再 生 障 碍 性 贫 血 的 标 准 之 一 网 织 红 细 胞 升 高 : 表 示 骨 髓 红 细 胞 增 生 活 跃, 多 见 于 各 种 急 慢 性 失 血 溶 血 和 治 疗 有 效 的 各 类 增 生 性 贫 血, 如 缺 铁 性 贫 血 溶 血 性 贫 血 巨 幼 细 胞 性 贫 血 等 等, 是 贫 血 治 疗 中 非 常 有 价 值 的 监 测 指 标 网 织 红 细 胞 减 低 : 见 于 各 种 骨 髓 增 生 能 力 低 下 的 疾 病, 尤 多 见 于 重 型 再 生 障 碍 性 贫 血 等 2 样 品 制 备 (1) 抽 取 全 血 0.5ml, 注 入 盛 有 0.5ml 的 0.1mol/L EDTA 溶 液 中 ; (2) 用 微 量 取 液 器 取 50μlEDTA 抗 凝 血, 置 于 另 一 离 心 管 中, 加 入 Good¹s 缓 冲 液 5.0ml, 离 沉 淀 1000 rpm,5min, 连 续 洗 3 次 ; (3) 将 沉 淀 细 胞 加 入 1.0ml 枸 椽 酸 钠 缓 冲 液, 轻 轻 振 荡 悬 浮 ; (4) 将 悬 浮 液 缓 慢 注 入 盛 有 4ml 0.1% 戊 二 醛 缓 冲 液 中 固 定 15min; (5) 上 FCM 之 前, 用 PBS 洗 去 固 定 剂, 加 入 0.5ml 0.01% 的 派 若 宁 工 作 液 ; 染 色 30min 离 心 沉 淀 去 染 液,1500 rpm,5 min; (6) 用 PBS 洗 一 次, 离 心 1500 rpm,5min, 去 上 清, 再 用 PBS 将 细 胞 悬 浮, 上 机 检 测 3 检 测 和 分 析 运 用 对 数 放 大 的 前 向 与 侧 向 散 射 光 信 号 来 区 分 红 细 胞 与 血 小 板 要 采 集 足 够 数 量 的 细 胞 进 行 分 析, 一 般 网 织 红 细 胞 低 于 总 红 细 胞 的 0.5%, 最 少 要 采 集 个 颗 粒 进 行 分 析 以 减 小 CV 值 建 立 FSC vs SSC 双 参 数 直 方 图, 运 用 对 数 放 大 后 可 设 门 圈 定 红 细 胞 对 于 检 测 样 本 或 对 照, 在 单 参 数 直 方 图 中 分 析 红 细 胞 门 中 细 胞 注 意 在 分 析 直 方 图 上, 主 要 细 胞 群 体 可 能 会 偏 移, 这 可 能 是 由 于 成 熟 红 细 胞 过 度 染 色 造 成 的 检 查 强 荧 光 表 达 区 域 并 去 除 这 些 强 阳 性 颗 粒, 这 些 颗 粒 是 标 本 中 的 有 核 红 细 胞 着 色 后 形 成 的 在 成 熟 红 细 胞 与 有 核 红 细 胞 之 间 设 立 适 当 的 线 性 门 ( 高 于 成 熟 红 细 胞 低 于 有 核 红 细 胞 ) 统 计 网 织 红 细 胞 的 比 例 如 有 必 要, 设 立 不 同 的 线 性 门 来 统 计 不 同 成 熟 度 的 网 织 红 细 胞 的 百 分 比 根 据 荧 光 强 度, 还 可 将 网 织 红 细 胞 分 成 低 荧 光 强 度 网 织 红 细 胞 (Low Fluorescent Reticulocyte 简 称 LFR) 中 荧 光 强 度 网 织 红 细 胞 (Middle FluorescentReticulocyte 简 称 MFR) 和 高 荧 光 强 度 网 织 红 细 胞 (High Fluorescent Reticu1ocyte 简 称 HFR) 部 分 幼 稚 的 网 红 显 示 最 强 的 荧 光, 反 之 成 熟 红 细 胞 极 少 或 没 有 荧 光 4 临 床 典 型 应 用 (1) 骨 髓 移 植 (BMT): 评 估 BMT 后 的 红 细 胞 生 成 情 况,HFR 计 数 提 供 了 早 期 测 量 依 据, 同 时 也 比 监 测 单 核 细 胞 水 平 更 为 精 确 和 实 际 (2) 贫 血 : 可 将 网 织 红 细 计 数 及 其 分 类 作 为 鉴 别 诊 断 的 初 筛 指 标 (3) 海 洋 性 贫 血 : 地 贫 以 无 效 造 血 和 红 细 胞 寿 命 缩 短 为 特 点, 网 织 红 细 胞 计 数 与 HGB 水 平 变 化 相 反, 轻 度 贫 血 或 非 贫 血 病 人, 网 织 红 细 胞 增 长 可 能 非 常 细 微 以 至 手 工 计 数 察 觉 不 到, 而 使 用 精 确 的 自 动 计 数 技 术 明 显 多 了 (4) 骨 髓 增 生 异 常 综 合 征 (MDS) 一 般 说 来,MFR 在 HFR 之 前 进 入 循 环, 暗 示 红 细 胞 生 成 规 律 性 恢 复 的 开 始 L.Kuse 64

5 认 为 : 少 量 MFR 可 以 作 为 MDS 化 疗 后 粒 系 恢 复 的 早 期 指 标, 且 比 RET 绝 对 值 更 敏 感 (5) 放 疗 与 化 疗 : 通 过 流 式 法 网 织 红 细 胞 分 析 可 获 得 骨 髓 增 生 特 别 是 红 系 增 生 及 放 化 疗 的 细 胞 毒 副 作 用 的 信 息 在 造 血 反 应 中 ( 如 叶 酸 和 VitB12) 治 疗 后 或 化 疗 后 造 血 恢 复 中 可 见 网 织 红 细 胞 短 暂 迅 速 的 增 高 当 HGB 下 降 组 织 氧 化 受 阻 时,EPO 生 成 增 多,EPO 促 使 干 细 胞 向 原 始 红 细 胞 分 化, 也 加 速 网 织 红 细 胞 释 放 因 此,EPO 增 加,HFR 也 增 多, 并 伴 有 网 织 红 细 胞 的 增 多 化 疗 后 骨 髓 EPO 功 能 恢 复 早 期 HPR 增 多 比 网 织 红 细 胞 总 数 恢 复 早, 这 种 反 应 时 间 的 不 同 体 现 了 EPO 与 HFR 之 间 的 密 切 关 系 末 梢 血 网 织 红 计 数 优 于 白 细 胞 计 数 和 血 小 板 计 数 分 析 骨 髓 造 血 状 态 (6) 抗 贫 血 药 疗 效 观 察 : 网 织 红 细 胞 可 作 为 疗 效 观 察 指 标 凡 是 骨 髓 增 生 功 能 良 好 的 病 人, 在 给 予 有 关 抗 贫 血 药 物 后, 其 网 织 红 细 胞 在 1 周 左 右 可 百 家 高 峰, 贫 血 严 重, 网 织 红 细 胞 数 升 得 越 高, 而 且 其 升 高 往 往 在 红 细 胞 恢 复 之 前 贫 血 病 有 在 抗 贫 血 治 疗 过 程 中, 如 果 网 织 红 细 胞 不 见 升 高, 说 明 该 种 治 疗 无 效 或 骨 髓 造 血 功 能 障 碍 因 此 网 织 红 细 胞 计 数 是 对 贫 血 病 人 经 常 随 访 检 查 的 项 目 之 一 如 缺 铁 性 贫 血 铁 剂 治 疗 有 效 时, 网 织 红 细 胞 明 显 增 多, 随 后 红 细 胞 及 血 红 蛋 白 逐 渐 增 高, 网 织 红 细 胞 下 降, 这 种 网 织 红 细 胞 反 应, 可 被 作 为 抗 贫 血 治 疗 的 疗 效 判 断 四 外 周 血 CD4+ 细 胞 CD45RA/CD45RO 的 表 达 CD45RO CD45RA 是 白 细 胞 共 同 抗 原 CD45 的 两 类 亚 型, 由 CD45 肽 链 胞 外 区 氨 基 端 的 三 个 外 显 子 发 生 旁 路 剪 接 而 导 致 缺 乏 三 种 外 显 子 的 同 型 称 为 CD45RO, 仅 表 达 外 显 子 A 的 同 型 称 为 CD45RA T 细 胞 表 达 不 同 的 CD45 亚 型 与 其 功 能 差 异 有 一 定 的 关 系, 通 常 CD45RO 阳 性 T 细 胞 为 记 忆 T 细 胞 (memory T 细 胞 ),CD45-RA 阳 性 为 童 贞 T 细 胞 (naïve T 细 胞 ) 1 生 物 学 特 性 : 1 胸 腺 内 细 胞 :CD45RA-CD45RO- RA-RO+ RA+RO-( 脐 血 T 细 胞 占 90%) 胸 腺 中 淋 巴 细 胞 成 熟 进 入 血 液 循 环 的 为 CD45RA+( naïve T 细 胞 ) 2 在 外 周 血 中,CD4+CD45RA+T 细 胞 接 触 抗 原 刺 激 后 可 转 变 为 CD4+CD45RO+ T 细 胞 3 CD45RA+ 和 CD45RO+ 两 类 T 细 胞 分 泌 淋 巴 细 胞 因 子 的 能 力 不 同 抗 原 刺 激 后, CD45RA+ 细 胞 以 增 殖 为 主,CD45RO+ 细 胞 以 发 挥 效 应 为 主 2 临 床 意 义 : 1 骨 髓 移 植 : 骨 髓 移 植 病 人 中 CD45RA CD45RO 的 不 平 衡 可 持 续 4~10 年 CD34+ 分 选 造 血 干 细 胞 移 植 与 未 分 选 干 细 胞 移 植 的 受 体 比 较, 前 者 外 周 血 T B 细 胞 恢 复 延 迟 移 植 后 最 先 两 个 月, 两 组 病 人 循 环 的 T 细 胞 主 要 是 CD45RO+ 细 胞 前 组 移 植 后 2~3 月,CD45RA+ 细 胞 逐 渐 增 高 表 明 成 熟 的 CD34+ 造 血 干 细 胞 产 生 的 是 NaiveT 细 胞 2 SLE: 临 床 症 状 出 现 后 短 期 内 多 数 T 细 胞 表 达 CD45RA 为 静 止 T 细 胞 或 者 已 接 触 抗 原 的 CD45RO 弱 阳 性 的 早 期 T 细 胞 然 而, 随 着 疾 病 活 动 期 的 延 长,CD45RO 强 阳 性 T 细 胞 开 始 增 加 在 活 动 期 SLE 病 人 中, 静 止 T 细 胞 扩 增 在 疾 病 中 的 作 用 胜 于 记 忆 T 细 胞 的 反 应 3 葡 萄 膜 炎 : 患 者 房 水 中 CD4+ 淋 巴 细 胞 百 分 比 明 显 较 外 周 血 高, 而 Naïve T 细 胞 的 百 分 比 显 著 低 于 外 周 血, 记 忆 T 细 胞 高 于 外 周 血 房 水 中 Fas 抗 原 主 要 表 达 在 记 忆 细 胞 上 Fas+ 记 忆 T 细 胞 可 能 涉 及 到 葡 萄 膜 炎 的 致 病 机 理 4 ITP: 急 性 特 发 性 血 小 板 减 少 性 紫 癜 (ITP) 患 儿 比 慢 性 ITP 患 儿 和 对 照 组 有 更 高 的 CD45RA 和 更 低 的 CD45RO, 但 是 这 些 差 异 也 可 能 与 年 龄 有 关 5 CD45RA CD45RO 随 年 龄 的 变 化 : 老 年 人 组 CD4+T 细 胞 表 达 CD45RO 超 过 CD45RA, 而 在 年 轻 组 中 正 相 反 五 外 周 血 CD4+ 细 胞 CD40/CD40L 的 表 达 65

6 CD40-CD40L 通 路 是 继 CD28-CD80/86 之 后 受 到 重 视 的 又 一 共 刺 激 分 子 通 路 CD40-CD40L 通 路 在 体 液 免 疫 中 具 有 重 要 作 用,CD40-CD40L 间 的 相 互 作 用 促 进 了 B 淋 巴 细 胞 增 殖, 是 产 生 免 疫 球 蛋 白 所 必 须 的 CD40 广 泛 分 布 于 体 内 各 种 细 胞, 主 要 表 达 于 B 淋 巴 细 胞,CD40L 主 要 表 达 于 活 化 的 T 淋 巴 细 胞 上 1 生 物 学 特 性 : 1 共 刺 激 因 子, 传 递 第 二 信 号 2 延 长 APC 寿 命, 其 机 制 是 通 过 CD40L 通 路 抑 制 自 发 或 活 化 诱 导 的 细 胞 死 亡 (AICD), 体 外 培 养 也 发 现,CD40 信 号 能 增 强 单 核 细 胞 和 DC 细 胞 的 生 存 能 力 ; 3 分 泌 诸 如 :IL-12,IL-1,TNF-α,IL-6,IL-8 等 细 胞 因 子 ; 4 增 强 单 核 细 胞 对 肿 瘤 的 杀 伤 活 性 ; 5 NO 合 成 2 临 床 意 义 : SLE: 正 常 情 况 下,CD40L 仅 暂 时 性 的 表 达 于 激 活 的 T 淋 巴 细 胞 表 面, 而 CD40L 的 持 久 表 达 可 使 活 化 的 自 身 反 应 性 淋 巴 细 胞 免 于 调 亡, 从 而 导 致 自 身 免 疫 性 疾 病 的 发 生 SLE 患 者 血 清 中 存 在 可 溶 性 CD40L, 其 滴 度 明 显 高 于 对 照 组 和 正 常 人 群, 且 与 疾 病 严 重 程 度 相 关, 肾 炎, 高 蛋 白 血 症, 有 中 枢 神 经 系 统 受 累 者 有 更 高 scd40l 滴 度 六 Th1 细 胞 和 Th2 细 胞 的 检 测 1 基 本 概 念 : Th 细 胞 : 辅 助 性 T 细 胞, 根 据 分 泌 细 胞 因 子 能 力 大 小, 又 分 为 Th1 和 Th2 Th1 细 胞 和 Th2 细 胞 所 分 泌 的 细 胞 因 子 及 与 抗 原 递 呈 细 胞 的 相 互 作 用 关 系 见 图 Th1 细 胞 : 辅 助 细 胞 免 疫, 并 介 导 迟 发 型 超 敏 反 应 分 类 标 准 : 分 泌 细 胞 因 子 IFNγ( 标 志 性 细 胞 因 子 ) TNFβ IL-2; 其 它 标 记 :CD3 CD2 TCR CD4( 通 常 ) LAG-3; 细 胞 功 能 : 活 化 Ⅰ 型 免 疫 效 应, 细 胞 毒 性 T 细 胞 巨 噬 细 胞 NK 和 K 细 胞 嗜 中 性 粒 细 胞 图 Th1 细 胞 与 抗 原 提 呈 细 胞 的 关 系 66

