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1 長 庚 大 學 生 物 醫 學 研 究 所 博 士 論 文 用 蛋 白 質 體 的 方 法 去 探 討 Gelsolin 在 人 類 子 宮 頸 癌 的 表 現 Over-expression of Gelsolin in human cervical cancer determined by the proteomic approach 指 導 老 師 : 林 光 輝 教 授 研 究 生 : 陳 政 義 中 華 民 國 九 十 八 年 七 月

2 中 文 摘 要 子 宮 頸 癌 位 居 全 世 界 女 性 惡 性 腫 瘤 第 二 位, 在 子 宮 頸 癌 發 現 的 生 物 標 記 (biomarker) 為 數 不 少, 但 並 非 每 一 個 都 適 合 做 為 子 宮 頸 癌 診 斷 (diagnosis) 與 預 後 (prognosis) 的 基 準, 所 以 本 實 驗 利 用 蛋 白 質 體 二 維 電 泳 (2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2d-page) 方 法, 比 較 正 常 和 子 宮 頸 癌 組 織 中 表 現 有 顯 著 差 異 的 蛋 白,gelsolin 就 是 其 中 一 個 而 gelsolin 是 一 個 actin-binding protein, 在 細 胞 中 的 角 色 主 要 是 經 由 調 節 細 胞 骨 架 來 維 持 細 胞 的 morphology & motility 本 人 沿 續 先 前 實 驗 室 的 研 究, 從 西 方 點 墨 法 得 知,cytoplasmic gelsolin 在 子 宮 頸 癌 組 織 當 中 表 現 量 和 正 常 組 織 相 比 高 了 1.3 倍, 在 92 個 子 宮 頸 癌 病 例 的 免 疫 組 織 化 學 染 色 中,Gelsolin 在 80.3% 的 癌 細 胞 中 表 現 量 較 高 cytoplasmic gelsolin 的 另 外 一 個 isoform 稱 為 plasma gelsolin, 經 由 西 方 點 墨 法 和 sandwich ELISA 得 知,plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量 比 正 常 人 高, 而 plasma gelsolin 在 腺 癌 和 鱗 狀 上 皮 細 胞 癌 病 人 血 清 中 的 含 量 也 是 相 當 的, 表 示 plasma gelsolin 並 不 是 特 定 在 單 一 的 子 宮 頸 癌 型 態 中 發 生 過 量 表 現 的 情 況 plasma gelsolin 的 表 現 量 也 隨 著 stage 有 上 升 的 趨 勢, 表 示 若 過 度 表 現 plasma gelsolin 可 能 造 成 不 良 的 預 後 情 況, 經 由 西 方 點 墨 法 sandwich ELISA 和 免 疫 組 織 化 學 染 色 顯 示 plasma gelsolin 在 復 發 病 人 的 表 現 量 比 正 常 人 要 高,plasma gelsolin 同 時 也 會 影 響 子 宮 頸 癌 細 胞 移 動 的 能 力 而 在 子 宮 頸 癌 細 胞 中 將 gelsolin knock down 會 經 由 Ras-Rac signaling pathway 抑 制 癌 細 胞 的 移 動, 若 在 細 胞 中 過 度 表 現 gelsolin 會 促 進 癌 細 胞 的 生 長

3 英 文 摘 要 Cervical cancer, a potentially preventable disease, remains the second most common malignancy in women worldwide.however,the molecular mechanism is still unknown. Identification of cervical cancer related factor is essential to increase patient survival. To identify the new molecular markers for diagnosis and prognostic, as well as the therapeutic target, we identify differential expressed proteins in non-tumor and tumor tissues by Two-Dimensional Electrophoresis.Gelsolin is one of the differentially expressed proteins.gelsolin is an intracellular actin-binding protein involved in cell shape changes,cell motility,and apoptosis.an extracellular gelsolin isoform,plasma gelsolin is an actin-scavenger in the blood.the expression of c-gelsolin protein was up-regulated in tumor tissues by western blot and Immunohistochemistry,(compared with adjacent non-tumor tissues).the expression of plasma gelsolin was also up-regulated in patient serum by sandwich ELISA.And the expression of plasma gelsolin was not specific for adenocarcinoma and squamous cell carcinoma.besides, the levels of plasma gelsolin was positively corelated with tumor.the expression of plasma gelsolin was also up-regulated in recurrent patient.and block secreted gelsolin can suppress cells migration ability.in order to understand the relationship between gelsolin knock down and cervical cancer,using transient transfection knock down gelsolin in Hela cell.experimental results indicate that knock down gelsolin can inhibit cell migration via Ras-Rac signaling pathway. And over-expression gelsolin can enhance cell proliferation.