7 Th2 细 胞 : 辅 助 B 细 胞 产 生 抗 体, 主 要 介 导 体 液 免 疫 分 类 标 准 : 分 泌 细 胞 因 子 IL-4( 标 志 性 细 胞 因 子 ) IL-2 IL-10; 其 它 标 记 :CD3 CD2 TCR CD4( 通 常 ) LAG-3; 细 胞 功 能 : 活 化 Ⅱ 型 免 疫 效 应,B 细 胞 (IgG1 IgE IgA) 嗜 酸 性 粒 细 胞 柱 状 细 胞 肥 大 细 胞 图 Th2 细 胞 与 抗 原 提 呈 细 胞 的 关 系 图 Th1 和 Th2 细 胞 与 Th0\APC 的 相 互 关 系 2 检 测 原 理 活 化 : 未 活 化 的 淋 巴 细 胞 所 分 泌 的 细 胞 因 子 极 少, 用 流 式 细 胞 术 很 难 检 测 出 来, 因 此 在 检 测 前 需 剌 激 活 化 活 化 剌 激 素 为 PMA( 佛 波 脂 )+Ionomycin 抑 制 分 泌 : 淋 巴 细 胞 在 剌 激 素 的 作 用 下 活 化, 分 泌 细 胞 因 子 到 细 胞 外 因 为 流 式 细 胞 仪 只 能 对 细 胞 表 面 或 内 部 的 抗 原 进 行 检 测, 因 此 必 须 阴 止 细 胞 因 子 的 分 泌 确 定 CD4+ 细 胞 :Th1/Th2 细 胞 的 先 决 条 件 是 CD4+T 细 胞, 因 此 存 在 着 用 CD4 凤 定 细 胞 群 的 问 题 我 们 知 道,CD4 不 仅 在 T 细 胞 表 面 上 表 达, 而 且 还 在 所 有 单 核 细 胞 表 面 上 表 达 因 此, 单 独 用 CD4 设 门 无 法 将 CD4T 细 胞 区 分 开 来 实 践 证 明 也 不 能 用 CD3/CD4 双 参 数 设 门, 因 为 佛 波 脂 作 用 下 CD4 抗 原 表 达 迅 速 下 调 只 能 用 CD3/CD8 设 门, 因 为 CD8 不 受 佛 67

8 波 脂 的 影 响 ; 而 且 绝 大 多 数 CD3+/CD8- 细 胞 都 是 CD3+/CD4+ 细 胞 所 以 可 用 CD3+/C 左 细 胞 群 来 确 定 CD4+T 细 胞 群 3 检 测 试 剂 :( 问 陈 军 浩 ) PMA: 贮 存 液 :PMA 溶 于 DMSO, 浓 度 为 0.1mg/ml,-20 保 存 ; 工 作 液 贮 存 液 1:100 稀 释 于 RPMI 1640 或 PBS( 无 菌, 无 NaN3) 中, 此 时 为 1μg/ml; 工 作 浓 度 为 25ng/ml,( 取 25 μg/ml) Ionomycin: 贮 存 液 :Ionomycin 溶 于 DMSO, 浓 度 为 1mg/ml,-20 保 存 ; 工 作 液 : 贮 存 液 1: 20 稀 释 于 RPMI 1640 或 PBS( 无 菌, 无 NaN3) 中, 此 时 为 50μg/ml; 工 作 浓 度 为 1μg/ml, ( 取 20μg/ml) Monensin: 贮 存 液 :Monensin 溶 于 甲 醇, 浓 度 为 50mg/ml, 为 加 速 成 溶 解, 可 置 于 水 浴 4 只 少 保 存 4 个 月 ; 工 作 液 : 贮 存 液 1:50 稀 释 于 RPMI 1640 或 PBS( 无 菌, 无 NaN3) 中, 此 时 为 1mg/ml; 工 作 浓 度 为 1.7μg/ml( 取 17μl/ml) RPMI 1640:RPMI 1640 含 10%FCS( 胎 牛 血 清 ),2mM glutamin,50μg/ml 青 霉 素,50μ g/mlsteptomycin 和 100μg/ml neomycin 抗 体 : 细 胞 表 面 标 志 抗 体 :CD3-PC5(PerCP),CD8-FITC 细 胞 内 因 子 抗 体 :IL-4-PE,IFN-γ-PE 破 膜 剂 : 可 用 品 牌 : 美 国 Caltag 公 司 的 Fix&Perm 破 膜 剂 ; 美 国 BD 公 司 的 FACS 破 膜 剂 法 国 Immunotech 公 司 的 IntraPrep 破 膜 剂 4 检 测 步 骤 : (1) 肝 素 抗 凝 采 血 ; (2) 取 两 只 试 管, 分 别 作 茧 自 缚 为 阴 性 对 照 管 (A 管 ) 和 测 定 管 (B 管 ), 于 两 只 试 管 中 均 加 入 100μl 血 液 和 100μl PRPIM 1640 (3)A 管 中 加 和 :3.4μl 1mg/ml 的 Monensin 工 作 液 ;B 管 中 加 入 :5μl 1μg/ml 的 PMA 工 作 液 +4μl 50μg/ml Ionomycin 工 作 液 +3.4μl 1 mg/ml Monensin 工 作 液 (4) 37,5% CO2 培 养 箱 培 养 4-6h; (5) 混 匀, 取 出 100μl, 加 入 适 量 CD3-PC5(PerCP),CD8-FITC, 孵 育 一 段 时 间,( 参 阅 抗 体 说 明 书 ); (6) 不 着 破 膜 剂 固 定 和 破 膜 ; (7) 加 入 适 量 IL-4-PE,IFN-γ-PE, 孵 育 一 段 时 间,( 参 阅 抗 体 说 明 书 ); (8) PBS 洗 一 次, 去 上 清 ; 适 量 PBS 重 悬 细 胞 沉 淀, 上 机 检 测 注 意 : 细 胞 表 面 和 细 胞 内 抗 原 同 时 检 测 时, 应 先 标 记 细 胞 表 面 抗 菌 素 原, 破 膜 后 再 标 记 细 胞 内 抗 原 Caltag 公 司 的 破 膜 剂 不 同 于 其 它 公 司, 其 破 膜 与 抗 体 标 记 同 时 进 行, 大 缩 短 了 操 作 时 间 5 结 果 分 析 (1) 用 CD4 设 门, 选 定 淋 巴 细 胞 ; (2) 用 CD8 分 别 和 IFN-γ 建 立 双 参 数 直 方 图 对 第 1 步 所 确 定 的 淋 巴 细 胞 进 行 分 析 ; (3) 得 出 CD8-/IL-4+(Th2) 和 CD8-/IFN-γ+(Th2) 细 胞 百 分 含 量 七 外 周 血 白 细 胞 HLA-B27 的 表 达 HLA-B27 抗 原 是 人 类 主 要 组 织 相 容 性 复 合 体 (MHC) 的 表 达 产 物, 属 Ⅰ 型 MHC 基 因 在 免 疫 系 统 中 主 要 负 责 细 胞 之 间 的 相 互 识 别 和 诱 导 免 疫 反 应 单 核 细 胞 粒 细 胞 淋 巴 细 胞 表 68

9 面 均 可 检 测 到 含 量 不 等 的 HLA-B27 抗 原, 以 单 核 细 胞 表 面 含 量 最 为 丰 富 HLA-B27 抗 原 与 共 刺 激 分 子 B7(CD80 CD86) 有 类 似 的 组 成 结 构, 因 而, HLA-B27 抗 原 的 单 克 隆 抗 体 常 与 B7 分 子 交 叉 反 应 国 外 于 1987 年 首 次 报 告 了 用 流 式 细 胞 术 检 测 HLA-B27 的 表 达, 随 后, 开 始 应 用 流 式 细 胞 术 从 细 胞 水 平 研 究 HLA-B27 的 表 达 状 况, 并 作 为 相 关 疾 病 筛 选 的 指 标, 迄 今 为 止 检 索 表 明 共 有 相 关 文 献 81 篇 国 内 最 早 的 综 述 文 献 发 表 于 1994 年, 致 病 机 理 研 究 发 表 于 1998 年 (PCR 方 法 ), 使 用 流 式 细 胞 术 检 测 HLA-B27 表 达 文 献 发 表 于 2000 年 1 HLA-B27 在 强 直 性 脊 柱 炎 (ankylosing spondylistis,as) 中 的 诊 断 价 值 (1) 敏 感 性 及 特 异 性 对 于 一 个 随 机 选 择 的 患 者 来 说, 以 HLA-B27 实 验 发 现 AS 的 诊 断 价 值 可 以 通 过 实 验 的 敏 感 性 来 获 得, 敏 感 性 的 定 义 是 患 者 中 阳 性 结 果 的 比 率,AS 病 人 为 90%~95%( 白 种 人 ) 特 异 性 的 定 义 是 健 康 个 体 中 阴 性 结 果 的 比 率 当 人 群 AS 发 病 为 0.1% 时, 人 群 HLA-B27 出 现 频 率 为 10%, 敏 感 性 为 95%,HLA-B27 的 特 异 性 为 90.1%; 如 果 人 群 AS 发 病 率 升 至 1% 时, 则 特 异 性 为 90.8% (2) HLA-B27 实 验 阳 性 的 预 示 价 值 预 示 价 值 系 指 HLA-B27 阳 性 患 者 占 HLA-B27 阳 性 人 群 的 比 率, 如 果 人 群 HLA-B27 出 现 频 率 为 10%, 发 病 率 分 别 为 0.1% 和 1%, 则 预 示 价 值 分 别 为 0.95% 和 9.5% 这 些 数 字 与 流 行 病 学 调 查 发 现 恰 好 吻 合, 后 者 算 出 1%~6%HLA-B27 阳 性 者 患 AS (3) HLA-B27 实 验 阴 性 的 预 示 价 值 指 的 是 HLA-B27 阴 性 健 康 者 所 占 比 率, 可 以 通 过 计 数 得 出,HLA-B27 阴 性 者 未 患 AS 约 为 99.9% 从 上 述 数 据 资 料 可 以 看 出, 尽 管 HLA-B27 实 验 具 有 高 度 敏 感 性 的 特 异 性, 但 不 可 用 于 论 断 随 机 选 择 的 患 者 是 否 患 有 AS, 阳 性 结 果 的 预 示 价 值 在 0.95~9.5%, 提 示 绝 大 多 数 的 HLA-B27 阳 性 者 并 未 患 AS 因 此 HLA-B27 不 能 作 为 随 机 选 择 人 群 的 AS 筛 选 指 标 但 不 患 AS 者 的 阴 性 结 果 预 示 价 值 非 常 高, 因 为 AS 患 者 HLA-B27 阴 性 机 会 是 非 常 少 的, 这 样 HLA-B27 实 验 在 处 理 随 机 选 择 患 者 的 临 床 实 践 中 具 某 此 价 值, 阴 性 结 果 可 被 看 做 诊 断 AS 的 排 除 标 准 但 是, 这 是 不 现 实 的, 因 为 不 可 能 的 随 机 选 择 人 群 中 作 HLA-B27 实 验, 只 有 临 床 上 怀 疑 其 患 有 血 清 学 阴 性 脊 椎 关 节 病 变 时 才 作 这 个 实 验 因 此, 对 于 那 些 具 有 提 示 血 清 学 阴 性 脊 柱 关 节 病 的 症 状 及 体 症 的 病 例, 本 实 验 具 有 潜 在 的 使 用 价 值 流 行 病 学 调 查 发 现 HLA-B27 阳 性 伴 背 痛 及 强 直,AS 的 发 病 率 为 22.5%, 这 个 数 字 与 随 机 选 择 的 B27 阳 性 者 的 AS 发 病 变 幻 无 常 为 1%~6% 相 差 悬 殊, 因 此 选 择 背 痛 及 强 直 者 进 行 实 验 提 高 了 发 现 AS 的 可 能 性 有 些 研 究 者 指 出,AS 可 表 现 为 炎 性 背 痛 的 临 床 症 状, 但 没 有 AS 的 典 型 影 像 特 征 在 家 族 调 查 中, 这 个 临 床 特 征 与 HLA-B27 有 显 著 联 系, 发 现 13%~18% B27 阳 性 的 一 级 亲 属, 有 炎 性 临 床 特 征 而 不 伴 随 影 像 学 改 变 (4) 青 少 年 性 关 节 炎 HLA-B27 的 意 义 与 成 人 的 AS 不 同, 青 少 年 AS 在 发 病 初 期 引 起 骨 骼 病 变 的 症 状 出 现 较 少, 可 能 有 24% 的 儿 童 主 诉 腰 椎 痛 或 强 直 但 是 发 病 初 期 末 梢 关 节 病 变 表 现 明 显, 青 少 年 AS 与 HLA-B27 的 关 系 与 成 年 人 AS 的 一 样, 对 于 已 确 诊 的 青 少 年 慢 性 关 节 炎 患 者,HLA-B27 实 验 阳 性 对 于 提 醒 医 生 诊 断 即 将 发 生 的 AS 起 辅 助 作 用 但 是, 本 实 验 与 诊 断 成 人 AS 一 样 具 有 相 同 的 局 限 性, 不 可 以 作 为 诊 断 标 准 由 于 HLA-B27 以 共 显 性 方 式 遗 传, 故 一 级 亲 属 HLA-B27 出 现 率 因 是 否 为 纯 合 体 及 配 偶 HLA 状 态 不 同 而 表 现 为 25%~100% AS 先 证 者 的 一 级 亲 属 AS 出 现 率 预 计 为 1.3%~11% AS 的 诊 断 依 据 为 背 部 疼 痛 或 强 直 并 出 殃 有 影 像 学 的 骶 髂 关 节 炎 这 类 病 例 即 使 HLA-B27 阴 性 也 不 能 改 变 诊 断,AS 伴 HLA-B27 阴 性 的 患 者 提 醒 医 生 有 同 时 发 生 牛 皮 癣 及 炎 症 性 小 肠 病 变 的 可 能 当 然, 亦 有 HLA-B27 阴 性 不 伴 发 皮 肤 及 肠 道 病 变 的 纯 AS 病 例 HLA-B27 是 脊 柱 关 节 病 病 因 及 发 病 机 制 的 关 键, 这 一 观 点 已 被 广 泛 认 同 但 是 必 须 清 楚, 只 有 少 数 HLA-B27 阳 性 者 患 病 目 前 AS 的 诊 断 仍 主 要 依 靠 临 床 检 查,X 线 片 示 双 侧 骶 髂 69

10 关 节 炎 和 脊 柱 则 是 最 重 要 的 诊 断 依 据 虽 然 HLA-B27 实 验 应 用 有 限, 既 不 能 用 于 疾 病 确 诊, 也 不 能 预 见 患 者 的 预 后, 但 它 以 下 几 个 方 面 将 有 助 于 诊 断 :BD 公 司 生 产 的 B27 检 测 试 剂 使 用 方 便 可 靠 试 剂 盒 由 FITC 标 记 标 准 微 球 一 瓶 B27FITC/CD3PE 双 标 试 剂 1 瓶 和 BD 溶 血 剂 1 瓶 组 成 2 实 验 方 法 1 取 荧 光 素 PE 标 记 的 CD3 单 抗 及 FITC 标 记 的 HLA-B27 单 抗 30 ul EDTAK2 抗 凝 的 全 血 50 ul 混 匀 后 室 温 染 色 15min( 或 20min); 2 加 溶 血 剂 2 ml 溶 解 红 细 胞 (10min); rpm 离 心 洗 涤 除 去 细 胞 碎 片, 加 1% 多 聚 甲 醛 固 定 (15min); 4 上 机 测 定 在 测 完 标 准 微 球 并 调 节 好 FL1 电 压 后, 不 可 改 变 FL1 的 设 置 通 过 CD3PE vs SSC 设 门 圈 定 CD3 阳 性 细 胞 (T 淋 巴 细 胞 ), 检 测 其 B27 的 平 均 荧 光 强 度 如 标 本 荧 光 强 度 小 于 标 准 微 球 荧 光 强 度 则 为 阴 性, 相 反 为 阳 性 5 流 式 细 胞 仪 检 测 发 出 实 验 报 告 (10min) 图 HLA-B27 细 胞 表 达 的 检 测 原 理 3 临 床 意 义 1 强 直 性 脊 椎 炎 患 者 中 90% 以 上 HLA-B27 阳 性, 正 常 人 群 中 只 有 5%~10% 阳 性 而 强 直 性 脊 椎 炎 由 于 其 临 床 症 状 与 许 多 疾 病 相 似 而 难 以 确 诊, 特 别 在 疾 病 早 期 2 Reiter`s 综 合 症 患 者 中 HLA-B27 阳 性 率 70%~90% 3 银 屑 病 性 关 节 炎 患 者 中 HLA-B27 阳 性 率 50%~60% 4 葡 萄 膜 炎 患 者 中 HLA-B27 阳 性 率 40%~50% 八 PNH 的 流 式 细 胞 术 分 析 : 阵 发 性 睡 眠 性 血 红 蛋 白 尿 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,pnh) 是 一 种 获 得 性 造 血 干 细 胞 异 常, 临 床 主 要 表 现 为 骨 髓 丧 失 造 血 功 能 血 栓 慢 性 溶 血 性 贫 血 急 性 发 作 PNH 的 发 病 率 很 低, 发 病 原 因 不 详, 可 能 与 再 生 障 碍 性 贫 血 有 关 系 PNH 的 临 床 表 现 不 一, 疾 病 进 程 多 变, 给 临 床 的 诊 断 治 疗 和 疾 病 研 究 带 来 很 多 困 难 最 近 15 年, 在 PNH 的 细 胞 和 分 子 生 物 学 研 究 中 取 得 了 重 要 进 展, 定 义 了 导 致 PNH 异 常 表 现 的 分 子 缺 陷 而 使 用 流 式 细 胞 仪 进 行 PNH 诊 断 分 型, 是 PNH 研 究 的 又 一 里 程 碑 使 用 单 克 隆 抗 体 和 流 式 细 胞 仪 技 术 则 是 发 现 诊 70

11 断 PNH 表 型 异 常 的 重 要 手 段 使 用 流 式 细 胞 仪 可 以 发 现 Ham 实 验 阴 性 的 再 生 障 碍 性 贫 血 病 人 中 存 在 的 少 量 PNH 细 胞, 这 可 以 将 PNH 分 为 两 种 情 况 :(1) 溶 血 性 PNH, 特 征 是 显 性 溶 血 性 贫 血, 同 时 有 血 红 蛋 白 尿 值 得 注 意 的 是, 这 组 病 人 中, 有 50% 发 生 静 脉 血 栓, 这 是 导 致 病 人 死 亡 的 主 要 原 因 (2) 再 生 不 良 性 PNH, 可 以 检 出 GPI 缺 乏 的 造 血 细 胞, 没 有 显 性 溶 血, 但 可 能 有 其 它 症 状, 如 再 生 障 碍 性 贫 血 白 细 胞 减 少 症 或 血 小 板 减 少 症 1 检 测 方 法 : 通 过 应 用 CD45 CD61 CD64 等 单 抗 分 别 设 定 血 小 板 淋 巴 单 核 粒 红 细 胞 III 区 II 区 及 I 区 细 胞 的 位 置 ( 见 图 ) (1) 阴 性 对 照 管 :CD55/CD59 相 应 同 型 对 照 取 3µl 全 血, 加 入 CD45+CD61FITC /IgG1PE / CD64TC 和 CD45+CD61FITC /IgG2a PE / CD64TC (2) 阳 性 对 照 管 取 正 常 人 外 周 血 3µl 加 入 CD45+CD61FITC /CD55PE / CD64TC, CD45+CD61FITC /CD59PE / CD64TC (3) 病 人 检 测 管 直 接 将 病 人 外 周 血 3µl 用 CD45+CD61FITC /IgG1PE / CD64TC,CD45+CD61FITC /IgG2a PE / CD64TC 染 色 测 定 各 细 胞 群 体 CD55,CD59 的 表 达 情 况 图 通 过 CD61 CD45 和 CD64 识 别 血 小 板 红 细 胞 淋 巴 细 胞 单 核 细 胞 和 粒 细 胞 2 结 果 分 析 : 见 图 及

12 图 : 正 常 对 照 分 别 为 红 细 胞 单 核 细 胞 CD59 和 CD55 的 表 达 情 况 图 PNH 病 人 红 细 胞 单 核 细 胞 有 II 区 细 胞 存 在 九 多 药 耐 药 基 因 蛋 白 表 达 的 检 测 1 基 本 概 念 肿 瘤 细 胞 的 多 药 耐 药 (multidrug resistance,mdr) 是 指 肿 瘤 细 胞 在 接 触 一 种 抗 癌 药 物 后, 不 但 对 该 药 产 生 耐 药, 而 且 还 对 其 他 结 构 和 作 用 机 制 不 同 的 药 物 也 产 生 抗 药 性 1970 年 Biedler 和 Reihm 最 先 报 道 了 MDR 现 象, 他 们 发 现, 对 放 线 菌 素 D 耐 药 的 细 胞, 同 时 也 对 多 种 抗 肿 瘤 抗 生 素 和 植 物 碱 药 物 交 叉 耐 药 1976 年 Juliano 等 发 现 在 耐 药 细 胞 中 有 一 种 与 耐 药 程 度 成 数 量 相 关 的 高 分 子 量 细 胞 膜 蛋 白, 被 命 名 为 P 糖 蛋 白, 因 其 分 子 量 为 170 KD, 故 又 名 P170 糖 蛋 白 肿 瘤 细 胞 的 耐 药 性 可 分 为 原 发 性 耐 药 (intrinsic resistance) 和 获 得 性 耐 药 (acquired resistance), 前 者 在 化 疗 前 就 存 在 于 肿 瘤 细 胞 中, 与 药 物 的 使 用 无 关 ; 后 者 是 由 化 疗 药 物 诱 导 产 生 的, 即 在 药 物 使 用 前 对 药 物 敏 感, 而 在 药 物 应 用 后 产 生 的 耐 药 获 得 性 耐 药 根 据 耐 药 谱 不 同 可 分 为 原 药 耐 药 (primary drug resistance, PDR) 和 多 药 耐 药 (MDR) 原 药 耐 药 只 对 使 用 过 的 药 物 产 生 耐 药, 对 其 他 药 物 不 产 生 交 叉 耐 药, 而 多 药 耐 药 则 是 由 一 种 药 物 诱 发, 而 同 时 对 其 他 多 种 结 构 和 作 用 机 制 完 全 不 同 的 药 物 产 生 交 叉 耐 药, 导 致 一 些 联 合 化 疗 方 案 的 失 败 2 p170 的 多 药 耐 药 机 制 药 物 对 肿 瘤 细 胞 的 杀 伤 作 用, 依 赖 于 进 入 细 胞 内 的 药 物 浓 度 许 多 药 物 通 过 细 胞 膜 进 入 细 胞, 这 是 个 主 动 的 依 赖 能 量 的 过 程, 与 药 物 浓 度 梯 度 有 关 参 与 此 过 程 的 载 体 蛋 白 结 构 的 改 变, 可 导 致 细 胞 对 药 物 吸 收 的 减 少, 细 胞 内 有 效 药 物 浓 度 降 低, 其 后 果 就 细 胞 对 药 物 产 生 耐 药 性 对 氨 甲 喋 呤 (MTX) 转 运 的 研 究 认 为, 耐 药 性 的 产 生 可 由 于 药 物 与 细 胞 膜 结 合 载 体 蛋 白 的 亲 和 力 下 降, 或 者 细 胞 所 表 达 的 载 体 蛋 白 的 数 量 下 降 P170 糖 蛋 白 是 一 种 由 MDR-1 基 因 编 码 的 具 有 ATP 酶 活 性 的 跨 膜 泵, 当 肿 瘤 细 胞 与 抗 癌 药 物 接 触 时, 脂 溶 性 药 物 按 浓 度 梯 度 进 入 细 胞, 细 胞 内 部 有 2 个 药 物 结 合 位 点 和 2 个 ATP 结 合 位 点, 当 药 物 与 P 糖 蛋 白 结 合 后, 可 同 时 水 解 ATP 获 得 能 量, 将 药 物 从 细 胞 内 泵 出, 细 胞 内 药 物 浓 度 不 断 下 降, 使 药 物 对 细 胞 的 损 伤 减 弱 直 至 消 失, 最 终 出 现 耐 药 P 糖 蛋 白 对 药 物 的 特 异 性 很 小, 因 此 MDR 细 胞 能 对 许 多 结 构 和 作 用 机 制 不 同 的 药 物 产 生 耐 药 可 诱 导 P 糖 蛋 白 过 度 表 达 产 生 耐 药 的 药 物 有 蒽 环 类 长 春 新 碱 柔 红 霉 素 表 鬼 臼 毒 素 放 线 菌 素 D 和 紫 杉 醇 等, 这 些 药 物 一 般 是 天 然 来 源 的, 化 学 特 性 上 属 于 疏 水 性 当 这 些 药 物 诱 导 发 生 耐 药 时, 即 可 同 时 对 其 他 各 类 药 物 产 生 交 叉 耐 药 P170 糖 蛋 白 将 药 物 泵 出 细 胞 的 原 理 见 图 72

13 图 p170 糖 蛋 白 的 作 用 原 理 示 意 图 3 MDR-1 基 因 在 正 常 组 织 和 肿 瘤 细 胞 中 的 表 达 P 糖 蛋 白 存 在 于 许 多 正 常 人 体 组 织 如 肝 脏 结 肠 胰 脏 肾 脏 肾 上 腺 以 及 脑 睾 丸 胎 盘 中 P 糖 蛋 白 并 非 是 一 种 异 常 蛋 白, 而 是 具 有 一 定 的 生 理 保 护 功 能, 在 细 胞 的 正 常 防 御 中 起 着 不 可 忽 略 的 作 用 在 人 类 所 有 类 型 的 肿 瘤 中 几 乎 都 能 测 到 MDR-1, 在 肿 瘤 细 胞 中, MDR-1 基 因 的 表 达 与 肿 瘤 细 胞 的 组 织 起 源 有 关 如 果 某 些 组 织 细 胞 本 来 就 有 高 水 平 的 MDR-1, 这 些 细 胞 恶 变 后 往 往 也 有 高 水 平 MDR-1 表 达, 如 结 肠 癌 肝 癌 肾 细 胞 癌 等 临 床 上 这 类 肿 瘤 都 具 有 原 发 性 耐 药 性, 对 化 疗 的 反 应 性 低 如 果 组 织 细 胞 本 来 不 表 达 MDR-1 或 MDR-1 水 平 很 低, 恶 变 后 往 往 也 不 表 达 或 很 少 表 达 MDR-1, 如 卵 巢 癌 头 颈 部 癌 肺 癌 膀 胱 癌 等, 这 些 肿 瘤 的 化 疗 效 果 效 好, 但 大 多 会 发 生 获 得 性 耐 药 虽 然 正 常 造 血 细 胞 只 有 少 量 MDR-1 表 达, 但 是 在 几 乎 各 种 白 血 病 以 及 多 发 性 骨 髓 瘤 (MM) 非 霍 奇 金 淋 巴 瘤 (NHL) 中, 无 论 是 初 治 的 还 是 治 疗 过 的 病 例,MDR-1 水 平 都 有 不 同 程 度 升 高, 甚 至 在 一 些 患 者 中, 有 相 当 高 水 平 MDR-1 表 达 一 般 情 况 下, 肿 瘤 细 胞 在 治 疗 前 就 显 示 较 高 水 平 P 糖 蛋 白, 往 往 提 示 预 后 不 佳 MDR-1 阳 性 病 人 的 耐 药 性 发 生 率 远 远 高 于 MDR-1 阴 性 病 人 在 AML 病 人,MDR-1 表 达 增 加 常 预 示 完 全 缓 解 率 (CR) 低, 疾 病 易 复 发, 生 存 期 短 在 MM 病 人, 如 果 病 人 是 用 VAD 方 案 治 疗,P 糖 蛋 白 表 达 增 加 往 往 也 提 示 预 后 不 良 另 外, 在 肾 细 胞 癌 乳 腺 癌 食 管 癌 等 实 体 瘤 中,P 糖 蛋 白 的 表 达 也 与 耐 药 性 相 关 第 11 节 流 式 细 胞 术 参 数 的 质 量 控 制 流 式 细 胞 术 标 本 从 组 织 和 细 胞 的 获 取, 抗 体 的 染 色 和 洗 涤, 到 用 流 式 细 胞 仪 采 集 存 储 和 分 析 数 据, 并 给 出 报 告, 牵 涉 到 诸 多 步 骤 每 个 步 骤 中 均 存 在 着 不 稳 定 和 不 确 定 的 因 素, 流 式 细 胞 术 的 质 量 控 制 ( 质 控 ) 即 监 督 控 制 每 个 步 骤 中 的 这 些 因 素, 以 确 保 最 终 结 果 的 准 确 性 和 可 重 复 性 引 起 流 式 细 胞 术 参 数 可 变 性 的 因 素 可 分 为 四 类 : 流 式 细 胞 仪 的 可 变 性, 标 本 的 可 变 性, 操 作 过 程 的 可 变 性 ( 包 括 试 剂 和 方 法 ) 和 数 据 分 析 的 可 变 性 一 流 式 细 胞 仪 的 可 变 性 73

14 在 流 式 细 胞 仪 使 用 前, 需 充 分 了 解 其 状 态, 每 天 必 需 对 流 式 细 胞 仪 进 行 监 测 流 式 细 胞 仪 需 质 控 的 部 件 包 括 : 激 发 光 路 ( 包 括 激 光 器, 用 于 将 激 光 聚 焦 在 流 路 上 的 棱 镜 及 透 镜 ) 发 射 光 路 ( 包 括 用 于 将 不 同 波 长 的 发 射 光 引 导 至 不 同 的 光 检 测 器 的 透 镜 合 滤 片 ) 电 子 线 路 ( 包 括 光 检 测 器, 高 压 供 给 器, 放 大 器, 补 偿 线 路 及 模 数 转 换 器, 所 有 这 些 线 路 均 用 于 将 光 信 号 转 换 为 电 信 号, 然 后 再 转 换 为 数 字, 此 数 字 理 想 状 态 下 与 光 强 度 成 比 例 ) 流 路 系 统 ( 包 括 流 动 室, 样 品 流, 进 样 针 和 鞘 液 流, 用 于 将 样 本 细 胞 正 交 于 光 路 ) 第 一 步 为 仔 细 校 准 激 发 和 发 射 光 路, 使 得 细 胞 在 通 过 激 光 光 线 时 能 被 稳 定 地 激 发, 激 发 出 的 光 散 射 和 荧 光 信 号 准 确 地 集 中 于 光 检 测 器 校 准 不 好 时 会 导 致 信 号 的 CV( 变 异 系 数 ) 值 过 大, 背 景 光 散 射 ( 即 噪 音 ) 过 高, 最 终 的 表 现 为 仪 器 灵 敏 度 下 降 对 于 大 多 数 的 临 床 型 流 式 细 胞 仪 ( 如 FACSCalibur 和 EPICS XL 等 ), 仪 器 操 作 者 自 己 不 能 调 整 激 发 和 发 射 光 路 然 而 流 式 操 作 者 需 知 道 环 境 温 度 波 动 会 导 致 信 号 水 平 的 减 弱 和 CV 值 及 噪 音 水 平 的 增 高 激 光 的 老 化 也 可 能 引 起 输 出 电 压 的 不 稳 定, 对 细 胞 的 激 发 也 就 相 应 地 减 弱 因 激 光 的 强 度 对 于 荧 光 信 号 的 产 生 通 常 是 足 够 的 ( 即 处 于 饱 和 状 态 ), 所 以 激 光 器 老 化 最 敏 感 的 标 志 是 散 射 光 信 号 的 减 弱, 前 向 和 侧 向 散 射 光 信 号 会 与 激 光 强 度 同 比 下 降 当 激 光 信 号 降 低 到 一 定 程 度, 荧 光 信 号 也 会 下 降 光 路 的 校 准 需 在 电 子 线 路 稳 定 的 状 态 下, 用 散 射 信 号 和 荧 光 信 号 的 CV 值 均 很 小 的 微 球 调 准 所 有 检 测 器 的 输 出 均 以 信 号 强 度 ( 即 道 数 ) 和 信 号 宽 度 ( 即 CV 值 ) 两 组 数 据 记 录 过 去 的 流 式 细 胞 仪 允 许 用 户 自 行 调 整 流 动 室 和 光 路, 仪 使 信 号 强 度 达 到 最 大, 同 时 CV 值 最 小 新 型 流 式 细 胞 仪 不 允 许 用 户 干 预, 应 用 实 验 室 所 能 做 的 仅 是 用 流 式 细 胞 仪 特 有 的 软 件 分 析 质 控 微 球, 在 某 些 参 数 不 能 达 到 质 控 标 准 时, 联 系 生 产 厂 家 的 工 程 师 校 准 和 维 修 无 论 何 种 仪 器, 该 实 验 室 均 应 每 天 认 真 记 录 所 有 参 数 的 道 数 和 CV 值, 并 与 仪 器 处 于 最 佳 状 态 时 的 数 值 进 行 比 较, 以 了 解 仪 器 是 否 正 常 工 作 第 二 步 是 监 控 所 有 检 测 器 的 灵 敏 度 对 于 散 射 信 号 检 测 器, 其 检 测 阈 值 通 常 是 由 调 低 仪 器 的 阈 值 (Thresholds/Discriminators), 观 察 来 自 标 准 微 球 的 信 号 和 来 自 无 微 球 缓 冲 液 的 信 号 是 否 能 区 分 开 来 确 定 虽 然 此 法 也 可 用 来 评 价 机 器 的 荧 光 检 测 阈 值, 但 通 常 的 做 法 是 用 区 分 带 弱 荧 光 的 荧 光 微 球 与 无 荧 光 的 微 球 的 能 力 来 表 示 荧 光 检 测 阈 值, 具 体 方 法 为 分 析 含 有 各 种 荧 光 强 度 的 荧 光 微 球 及 空 白 微 球 的 混 合 微 球, 并 根 据 软 件 设 定 或 用 户 自 定 的 分 离 阈 值 来 判 定 仪 器 是 否 能 将 各 种 荧 光 强 度 区 分 开 来 如 果 空 白 微 球 的 背 景 荧 光 与 细 胞 的 背 景 荧 光 相 似, 可 以 得 知 仪 器 检 测 在 细 胞 背 景 荧 光 之 上 的 荧 光 的 能 力 但 因 为 各 种 细 胞 的 自 发 荧 光 差 别 很 大, 因 此 在 实 际 操 作 过 程 中, 用 空 白 微 球 来 判 定 检 测 细 胞 的 灵 敏 度 有 时 不 太 合 适 这 种 方 法 的 主 要 问 题 是 即 使 荧 光 微 球 的 荧 光 强 度 明 显 高 于 背 景 水 平, 但 如 果 机 器 的 CV 值 很 高, 则 灵 敏 度 的 判 定 能 力 会 显 著 下 降 荧 光 灵 敏 度 实 际 上 受 两 个 独 立 因 素 的 影 响, 即 背 景 光 或 仪 器 噪 音 水 平, 和 荧 光 激 发 和 检 测 效 率 因 此 要 获 得 准 确 的 灵 敏 度 指 标, 必 须 同 时 监 测 弱 荧 光 微 球 的 信 号 CV 值 和 仪 器 噪 音 水 平 第 三 步 是 监 控 仪 器 电 子 线 路 的 稳 定 性 为 了 能 将 某 个 实 验 室 在 某 天 得 到 的 数 字 结 果 与 其 他 实 验 室 在 某 天 得 到 的 结 果 相 比 较, 必 须 设 立 衡 量 荧 光 强 度 的 标 准, 方 法 为 使 用 含 有 若 干 个 能 覆 盖 所 有 荧 光 检 测 器 中 的 所 有 通 道 的 荧 光 微 球 混 合 物, 其 中 包 含 若 干 个 具 有 确 定 荧 光 强 度 ( 以 荧 光 等 量 单 位 表 示 ) 的 荧 光 微 球, 且 这 些 荧 光 强 度 是 不 连 续 的, 此 时 要 求 荧 光 微 球 的 峰 值 与 荧 光 等 量 单 位 成 线 性 关 系, 即 仪 器 的 光 电 倍 增 管 和 放 大 器 保 良 好 的 线 性 状 态 通 过 调 节 检 测 器 的 电 压, 使 荧 光 微 球 的 峰 值 固 定 在 某 个 荧 光 通 道 上, 并 记 录 检 测 器 的 电 压, 观 察 每 日 在 同 等 检 测 器 电 压 条 件 下, 荧 光 微 球 的 峰 值 是 否 会 发 生 改 变, 如 改 变, 有 没 有 超 过 允 许 范 围 ( 一 般 为 + 2SD) 另 一 种 监 控 仪 器 电 子 线 路 稳 定 性 的 方 法 是 使 用 标 准 化 的 荧 光 强 度, 以 标 准 化 单 位 报 告 结 74

15 果, 而 不 是 上 述 的 荧 光 通 道 数 或 相 对 荧 光 强 度 这 样 我 们 可 以 对 使 用 不 同 机 器 和 不 同 检 测 器 设 置 的 结 果 进 行 比 较 荧 光 强 度 标 准 化 的 最 大 问 题 是 荧 光 微 球 的 制 备 技 术, 荧 光 强 度 单 位 的 转 换 方 法 也 并 非 最 佳 不 同 厂 家 所 生 产 的 荧 光 微 球 上 的 荧 光 素 量 ( 或 可 溶 性 荧 光 素 的 分 子 等 量 物, 即 MESF) 不 尽 相 同, 即 使 均 为 同 一 厂 家 生 产, 不 同 批 号 间 也 会 存 在 差 异 另 外 一 种 标 准 化 的 方 法 是 使 用 带 已 知 数 目 免 疫 球 蛋 白 结 合 位 点 的 无 荧 光 微 球, 这 些 微 球 与 细 胞 同 时 被 荧 光 抗 体 染 色, 然 后 将 细 胞 的 荧 光 强 度 转 换 为 每 个 细 胞 上 的 抗 体 结 合 数 目 此 种 微 球 并 不 校 准 荧 光 强 度, 而 是 校 准 使 用 的 抗 体, 即 特 定 抗 体 染 色 后 所 得 的 荧 光 强 度 水 平 可 以 表 示 为 每 个 细 胞 上 结 合 抗 体 的 数 目 需 要 特 别 注 意 的 是 :1) 微 球 的 染 色 是 通 过 免 疫 球 蛋 白 ( 即 抗 体 ) 与 微 球 上 的 抗 免 疫 球 蛋 白 ( 即 免 疫 球 蛋 白 结 合 位 点 ) 的 结 合 而 完 成, 而 免 疫 球 蛋 白 与 微 球 的 亲 和 力 通 常 有 别 于 免 疫 球 蛋 白 与 细 胞 上 的 抗 原 的 亲 和 力, 因 此 两 者 的 等 同 会 存 在 一 些 问 题 ;2) 在 不 同 条 件 下, 免 疫 球 蛋 白 与 抗 原 或 其 他 免 疫 球 蛋 白 的 结 合 可 以 是 单 价 的, 也 可 以 是 多 价 的, 因 此 将 免 疫 球 蛋 白 与 微 球 的 结 合 同 免 疫 球 蛋 白 与 细 胞 的 结 合 等 同 起 来, 存 在 诸 多 变 数 ;3) 上 述 两 种 微 球 ( 即 荧 光 微 球 和 非 荧 光 微 球 ) 的 不 稳 定 性 是 非 常 重 要 的 影 响 因 素, 即 荧 光 微 球 的 荧 光 可 能 会 减 弱, 非 荧 光 微 球 表 面 的 免 疫 球 蛋 白 结 合 位 点 可 能 会 减 少, 均 会 导 致 结 果 判 断 的 失 误 总 而 言 之, 目 前 还 缺 乏 对 荧 光 强 度 进 行 标 准 化 的 金 标 准 因 为 信 号 的 道 数 值 可 通 过 调 节 光 电 倍 增 管 的 电 压 或 改 变 放 大 电 路 的 电 流 来 改 变, 因 此 下 面 的 几 点 考 虑 可 能 会 使 我 们 认 为 标 准 化 荧 光 强 度 是 不 必 要 的 1) 如 果 电 倍 增 管 或 放 大 器 并 非 完 全 线 性, 那 么 处 于 两 端 的 荧 光 道 数 不 与 原 始 荧 光 信 号 的 强 度 成 正 比 2) 由 于 不 同 颜 色 的 荧 光 间 存 在 着 颜 色 重 叠, 必 须 通 过 调 节 颜 色 补 偿 来 消 除 这 种 重 叠, 如 果 补 偿 不 准, 会 导 致 每 天 所 测 得 的 荧 光 绝 对 值 不 同 而 且 荧 光 间 的 颜 色 补 偿 还 会 因 所 处 介 质 的 不 同 而 改 变 另 外, 在 使 用 串 联 (tandem) 荧 光 染 料, 如 PE-Cy5, PE-TR 等 时, 补 偿 不 足 是 非 常 值 得 注 意 的 问 题 因 这 种 串 联 染 料 的 的 两 种 组 成 部 分 ( 供 体 荧 光 物 质 和 受 体 荧 光 物 质 ) 间 的 能 量 转 移 效 率 常 会 发 生 变 化, 也 就 是 说 两 组 成 部 分 间 的 距 离 可 能 增 大, 荧 光 信 号 不 能 很 好 地 有 传 至 受 体 荧 光 物 质, 导 致 串 联 染 料 漏 光 到 其 它 检 测 器 中, 引 起 颜 色 重 叠 的 增 大 这 种 能 量 转 移 效 率 还 会 因 所 结 合 地 抗 体 的 不 同 而 不 同, 与 抗 体 的 保 存 长 短 也 有 关 系 一 种 常 用 的 校 准 流 式 细 胞 仪 线 性 度 和 检 测 流 式 细 胞 仪 灵 敏 度 的 方 法 : 在 该 方 法 中 使 用 Sphero Rainbow Calibration Particles (8-peak) (Spherotech Inc., IL,USA, 目 录 号 为 RCP-30-5A), 这 是 一 种 空 白 微 球 和 7 种 具 有 不 连 续 荧 光 强 度 ( 由 弱 至 强 覆 盖 了 整 个 荧 光 通 道 ) 的 荧 光 微 球 ( 其 发 射 波 谱 为 nm, 可 覆 盖 常 用 流 式 细 胞 仪 的 各 个 检 测 通 道 ) 的 混 合 微 球, 微 球 直 径 为 3um 首 先 关 掉 仪 器 的 所 有 补 偿 设 置 通 过 改 变 光 电 倍 增 管 的 电 压 值 将 图 1 中 各 荧 光 检 测 通 道 中 的 第 6 个 峰 ( 即 M6) 分 别 调 至 表 1 中 所 示 的 荧 光 道 数 注 意 Beckton Dickinson 流 式 细 胞 仪 与 Beckman Coulter 流 式 细 胞 仪 的 荧 光 检 测 器 有 所 不 同, 前 者 的 第 三 荧 光 检 测 器 (FL3) 等 同 于 后 者 的 第 四 荧 光 检 测 器 (FL4), 其 它 两 个 荧 光 检 测 器 相 同 Beckton Dickinson(BD) 流 式 细 胞 仪 荧 光 检 测 通 道 荧 光 道 数 FL1 228 FL2 614 FL3 368 Beckman Coulter 流 式 细 胞 仪 荧 光 检 测 通 道 荧 光 道 数 FL FL FL 表 记 录 此 RCP-30-5A 时 每 个 峰 在 微 各 球 荧 中 光 的 检 第 测 6 通 个 峰 道 在 中 所 Beckman 测 得 的 Dickinson 平 均 荧 光 强 和 度 Beckman (Mean RFI), Coulter 并 流 填 式 入 Spherotech Inc. 所 提 供 的 细 Excel 胞 仪 的 计 各 算 荧 表 光 格 检 中 测 通 以 道 表 中 所 应 处 是 的 用 荧 于 光 分 道 析 数 FL2 检 测 通 道 的 表 格, 75

16 将 峰 M1 至 峰 M8 在 FL2 检 测 通 道 中 的 Mean RFI 填 入 相 应 的 位 置, 则 此 表 格 自 动 计 算 出 后 面 的 数 值 软 件 同 时 以 荧 光 道 数 (Channel, 总 道 数 为 256) 为 横 坐 标, 以 MEPE(molecules of equivalent PE, 等 量 PE 分 子 数 ) 的 对 数 (Log) 为 纵 坐 标 作 图, 经 过 线 性 回 归, 得 到 回 归 方 程 ( 如 图 ) 表 Spherotech Inc 线 性 回 归 计 算 表 格 PEAK Mean RFI Channel MEPE MEPE LOG CALC. RESIDUAL CALC. MEPE M M % 435 M % 1180 M % 3535 M % M % M % M % 从 该 表 中 可 得 出 比 较 重 要 的 参 数 为 : (1) r 2 : 相 关 系 数 (r) 的 平 方, 用 以 衡 量 线 性 回 归 的 好 坏, 此 值 需 大 于 0.95; (2) AvgRes%: 平 均 残 差 百 分 率 (Average residual percent), 是 衡 量 微 球 所 处 在 回 归 图 上 所 处 位 置 与 回 归 线 的 靠 近 程 度 的 重 要 参 数, 此 值 需 <5% 如 超 过 5%, 则 表 明 仪 器 的 对 数 放 大 器 为 非 线 性 ; (3)Logarithmic Decades: 表 示 对 数 放 大 器 的 总 体 动 态 范 围, 其 值 应 在 ; (4)Blank Threshold: 表 示 空 白 微 球 的 MEPE 值, 反 映 仪 器 的 灵 敏 度, 此 值 应 小 于 200 因 此 我 们 可 通 过 上 述 检 测 来 评 价 对 数 放 大 器 的 工 作 状 态, 即 线 性 度, 同 时 可 了 解 仪 器 的 灵 敏 度 如 果 上 述 四 个 参 数 中 的 任 何 一 个 不 在 允 许 范 围 内, 则 说 明 仪 器 的 状 态 不 好, 需 工 程 师 维 修 另 外,RCP-30-5A 的 8 种 微 球 必 须 能 在 FL1/FL2 双 参 数 直 方 图 中 明 显 地 区 分 开 来, 否 则 表 明 仪 器 的 灵 敏 度 不 够 满 意 电 子 线 路 中 的 颜 色 补 偿 线 路 可 通 过 下 面 的 两 个 步 骤 来 校 准 : 用 含 有 空 白 微 球 和 不 同 颜 色 的 荧 光 微 球 ( 如 FITC, PE, PE-TR, PE-Cy5 等 ) 的 混 合 微 球 来 测 试 补 偿 电 路 通 过 对 生 物 样 本 进 行 免 疫 分 型 检 测 来 验 证 补 偿 设 置 某 些 型 号 的 机 器 ( 如 Beckton Dickinson 的 FACS Calibur 和 Beckman Coulter 的 EPICS XL) 已 经 将 第 一 个 步 骤 软 件 化, 即 使 用 其 中 的 软 件 可 自 动 进 行 补 偿 设 置 软 件 可 以 准 确 地 调 整 荧 光 微 球 和 空 白 微 球 的 峰 信 号 位 置, 客 观 地 补 偿 设 置 但 通 过 微 球 调 节 所 得 的 补 偿 设 置 通 常 不 适 合 于 生 物 样 本 的 免 疫 分 型, 原 因 包 括 荧 光 微 球 中 荧 光 素 的 掺 入 不 同 于 荧 光 素 标 记 抗 体 与 细 胞 的 结 合 ; 每 个 细 胞 上 的 抗 原 量 是 不 同 的 ; 使 未 染 色 细 胞 和 使 空 白 微 球 处 于 较 低 荧 光 道 数 所 需 的 电 压 值 不 同 因 此 在 分 析 生 物 样 本 时, 需 确 认 或 重 新 调 节 补 偿 上 述 质 控 步 骤 所 得 的 结 果, 包 括 峰 值,CVs, PMT( 光 电 倍 增 管 ) 电 压, 增 益 (Gain), 及 补 偿 值 等 均 需 记 录 下 来, 并 定 期 对 比, 计 算 平 均 值 和 标 准 差 (SD) 正 常 的 标 准 差 可 通 过 在 机 器 处 于 最 佳 状 态 下 连 续 几 天 多 次 分 析 而 确 定 如 果 在 某 一 天 出 现 上 述 的 任 何 参 数 值 超 出 用 户 所 设 定 的 标 准 差 限, 所 得 结 果 需 做 特 殊 标 记 并 校 准 机 器 可 喜 的 是, 目 前 Beckman Coulter 的 流 式 细 胞 仪 已 经 配 备 了 自 动 质 控 程 序, 程 序 可 自 动 记 录 使 用 质 控 微 球 时 所 获 得 的 各 种 参 数, 并 能 自 动 绘 制 参 数 表 格 和 Levey-Jennings 质 控 图 ( 如 图 ), 使 用 户 能 方 便 的 观 察 每 日 的 参 数 变 化, 及 早 跟 踪 异 常 情 况 76

17 Levey-Jennings 质 控 图 例 %( 百 分 率 ) 日 期 图 使 用 荧 光 校 准 微 球 在 流 式 细 胞 仪 的 第 一 荧 光 通 道 (FL1) 所 检 测 到 的 峰 CV 值 横 坐 标 为 检 测 的 日 期, 共 检 测 30 天, 总 坐 标 为 CV 值 ( 以 % 表 示 ) 可 见,CV 值 每 天 均 会 有 所 改 变, 如 果 某 天 CV 值 超 出 允 许 范 围 ( 用 户 自 定 或 软 件 设 定 ), 则 表 明 仪 器 状 态 不 好, 需 调 试 其 实, 最 容 易 引 起 质 控 失 败 的 是 流 式 细 胞 仪 流 路 的 紊 乱 当 仪 器 一 个 或 多 个 参 数 出 现 质 控 失 败, 首 先 应 检 查 仪 器 的 流 路 是 否 正 常, 然 后 再 去 调 整 光 路 和 检 测 线 路 液 体 管 路 的 部 分 堵 塞 即 会 严 重 干 扰 信 号, 使 得 背 景 噪 音 水 平 散 射 光 和 荧 光 信 号 的 CV 值 均 明 显 升 高, 这 些 因 素 导 致 从 背 景 噪 音 中 所 能 区 分 出 的 荧 光 分 子 数 下 降, 也 就 是 说 仪 器 的 检 测 灵 敏 度 降 低 另 外 一 个 引 起 流 路 改 变 的 原 因 为 样 本 的 流 速 如 果 样 本 细 胞 被 过 快 地 压 入 并 通 过 流 动 室, 样 本 的 核 心 区 会 变 宽, 导 致 细 胞 上 的 光 散 射 出 现 差 异, 信 号 的 CV 值 则 相 应 增 大 此 外, 当 样 本 通 过 流 动 室 时 的 速 度 过 快, 在 某 一 时 间 点, 流 式 细 胞 仪 会 同 时 检 测 到 两 个 或 多 个 细 胞, 引 起 信 号 CV 值 的 增 加 二 标 本 的 可 变 性 1 标 本 的 采 集 和 固 定 方 法 的 质 量 控 制 标 本 的 采 集 质 量 直 接 影 响 是 否 能 制 备 出 一 个 合 格 样 品, 单 细 胞 样 品 制 备 的 良 劣, 直 接 影 响 流 式 检 测 精 度 和 实 验 结 果, 标 本 采 集 是 十 分 重 要 的 环 节, 在 标 本 的 采 集 过 程,(1) 手 术 切 除 的 新 鲜 标 本 或 活 检 针 吸 标 本 取 材 时, 要 避 免 出 血 坏 死 组 织 ;(2) 标 本 采 集 后 要 及 时 固 定 可 深 低 温 保 存, 以 免 组 织 发 生 自 溶,DNA 降 解, 而 造 成 测 试 结 果 的 误 差 ;(3) 固 定 剂 要 采 用 对 组 织 细 胞 穿 透 性 强 的 浓 度, 例 如 70% 的 乙 醇 固 定 比 75% 以 上 的 浓 度 固 定 效 果 好, 高 浓 度 的 乙 醇 常 造 成 细 胞 表 面 快 速 形 成 一 个 蛋 白 膜, 致 使 细 胞 内 的 物 质 固 定 不 良, 有 作 者 分 析 研 究 了 自 溶 对 DNA 测 定 的 影 响, 发 现 自 溶 的 组 织 细 胞 常 出 现 假 性 异 倍 体, 且 不 固 定 的 组 织 细 胞 随 时 间 的 延 长,DNA 信 号 呈 梯 度 降 低, 根 据 检 测 的 目 的, 选 择 什 么 类 型 的 固 定 剂, 对 流 式 检 测 质 量 也 有 显 著 的 影 响, 例 如 细 胞 DNA 的 分 析, 使 用 醇 类 固 定 剂 较 好 而 不 选 择 醛 类 固 定 剂, 醛 类 固 定 剂 明 显 影 响 细 胞 DNA 荧 光 发 射 强 度, 补 给 证 明, 醛 类 固 定 剂 对 插 入 性 荧 光 染 料 与 核 酸 的 结 合 有 很 强 的 干 扰 作 用, 其 荧 光 强 度 仅 相 当 于 新 鲜 组 织 荧 光 强 度 的 50%~70% 左 右, 如 果 作 流 式 免 疫 研 究 工 作, 采 用 新 鲜 组 织 是 最 好 的 选 择, 在 不 能 及 时 检 测 又 没 有 低 温 保 存 条 件 时, 要 根 据 所 测 物 质 在 细 胞 内 还 是 在 细 胞 膜 表 面, 在 膜 表 面 的 抗 原 物 质, 以 醛 类 固 定 剂 为 宜, 尽 管 醛 类 固 定 剂 产 生 的 非 特 异 性 荧 光 较 强, 但 不 宜 采 用 醇 类 固 定 剂, 因 醇 类 固 定 剂 可 使 细 胞 表 面 的 糖 蛋 白 脂 蛋 白 脱 落 丢 失, 失 去 标 记 的 位 点, 如 所 测 抗 原 物 质 在 细 胞 内, 可 以 使 77

18 用 醇 类 固 定 剂, 这 种 固 定 方 法 简 便 易 行, 无 需 特 殊 低 温 冷 条 件, 在 一 般 冰 箱 (0~4 ) 放 置 即 可, 能 很 好 的 保 持 细 胞 形 态 和 生 物 化 学 成 分 不 发 生 变 性 2 单 细 胞 悬 液 制 备 的 质 量 控 制 流 式 细 胞 术 定 量 分 析 是 基 于 单 细 胞 基 础 上 的, 这 是 流 式 细 胞 术 带 来 的 特 殊 要 求, 在 应 用 流 式 细 胞 术 中, 制 备 出 合 格 的 单 分 散 细 胞 悬 液 对 流 式 分 析 的 成 败 与 否 是 关 键 的 一 环, 因 此, 对 于 了 解 掌 握 人 体 各 类 组 织 的 单 分 散 细 胞 悬 液 的 制 备 方 法 尤 为 重 要 (1) 人 体 的 末 梢 血 液 和 骨 髓 细 胞 及 淋 巴 组 织, 是 人 体 组 织 中 缺 乏 细 胞 间 连 结 装 置 的 组 织, 尤 其 是 血 和 骨 髓 细 胞 是 天 然 的 单 分 散 细 胞 的 材 料, 其 中 的 细 胞 成 分 在 生 理 状 态 下 呈 单 分 散 状 态, 它 是 流 式 分 析 最 合 适 的 样 品 来 源, 全 血 中 含 有 多 种 有 形 成 分, 流 式 细 胞 检 测 是 以 某 一 群 细 胞 为 检 测, 因 此 检 测 前 须 将 所 测 的 某 群 细 胞 成 分 分 离 出 来, 例 如, 以 淋 巴 细 胞 DNA 定 量 分 析 为 例, 就 须 把 淋 巴 细 胞 分 离 出 来, 而 将 其 他 有 核 心 细 胞 或 红 细 胞 去 除, 对 于 血 小 板 的 分 析 样 品 制 备 过 程 中 须 防 止 过 高 离 心 速 度 造 成 血 小 板 膜 的 损 伤, 出 现 血 小 板 凝 集 (2) 新 鲜 实 体 组 织 单 细 胞 样 品 的 制 备, 实 体 组 织 是 流 式 分 析 工 作 的 主 要 材 料 来 源, 但 对 其 分 散 单 细 胞 样 品 的 技 术 和 方 法, 仍 存 在 着 很 多 问 题, 仍 需 大 量 的 探 索 工 作, 就 目 前, 国 内 外 对 实 体 组 织 分 散 单 细 胞 还 没 有 找 到 一 个 适 用 的 又 通 用 方 法 处 理, 甚 至 同 样 组 织, 用 于 不 同 的 实 验 目 的, 就 需 要 不 同 的 方 法 处 理, 或 者 每 一 种 组 织 就 是 一 个 单 独 的 问 题, 因 此 必 须 根 据 实 际 情 况, 去 选 择 合 适 有 效 的 单 分 散 方 法, 选 用 的 方 法 必 须 达 到 细 胞 产 量 高, 细 胞 损 伤 小 的 目 标, 但 实 际 工 作 中 达 到 这 个 目 标 是 困 难 的, 多 年 来, 对 于 实 体 组 织 的 分 散 解 聚 多 采 用 酶 学 法, 化 学 法 机 械 物 理 方 法 以 及 低 渗 脱 核 方 法 等, 根 据 各 种 组 织 的 特 点, 以 及 实 验 目 的 的 不 同, 可 选 择 不 同 的 方 法 1 选 择 酶 学 方 法 时, 应 注 选 择 使 用 酶 类 型 的 问 题, 含 有 大 量 结 缔 组 织 的 组 织 器 官, 选 择 胶 原 酶 好, 不 宜 选 择 胃 蛋 白 酶 或 胰 酶, 并 要 注 意 酶 的 活 性 条 件 和 影 响 因 素, 要 注 意 酶 的 溶 剂, 消 化 时 间,pH 值, 浓 度 等 方 面 对 酶 活 性 的 影 响, 酶 学 方 法 分 散 组 织 都 有 一 定 的 应 用 限 制, 特 异 用 于 流 式 免 疫 荧 光 实 验 时, 酶 处 理 可 能 改 变 或 丢 失 膜 的 抗 原 成 分, 从 而 影 响 分 析 结 果, 由 于 酶 学 方 法 分 散 下 来 的 细 胞 产 量 低, 用 组 织 较 多, 还 要 注 意 酶 的 纯 度, 活 性 单 位, 以 及 生 产 厂 家 对 酶 的 污 染 2 化 学 方 法 往 往 单 独 应 用 分 散 组 织 效 果 不 理 想, 应 与 酶 学 方 法 综 合 使 用, 分 散 效 果 更 佳 3 机 械 方 法, 常 采 用 剪 碎, 网 搓 研 磨, 细 针 抽 吸 等, 对 细 胞 损 伤 大, 产 生 的 细 胞 碎 片 多, 细 胞 团 块 多, 在 使 用 机 械 方 法 时, 要 给 于 组 织 适 当 的 压 力, 这 种 适 当 的 压 力 需 要 有 较 多 的 制 样 实 践 经 验 技 术 人 员 来 操 作 4 低 渗 方 法 其 溶 液 是 一 种 低 渗 液 体, 造 成 细 胞 膜 的 破 坏, 使 细 胞 核 自 行 释 放 出 来, 是 一 个 裸 核 悬 液 样 品, 本 方 法 简 便, 可 以 改 变 样 品 的 变 异 系 数, 但 要 避 免 脱 核 时 间 过 长, 造 成 核 膨 胀 碎 裂 以 上 几 种 方 法 是 目 前 对 实 体 组 织 解 聚 常 用 的 方 法, 往 往 不 是 单 用, 常 常 是 一 种 或 二 种 方 法 的 结 合 使 用, 总 的 来 说, 对 实 体 组 织 分 散 为 单 细 胞 还 存 在 很 多 困 难, 因 此 还 需 要 深 入 探 讨 流 式 样 品 的 制 备 技 术, 制 备 出 完 整 细 胞 产 量 高, 细 胞 损 伤 小 的 合 格 悬 液, 获 得 更 好 的 流 式 检 测 结 果 (3) 石 蜡 包 埋 组 织 单 细 胞 制 备 的 质 量 控 制 石 蜡 包 埋 组 织 用 于 流 式 细 胞 术 的 定 量 研 究 极 大 的 扩 大 了 流 式 细 胞 术 应 用 范 围, 石 蜡 包 埋 组 织 单 细 胞 悬 液 制 备 技 术, 对 于 流 式 细 胞 术 来 说 是 重 要 技 术 的 进 展 之 一, 它 推 动 了 流 式 分 析 DNA 含 量 的 广 泛 应 用, 该 方 法 的 建 立, 结 束 了 流 式 只 能 对 新 鲜 组 织 定 量 分 析 的 时 代, 尤 其 78

19 是 对 肿 瘤 的 组 织, 使 大 量 存 档 的 肿 瘤 标 本 得 以 进 行 流 式 定 量 研 究, 并 能 结 合 肿 瘤 病 人 预 后 资 料 进 行 回 顾 性 研 究, 使 传 统 病 理 形 态 学 提 高 到 分 子 病 理 学 的 水 平, 从 肿 瘤 病 理 学 的 定 性 诊 断 推 进 到 定 量 诊 断 的 新 阶 段 1 石 蜡 包 埋 组 织 标 本 的 材 料 选 择, 应 经 病 理 医 师 仔 细 检 查, 选 取 无 自 溶, 坏 死 的 组 织 对 肿 瘤 组 织 标 本, 选 取 含 肿 瘤 组 织 细 胞 丰 富 的 区 域, 且 经 病 理 形 态 或 细 胞 学 核 实 病 理 诊 断 2 切 取 适 当 厚 度 的 石 蜡 组 织 片, 大 量 研 究 证 明, 切 取 40~50um 厚 度 的 切 片 是 适 宜 的, 过 厚 的 组 织 片 消 化 费 时, 消 化 下 来 的 细 胞 数 少, 过 薄 的 切 片 可 产 生 大 量 的 细 胞 碎 片, 影 响 检 测 结 果, 使 肿 瘤 异 倍 体 的 检 出 率 减 少, 我 们 研 究 了 石 蜡 切 片 不 同 厚 度 (5,10,20,30,40, 50un) 对 流 式 分 析 DNA 影 响, 发 现 较 薄 的 切 片 造 成 碎 片 较 多, 噪 音 增 加, 组 方 图 基 线 提 高, 影 响 倍 体 分 析 的 精 度 3 在 组 织 脱 蜡 的 过 程 中, 一 定 将 蜡 脱 净, 残 留 的 石 蜡 可 影 响 酶 的 消 化 活 性 ; 检 查 是 否 将 蜡 脱 净 的 方 法 是 弃 去 二 甲 苯 (Hedley 强 调 用 Histoclear, 即 组 织 清 洗 剂 代 替 二 甲 苯 脱 蜡, 效 果 更 好 ), 加 入 100% 乙 醇, 如 果 无 絮 状 物 浮 起, 视 蜡 已 脱 净 4 梯 度 酒 精 (100% 70% 50%) 水 化 要 充 分, 使 组 织 还 原 到 与 新 鲜 组 织 相 似 的 状 态 5 消 化 酶 液 要 掌 握 适 当 的 浓 度 ph 值 温 度 等, 不 造 成 酶 的 活 性 降 低 为 宜, 消 化 时 间 很 重 要, 时 间 短 细 胞 消 化 不 下 来, 时 间 长, 消 化 下 来 的 细 胞 又 被 破 化, 在 制 备 石 蜡 包 埋 单 细 胞 时, 常 规 使 用 0.5% 胃 蛋 白 酶 ph1.5 6 石 蜡 包 埋 组 织 的 单 细 胞 制 备 方 法 的 建 立, 使 流 式 细 胞 术 在 医 学 研 究 中 得 到 更 广 泛 的 应 用, 但 仍 在 一 些 问 题 有 待 进 一 步 解 决, 主 要 存 在 问 题 如 下 ⅰ 样 品 中 的 碎 片 较 多, 所 测 得 的 DNA 组 方 图 质 量 不 及 新 鲜 组 织 好, 组 方 图 的 峰 位 较 宽 CV 会 值 偏 大 ⅱ 异 倍 体 率 减 少, 由 于 组 方 图 细 胞 峰 CV 值 较 大, 一 些 近 于 二 倍 体 的 DNA 异 倍 体 峰 被 掩 盖 ⅲ S 期 细 胞 百 分 比 不 如 新 鲜 组 织 的 S 期 计 算 精 确,S 期 细 胞 的 计 算 偏 高, 这 仍 然 与 CV 值 较 大 有 关 ⅳ DNA 二 倍 体 标 准 不 稳 定,Schutter 等 发 现 用 新 鲜 正 常 组 织 的 二 倍 体 细 胞 或 者 用 其 他 生 物 细 胞 DNA 含 量 ( 例 如, 鸡 红 细 胞, 鳟 鱼 血 细 胞 等 ) 作 为 石 蜡 包 埋 组 织 细 胞 DNA 含 量 的 标 准 不 适 用, 石 蜡 包 埋 组 织 比 新 鲜 组 织 细 胞 DNA 荧 光 强 度 低, 且 样 品 间 的 荧 光 强 度 不 稳 定, 解 决 DNA 二 倍 体 标 准 不 稳 定 的 办 法, 可 将 正 常 组 织 与 肿 瘤 组 织 作 为 一 个 内 标 的 二 倍 体 标 准 参 照, 可 减 少 DNA 倍 体 分 析 的 误 差, 对 存 档 中 的 石 蜡 包 埋 组 织 材 料, 可 以 采 用 正 常 组 织 石 蜡 包 埋 标 本, 作 为 一 个 外 参 的 二 倍 体 标 准, 但 要 求 采 用 有 外 参 二 倍 体 样 品 和 肿 瘤 样 品 中 加 入 标 准 样 品 ( 例 如 鸡 血 细 胞 等 ) (4) 脱 落 细 胞 样 品 的 采 集 脱 落 细 胞 样 品 的 采 集 要 保 证 足 够 的 细 胞 数, 在 临 床 实 际 工 作 中, 可 以 收 集 到 大 量 自 然 脱 落 的 细 胞 标 本, 这 些 细 胞 标 本 经 简 单 处 理 后, 即 可 得 到 较 好 的 单 分 散 细 胞, 例 如 胸 腹 水, 内 镜 刷 检 细 胞, 膀 胱 冲 洗 液 等, 这 些 材 料 得 到 的 流 式 检 测 结 果, 要 小 心 谨 慎 的 分 析 解 释 结 果 的 生 物 学 意 义, 因 这 些 材 料 获 得 的 结 果 常 出 现 阴 性 或 假 阳 性 结 果, 因 其 中 的 白 细 胞 常 有 变 性, 且 样 品 细 胞 数 量 少, 制 备 出 一 个 合 格 的 单 细 胞 样 品, 其 细 胞 数 要 求 在 /ml, 其 杂 质 碎 片 团 块 重 叠 细 胞 应 小 于 2% 以 下, 否 则 应 放 弃 检 测, 对 肿 瘤 细 胞 DNA 异 倍 体 的 分 析 样 品 中, 至 少 应 有 20% 的 肿 瘤 细 胞 存 在,( 因 占 主 峰 1/5 以 上 的 异 倍 体 峰 才 可 确 认 异 倍 体 ) 三 操 作 过 程 的 可 变 性 79

20 主 要 包 括 试 剂 和 方 法 单 细 胞 悬 液 样 品 荧 光 染 色 对 流 式 定 量 分 析 的 精 度 很 重 要, 目 前 常 使 用 的 荧 光 染 料 有 EB.PI.DAPI.AO.FITC.PE 等, 对 细 胞 染 色 时 应 特 别 注 意 染 料 的 特 性 及 量 效 关 系, 定 量 细 胞 学 荧 光 染 色 易 受 到 多 种 因 素 的 影 响, 以 致 造 成 不 正 确 的 测 定 结 果, 了 解 荧 光 染 色 的 影 响 因 素, 将 有 助 于 在 荧 光 定 量 细 胞 学 分 析 中, 尽 可 能 避 免 测 量 误 差, 并 进 行 有 效 的 校 正 措 施, 如 下 的 一 些 常 见 影 响 因 素 需 特 别 注 意 1 温 度 对 荧 光 染 色 强 度 的 影 响 在 一 般 情 况 下, 环 境 温 度 的 升 高 对 荧 光 染 色 有 明 显 的 影 响, 温 度 升 高 可 造 成 溶 液 粘 滞 性 增 加, 溶 剂 和 荧 光 染 料 分 子 的 动 力 增 大, 使 荧 光 猝 灭 的 可 能 性 增 加, 这 就 使 荧 光 分 子 和 其 他 分 子 之 间 的 相 互 碰 撞 几 率 增 加, 因 此, 影 响 了 荧 光 分 子 发 光 量 子 产 额, 一 般 认 为, 温 度 升 高 时, 荧 光 减 弱, 荧 光 减 弱 的 百 分 比 称 温 度 系 数, 就 一 般 荧 光 物 质 而 言, 温 度 系 数 大 约 为 1%, 如 果 温 度 在 20 时, 一 般 荧 光 染 料 即 出 现 温 度 猝 灭 效 应, 随 温 度 的 升 高, 荧 光 猝 灭 作 用 越 强, 以 致 造 成 完 全 猝 灭, 温 度 在 20 以 下, 荧 光 分 子 发 光 量 子 产 额 的 变 化 不 明 显, 基 本 上 保 持 恒 量, 因 此 在 荧 光 测 定 时 要 保 持 染 色 后 的 样 品 适 当 低 温 环 境 下 进 行, 尽 可 能 减 少 样 品 的 照 射 时 间, 有 条 件 时, 应 使 样 品 观 察 室 做 到 恒 温 装 置, 会 得 到 更 好 的 荧 光 定 量 结 果 2 荧 光 染 色 的 浓 度 与 荧 光 发 射 强 度 有 直 接 比 例 关 系 在 溶 液 较 稀 时, 荧 光 强 度 与 浓 度 成 正 比 关 系, 随 浓 度 加 大, 荧 光 强 度 也 增 大, 当 荧 光 染 料 达 到 一 定 浓 度 时, 如 继 续 增 加 浓 度 不 仅 不 会 使 荧 光 强 度 有 相 应 的 增 加, 反 而 使 荧 光 强 度 减 低, 这 种 因 染 料 浓 度 增 大 使 荧 光 量 子 的 的 产 额 下 降 的 现 象 称 为 浓 度 猝 灭 现 象, 因 此 在 研 究 浓 度 与 荧 光 强 度 关 系 时, 必 须 检 查 所 得 的 荧 光 值 是 曲 线 高 峰 前 的 浓 度, 还 是 曲 线 高 峰 后 的 浓 度 ( 方 法 是 减 少 溶 液 浓 度, 如 荧 光 减 弱 则 为 高 峰 前 浓 度 ) 浓 度 造 成 荧 光 猝 灭 原 因, 主 要 是 缔 合 分 子 形 成, 缔 合 分 子 中 的 电 子 共 振 作 用, 而 消 耗 了 激 发 分 子 的 能 量 而 参 与 猝 灭 作 用, 实 验 表 明, 当 溶 液 稀 释 后, 荧 光 染 料 分 子 之 间 的 相 互 作 用 完 全 消 失 时, 荧 光 量 子 产 额 最 大, 荧 光 强 度 发 射 最 强, 当 溶 液 浓 度 增 加 时, 荧 光 分 子 之 间 发 生 碰 撞 下 降, 另 一 个 主 要 原 因 由 于 荧 光 染 料 浓 度 增 加 过 大 时, 造 成 荧 光 分 子 不 均 匀 分 布, 靠 近 入 射 光 面 的 吸 光 强, 而 进 入 溶 液 深 层 时, 光 吸 收 越 少, 发 出 的 荧 光 分 子 也 越 少, 称 这 种 内 滤 光 效 应 (Interfilter Effect), 鉴 于 荧 光 染 料 浓 度 对 荧 光 强 度 的 最 广 泛 之 大, 因 此 要 选 择 最 合 适 的 浓 度, 对 于 荧 光 强 度 定 量 检 测 技 术 是 极 其 重 要 的 3 ph 值 对 荧 光 强 度 发 射 强 度 的 影 响 荧 光 分 子 在 溶 剂 中 处 于 离 子 状 态, 因 此 溶 液 中 的 氢 离 子 的 浓 度 对 荧 光 强 度 影 响 极 大, 荧 光 分 子 发 光 的 最 有 利 条 件 是 其 在 溶 剂 中 呈 离 子 化 或 极 化 状 态, 从 而 通 过 染 料 分 子 本 身 所 具 有 听 斥 力 作 用 尽 可 能 避 免 分 子 之 间 的 相 互 碰 撞 作 用, 每 一 种 荧 光 分 子 的 发 光 量 的 产 额 最 高, 都 有 自 己 合 适 的 ph 值 4 其 他 一 些 影 响 强 度 的 因 素 像 醛 类 固 定 剂 ( 戊 二 醛, 甲 醛 ), 可 以 干 扰 荧 光 染 料 与 核 酸 分 子 的 结 合, 像 溶 剂 中 的 一 些 不 发 光 的 物 质 ( 如 溴 化 物 碘 化 物, 氨 基 酸, 硝 基 苯, 铁, 银 离 子 等 ) 均 可 造 成 荧 光 的 猝 灭 现 象 以 上 影 响 荧 光 染 色 的 因 素, 在 FCM 技 术 测 量 某 种 物 质 含 量 时, 需 对 能 够 影 响 荧 光 染 色 的 因 素 作 仔 细 的 检 查, 一 旦 在 荧 光 实 验 技 术 过 程 中 出 现 误 差, 必 须 根 据 一 定 的 条 件 进 行 综 合 分 析, 采 取 相 应 的 校 正 措 施 80

21 四 数 据 分 析 的 可 变 性 流 式 细 胞 仪 的 检 测 结 果 以 一 长 串 简 单 的 二 进 制 数 字 纪 录 在 计 算 机 的 文 件 中, 如 何 准 确 的 客 观 的 分 析 这 些 数 字 是 计 算 机 软 件 所 应 具 备 的 基 本 功 能 使 用 这 些 软 件 首 先 应 该 提 出 特 定 的 问 题, 然 后 在 软 件 的 帮 助 下 解 决 问 题, 并 以 流 式 所 特 有 的 形 式 表 达 出 来 如 果 我 们 的 问 题 是 表 达 某 种 蛋 白 的 细 胞 所 占 的 百 分 率?, 那 么 我 们 在 数 据 分 析 时 首 先 应 当 选 定 这 群 特 定 的 细 胞, 在 流 式 细 胞 术 中 称 为 设 门 (Gating) 这 个 过 程 也 成 为 流 式 数 据 分 析 中 的 第 一 个 可 变 因 素 细 胞 可 以 根 据 其 特 定 的 前 向 散 射 光 和 侧 向 散 射 光 特 征 来 设 定, 设 定 淋 巴 细 胞 最 常 用 的 方 法 即 是 如 此 然 而 根 据 散 射 光 特 性 来 设 门 是 非 常 主 观 的 因 为 我 们 至 今 仍 不 十 分 清 楚 细 胞 被 激 活 或 浸 润 组 织 后, 散 射 光 特 性 的 改 变 模 式, 同 时 我 们 不 能 象 荧 光 信 号 一 样 对 散 射 光 信 号 进 行 很 好 的 质 控 所 以 目 前 比 较 公 认 的 方 法 是 用 一 个 荧 光 参 数 辅 助 一 个 散 射 光 参 数 来 进 行 设 门, 通 常 情 况 下, 这 个 荧 光 参 数 来 自 荧 光 标 记 的 CD45 抗 体 因 为 CD45 在 不 同 的 白 细 胞 亚 群, 不 同 的 发 育 成 熟 阶 段 的 表 达 量 有 差 异, 因 此 侧 向 散 射 光 /CD45 双 参 数 设 门 方 案 已 被 广 泛 地 应 用 于 CD4 绝 对 计 数 时 淋 巴 细 胞 群 的 设 定 ( 淋 巴 细 胞 的 CD45 强 表 达, 侧 向 散 射 光 较 低 ) 和 白 血 病 患 者 骨 髓 标 本 中 原 始 细 胞 的 界 定 ( 原 始 细 胞 上 CD45 弱 表 达, 侧 向 散 射 光 与 淋 巴 细 胞 相 近 ) 数 据 分 析 时 的 第 二 个 可 变 因 素 为 如 何 确 定 阳 性 细 胞 和 阴 性 细 胞 的 分 界 线 通 常 的 做 法 是 用 一 个 阴 性 标 本 作 为 参 照, 这 就 要 求 准 确 合 理 的 选 择 阴 性 标 本 阴 性 标 本 可 以 是 未 染 色 细 胞, 也 可 以 是 经 同 型 对 照 抗 体 染 色 的 细 胞 ( 在 实 际 操 作 过 程 中, 多 选 择 后 者 ), 因 此 同 型 对 照 的 选 择 是 所 有 可 变 因 素 的 根 源 然 而, 要 找 倒 非 常 匹 配 于 实 验 中 所 用 的 每 种 抗 体 的 同 型 对 照 通 常 来 说 不 很 容 易 另 外, 如 果 不 同 实 验 室 所 用 的 阴 性 对 照 不 同, 则 他 们 所 确 定 的 阴 性 细 胞 和 阳 性 细 胞 的 分 界 线 也 不 同, 导 致 所 得 到 的 阳 性 百 分 率 结 果 出 现 差 异 即 使 所 用 的 阴 性 对 照 非 常 合 适, 确 定 阴 性 / 阳 性 的 分 界 线 也 是 有 所 不 同 有 人 认 为 应 该 将 分 界 线 定 在 假 阳 性 率 ( 即 在 阳 性 细 胞 区 的 阴 性 细 胞 百 分 率 ) 为 1-2% 处, 而 有 人 则 认 为 应 在 假 阳 性 率 为 5% 左 右 处 如 果 要 检 测 的 细 胞 抗 原 表 达 量 较 高 ( 如 CD3, CD4 等 ), 结 合 的 荧 光 抗 体 也 相 应 较 多, 这 样 阳 性 细 胞 的 荧 光 强 度 会 明 显 高 于 阴 性 细 胞, 此 时 采 用 上 述 何 种 分 界 原 则 对 结 果 的 影 响 不 大 但 如 果 要 检 测 的 细 胞 抗 原 表 达 量 较 少 或 很 少 ( 如 CD62p,CD95 等 ), 染 色 后 阳 性 细 胞 区 会 阴 性 细 胞 区 部 分 或 大 部 分 重 叠, 此 时 分 界 原 则 不 同, 结 果 会 有 较 大 的 差 异 事 实 上, 在 出 现 阳 性 细 胞 区 会 阴 性 细 胞 区 重 叠 时, 尤 其 对 于 白 血 病 / 淋 巴 瘤 免 疫 分 型, 我 们 应 该 考 虑 使 用 阳 性 百 分 率 来 分 析 结 果 是 否 合 适, 在 这 种 情 况 下, 我 们 经 常 会 采 用 寻 找 表 达 异 常 抗 原 组 合 和 异 常 抗 原 量 的 特 殊 细 胞 群, 以 确 定 白 血 病 / 淋 巴 瘤 的 类 型, 而 不 关 心 这 些 特 殊 细 胞 的 百 分 率, 因 此 将 细 胞 的 荧 光 标 记 强 度 与 带 有 标 准 荧 光 强 度 的 微 球 进 行 比 较, 在 此 时 显 得 尤 为 重 要 此 外, 用 流 式 进 行 白 血 病 / 淋 巴 瘤 的 免 疫 分 型, 已 经 从 传 统 的 报 告 数 字 结 果 过 渡 到 基 于 二 维 或 轮 廓 图 (contour plot) 的 模 式 识 别, 即 人 们 不 再 关 注 表 达 某 种 抗 原 ( 如 CD19, CD33, CD34 等 ) 的 细 胞 百 分 率 为 多 少, 而 是 更 注 重 通 过 多 参 数 分 析 来 确 定 是 否 存 在 异 常 细 胞 群 体 虽 然 室 间 质 控 可 以 保 证 不 同 的 实 验 室 对 统 一 标 本 得 到 相 同 的 结 果 但 对 于 白 血 病 / 淋 巴 瘤 的 模 式 识 别, 因 任 意 两 个 患 者 的 表 现 形 式 均 有 差 别, 也 就 不 存 在 衡 量 正 确 与 否 的 金 标 准, 此 时 室 内 质 控 则 非 常 重 要, 即 要 保 证 机 器 处 于 良 好 的 状 态 使 用 标 准 化 的 试 剂 及 客 观 的 分 析 结 果 数 据 分 析 的 最 终 质 控 步 骤 在 于 对 数 据 的 检 验, 即 以 单 参 数 直 方 图, 点 图, 轮 廓 图 等 多 种 形 式 分 析 比 较 数 据, 以 确 定 结 果 的 可 靠 性 视 觉 观 察 图 形 经 常 会 使 我 们 发 现 仪 器, 标 本 及 标 本 处 理 过 程 中 存 在 的 某 些 问 题 此 外, 数 字 结 果 有 时 可 用 内 部 一 致 性 原 则 来 校 验 如 在 分 析 CD4 时, 在 保 证 对 淋 巴 细 胞 的 设 门 标 准 ( 即 淋 巴 细 胞 回 收 率 >95%, 淋 巴 细 胞 纯 度 >90%) 的 同 时, 还 要 保 证 CD3+/4+ 细 胞 与 CD3+/CD8+ 细 胞 之 和 约 等 于 CD3+ 细 胞 总 数, 且 CD3+ 细 胞 ( 总 T 细 胞 ),CD19+ 细 胞 ( 总 B 细 胞 ) 及 CD3-/CD(16+56)+ 细 胞 ( 总 NK 细 胞 ) 百 分 率 之 和 近 似 于 淋 巴 81

22 细 胞 门 中 淋 巴 细 胞 的 纯 度 另 外, 因 在 CD4 表 型 分 析 或 绝 对 计 数 时, 在 每 个 抗 体 反 应 管 中 均 包 含 CD3 抗 体, 所 以 分 析 比 较 每 个 管 中 的 CD3+ 细 胞 百 分 率 可 以 进 一 步 对 实 验 进 行 内 部 一 致 性 的 质 控 82

23 第 三 章 人 体 流 式 细 胞 参 数 的 正 常 参 考 值 一 外 周 血 中 各 种 流 式 细 胞 仪 检 测 指 标 的 正 常 参 考 值 : 细 胞 表 面 标 志 细 胞 名 称 均 值 标 准 差 范 围 T 细 胞 抗 原 CD2 总 T 细 胞 76.28± ~89.0 CD3 成 熟 T 细 胞 69.98± ~77.0 CD4 T 辅 助 / 诱 导 细 胞 亚 群 35.25± ~41.6 CD5 T 细 胞 (B 细 胞 亚 群 ) 77.06± ~8.8 CD8 T 抑 制 细 胞 毒 细 胞 亚 群 25.08± ~29.6 CD28 T 细 胞 受 体 共 剌 激 分 子 49.59± ~64.8 CD8+/CD28+ 细 胞 毒 T 细 胞 13.22± ~15.5 CD8+/CD28- T 抑 制 细 胞 15.99± ~24.8 CD3+/HLA-DR- 静 止 T 细 胞 67.10± ~77.1 B 细 胞 抗 原 CD19 全 部 B 细 胞 11.56± ~18.2 CD20 全 部 B 细 胞 12.20±2.92 NK 细 胞 抗 原 CD3-/CD(16+56)+ NK 细 胞 14.91± ~25.6 单 核 巨 噬 细 胞 CD14 单 核 细 胞 5.10±2.00 活 化 细 胞 表 达 抗 原 CD3+/HLA-DR+ 活 化 T 细 胞 3.05± ~5.8 CD3-/HLA-DR+ 活 化 B 细 胞 7.42± ~11.7 CD3+/CD25+ 活 化 T 细 胞 15.94± ~2.20 CD5+/CD19+ 活 性 B 细 胞 4.65± ~6.6 CD69 活 化 诱 导 分 子 (AIM) 2.09± ~3.5 CD38 活 化 T 细 胞 51.07± ~60.0 免 疫 调 节 细 胞 CD4+/CD29+ T 辅 助 细 胞 诱 导 亚 群 16.92± ~26.0 CD4+/CD45-RA+ T 抑 制 细 胞 诱 导 亚 群 20.51± ~25.0 其 他 细 胞 HLA-DR MHC-Ⅱ 类 分 子 DR 抗 原 10.93± ~17.0 CD45-RA 白 细 胞 共 同 抗 原 CD45 异 型 66.99± ~73.7 CD4/CD8 比 值 1.42± ~

24 Ⅰ 型 变 态 反 应 介 导 分 子 CD23 IgE 低 亲 和 力 受 体 (FcεRⅠ) 3.19± ~4.4 IgE 膜 结 合 IgE 1.95± ~3.7 造 血 干 祖 细 胞 CD33 髓 细 胞 前 体 25.90± ~30.4 CD34 多 能 干 细 胞 < ~0.5 粘 附 分 子 CD18 整 合 素 β2 链 53.42± ~75.7 CD29 整 合 素 β1 链 57.63± ~69.0 CD44 细 胞 外 基 质 受 体 Ⅲ 98.33± ~99.9 CD49b 整 合 素 α2 链,VLA ± ~97.8 CD49c 整 合 素 α3 链,VLA ± ~4.7 CD49d 整 合 素 α4 链,VLA ± ~93.8 CD49e 整 合 素 α5 链,VLA ± ~53.5 CD49f 整 合 素 α6 链,VLA ± ~40.9 CD50 细 胞 间 粘 附 分 子 -3(ICAM 3) 89.9± ~96.9 CD54 细 胞 间 粘 附 分 子 -1(ICAM 1)14.49± ~20.2 CD56 神 经 细 胞 粘 附 分 子 (NCAM-1)10.84± ~14.4 凋 亡 相 关 蛋 白 CD95(Apo/FAS) 20.59± ~28.9 FasL Fas 配 体 0.55± ~0.8 细 胞 动 力 学 参 数 SPF S- 期 细 胞 比 率 0.15±0.13 Apo 细 胞 凋 亡 指 数 0.33±0.26 某 些 基 因 编 码 蛋 白 表 达 CD44V5 粘 附 因 子 突 变 体 ±1.21 CD44V6 粘 附 因 子 突 变 体 ±1.53 CerbB ±3.00 nm23 肿 瘤 转 移 异 制 基 因 85.89±7.99 DCC 80.31±10.11 p16 抗 多 肿 瘤 基 因 41.32±9.34 p53(v) 突 变 型 p ±

25 二 人 体 细 胞 DNA 含 量 参 数 的 正 常 参 考 值 表 人 体 各 种 正 常 组 织 DI 倍 体 SPF 和 PI 分 布 组 织 n DI 倍 性 SPF(% ) PI (% ) (x±s) (x±s) (x±s) 食 管 ±0 D 10.4± ±4.8 肝 ±0 D 12.0± ±4.2 肠 ±0 D 10.6± ±4.0 胃 ±0 D 12.4± ±5.9 肺 ±0 D 9.4± ±4.4 乳 腺 ±0 D 12.3± ±4.9 脑 ±0 D 8.9± ±5.4 腮 腺 ±0 D 6.0± ±5.0 骨 髓 ±0 D 7.0± ±5.2 三 正 常 人 体 组 织 某 些 基 因 编 码 蛋 白 的 表 达 水 平 及 其 它 参 数 CD44S 粘 附 因 子 37.27±10.61 CD44V5 粘 附 因 子 突 变 体 ±8.05 CD44V6 粘 附 因 子 突 变 体 ±13.40 CerbB ±3.72 Nm23 肿 瘤 转 移 抑 制 基 因 87.00±9.10 DCC 72.00±8.57 P16 多 肿 瘤 抑 制 基 因 86.27±12.86 P53(V) 突 变 型 P ±1.29 Apo 细 胞 凋 亡 指 数 2.66±2.49 SPF S- 期 限 细 胞 比 率 5.21±4.58 CD14 巨 噬 细 胞 18.70±5.00 CTL 细 胞 毒 T 细 胞 11.90±

26 第 四 章 实 用 流 式 细 胞 术 彩 色 图 谱 细 胞 膜 溶 酶 体 中 心 粒 线 粒 体 细 胞 核 高 尔 基 体 内 质 网 酶 原 粒 细 胞 浆 蛋 白 质 脂 质 双 分 子 层 图 细 胞 结 构 模 式 图 流 式 细 胞 术 是 检 测 细 胞 各 种 成 分 的 重 要 细 胞 生 物 学 工 具 它 可 以 定 量 测 定 细 胞 膜 细 胞 浆 和 细 胞 核 中 的 各 种 细 胞 成 分, 还 可 以 研 究 细 胞 的 各 种 功 能 状 态 ( 细 胞 增 殖 细 胞 凋 亡 细 胞 分 化 酶 活 性 细 胞 膜 通 透 性 氧 化 还 原 状 态 吞 噬 性 等 等 ) 目 前 又 可 以 定 量 检 测 血 清 中 的 各 种 可 溶 性 生 物 分 子 成 分 细 胞 膜 : 脂 质 双 分 子 结 构 中 相 嵌 多 种 蛋 白 质 分 子 即 细 胞 表 面 抗 原 表 面 糖 类 表 面 受 体 细 胞 因 子 膜 电 位 膜 结 合 钙 离 子 细 胞 表 面 电 荷 等, 这 对 确 定 细 胞 的 性 质 及 其 功 能 是 十 分 重 要 的 ; 细 胞 浆 : 各 种 细 胞 成 份, 包 括 蛋 白 质 RNA 各 种 细 胞 器 中 的 特 殊 成 分 各 种 抗 原 基 因 编 码 蛋 白 细 胞 因 子 细 胞 浆 内 钙 离 子 ph 值 等 ; 细 胞 核 :DNA RNA 蛋 白 质 各 种 基 因 表 达 蛋 白 抗 原 蛋 白 等 86

27 ( 一 ) 不 同 流 式 细 胞 术 分 析 方 法 对 肿 瘤 细 胞 DNA 含 量 的 分 析 1 1 例 肺 癌 患 者 瘤 组 织 细 胞 DNA 含 量 的 不 同 分 析 方 法 (1- 碎 片 峰,2- 凋 亡 细 胞 峰,3-DNA 二 倍 体 细 胞 G 0/1 峰,4-DNA 异 倍 体 G 0/1 细 胞 峰 ) 图 肺 癌 细 胞 DNA 含 量 的 Modifit LT 分 析 直 方 图 ( 左 : 直 方 图, 右 : 分 析 图 ) ( 横 座 标 DNA 含 量 ; 纵 座 标 细 胞 数 量 ) 图 肺 癌 细 胞 DNA 含 量 的 CellQuest 分 析 直 方 图 ( 横 座 标 FL2-A: 细 胞 面 积 ; 纵 座 标 细 胞 数 ) 图 肺 癌 细 胞 DNA 含 量 的 假 三 维 图 87

28 4 细 图 肺 癌 细 胞 DNA 含 量 的 二 维 散 点 图 (FL2-W 细 胞 宽 度 ;FL2-H 细 胞 面 积 ) 图 肺 癌 细 胞 DNA 含 量 的 等 高 线 图 (FL2-W 细 胞 宽 度 ;FFL2-A 细 胞 面 积 ) 88

29 2 DNA 直 方 图 和 假 三 维 图 举 例 图 例 肺 癌 患 者 骨 髓 细 胞 DNA 含 量 分 析 ( 左 : 直 方 图 ; 右 : 假 三 维 图 ) (SPF 较 高 :15.74%) 图 例 NHL 患 者 化 疗 后 骨 髓 细 胞 DNA 含 量 分 析 ( 左 : 直 方 图 ; 右 : 假 三 维 图 ) ( 细 胞 凋 亡 :24.66%) 图 例 肠 癌 患 者 肿 瘤 细 胞 的 DNA 含 量 分 析 ( 左 : 直 方 图 ; 右 : 假 三 维 图 ) ( 伴 异 倍 体 峰 :DI=1.31) 89

30 二 实 验 条 件 对 流 式 细 胞 术 分 析 结 果 的 影 响 1 低 渗 处 理 低 渗 处 理 前 正 常 人 外 周 血 细 胞 DNA 直 方 图 (G 0/1 峰 CV 值 为 3.34%, G 0/1 峰 前 无 明 显 细 胞 碎 片 峰 ) 低 渗 外 理 5h 后 正 常 人 外 周 血 细 胞 的 DNA 直 方 图 (G 0/1 细 胞 峰 CV 值 变 化 不 明 显 :3.55%, 但 G 0/1 峰 前 有 明 显 细 胞 碎 片 峰 : 蓝 色 ) 图 低 渗 处 理 前 后 外 周 血 细 胞 DNA 含 量 分 析 直 方 图 90

31 2 未 固 定 细 胞 样 品 染 色 后 存 放 时 间 对 细 胞 表 面 标 志 检 测 结 果 的 影 响 图 未 固 定 细 胞 染 色 后 存 放 时 间 对 CD44S 表 达 分 析 结 果 的 影 响 左 : 染 色 后 立 即 检 测 样 品 细 胞 群 分 布 集 中, 阳 性 率 高 右 : 染 色 后 置 4 5h 后 检 测 样 品 荧 光 强 度 减 弱, 分 布 弥 散, 阳 性 率 降 低 3 在 散 射 光 图 上 设 一 个 门 分 析 多 种 参 数 荧 光 标 记 :FL1:CD3-FITC,FL2:CD(16+56)-PE 散 散 射 光 图 ( 设 定 细 胞 为 淋 巴 细 胞 ) 左 上 限 :CD3-/CD(16+56)+ 细 胞 (18.63%) 右 限 :CD(16+56)+ 细 胞 (16.21%) 右 限 :CD3+ 细 胞 (76.46%) 图 用 CellQuest 软 件 设 1 个 门 分 析 多 种 细 胞 参 数 91

32 4 用 CellQuest 软 件 设 多 个 门 分 析 某 1 种 参 数 荧 光 标 记 :FL1:CD3-FITC,FL2:CD(16+56)-PE 在 散 射 光 图 上 设 门 : R1 淋 巴 细 胞 R2 单 核 细 胞 R3 粒 细 胞 R4 红 细 胞 碎 片 左 上 限 (R1):NK 细 胞 左 上 限 (R2):CD3-/CD(16+56)+ 细 胞 左 上 限 (R3):CD3-/CD(16+56)+ 细 胞 左 上 限 (R4):CD3-/CD(16+56)+ 细 胞 图 设 门 选 择 对 外 周 血 NK [CD3-/CD(16+56)+] 细 胞 检 测 结 果 的 影 响 ( 检 测 外 周 血 NK 细 胞, 应 选 择 R1 门 进 行 分 析 ) 92

33 12345 设 门 : R1 样 品 全 部 细 胞 R2 淋 巴 细 胞 R3 粒 细 胞 R4 红 细 胞 碎 片 R5 单 核 细 胞 外 周 血 细 胞 的 散 射 光 图 ( 不 太 好 ) R R1 中 的 CD71+ 细 胞 R2 中 的 CD71+ 细 胞 R3 中 的 CD71+ 细 胞 (17.52%) R4 中 的 CD71+ 细 胞 R5 中 的 CD71+ 细 胞 图 设 门 选 择 对 患 者 外 周 血 CD71+( 转 铁 蛋 白 受 体 ) 细 胞 检 测 结 果 的 影 响 横 座 标 为 CD71-FITC; 纵 座 标 为 侧 向 角 散 射 (SSC) ( 检 测 外 周 血 CD71+ 细 胞 表 达 率, 应 该 选 择 R1 门 进 行 分 析 ) 93