4 目 錄 (Contents) 指 導 教 授 推 薦 書 口 試 委 員 會 審 定 書 碩 士 論 文 授 權 書... 誌 謝 (Acknowledgements).... i 中 文 摘 要 (Abstract in Chinese)..... ii 英 文 摘 要 (Abstract in English) iii 目 錄...iv 背 景 及 文 獻 資 料 回 顧...1 研 究 目 的 (Specific aims).7 材 料 與 方 法 (Materials and Methods) 細 胞 培 養 (cell culture) 2. 臨 床 樣 品 與 製 備 (Clinical specimens and preparation) 3. 西 方 墨 點 法 ( Western blot ) 4. 免 疫 組 織 化 學 染 色 ( Immunohistochemistry ) 5. 酵 素 連 結 免 疫 吸 附 分 析 ( sandwich enzyme-linked immunosorbent assay ) 6. 細 胞 遷 移 實 驗 ( Cell migration assay ) 7. Antibody Blocking Assay 8. Colony formation assay 實 驗 結 果 (Results) 二 維 電 泳 的 結 果 2. 以 西 方 墨 點 法 偵 測 組 織 cytoplasmic gelsolin 3. 以 免 疫 組 織 化 學 染 色 偵 測 子 宮 頸 癌 組 織 中 Gelsolin 的 表 現 量 4. 以 西 方 墨 點 法 偵 測 plasma gelsolin 的 存 在 5. 以 西 方 墨 點 法 偵 測 plasma gelsolin 在 正 常 人 和 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 內 的 表 現 量 6. 以 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 正 常 人 和 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 內 的 表 現 量

5 7. 以 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 正 常 人 和 胃 癌 病 人 血 清 內 的 表 現 量 8. 以 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 不 同 子 宮 頸 癌 型 態 病 人 血 清 內 的 表 現 量 9. 以 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 不 同 stage 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量 10. 以 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 不 同 stage 的 胃 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量 11. 以 西 方 點 墨 法 偵 測 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 血 清 內 的 表 現 量 12. 以 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 血 清 中 的 表 現 量 13. 以 免 疫 組 織 化 學 染 色 偵 測 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 組 織 中 Gelsolin 的 表 現 量 14. 以 transient transfectuon 的 方 式 探 討 gelsolin 對 於 子 宮 頸 癌 細 胞 爬 行 能 力 的 影 響 15. 以 西 方 墨 點 法 偵 測 N-Ras 和 K-Ras 的 表 現 量 16. 以 colony formation assay 探 討 gelsolin 對 於 細 胞 生 長 的 影 響 17. 以 Antibody blocking assay 探 討 plasma gelsolin 對 於 癌 細 胞 爬 行 能 力 的 影 響 討 論 (Discussion) 參 考 文 獻 (References) 附 錄 (Figure legends)....25

6 背 景 及 文 獻 資 料 回 顧 子 宮 頸 癌 簡 介 根 據 台 灣 衛 生 署 的 統 計 報 告, 子 宮 頸 癌 是 臺 灣 婦 女 排 名 第 五 的 惡 性 腫 瘤, 每 年 臺 灣 約 有 2000 例 新 的 子 宮 頸 癌 病 患, 約 950 人 會 死 於 子 宮 頸 癌 以 全 世 界 來 看, 子 宮 頸 癌 僅 次 於 乳 癌, 是 發 生 率 最 高 而 且 死 亡 病 例 最 多 的 惡 性 腫 瘤 全 世 界 每 年 會 有 個 新 病 例 被 診 斷 出 來 大 部 份 的 病 人 多 發 生 於 衛 生 與 經 濟 條 件 較 差 的 開 發 中 或 工 業 國 家 ( 國 家 衛 生 研 究 院 出 版 ) 雖 然 很 多 的 研 究 指 出 人 類 突 狀 病 毒 (Human Papillomavirus;HPV) 的 感 染 是 造 成 子 宮 頸 癌 的 主 因 (1), 但 是 到 目 前 為 止 對 於 子 宮 頸 癌 發 生 的 分 子 機 制 並 不 是 非 常 的 清 楚 HPV 病 毒 屬 於 乳 突 多 瘤 空 泡 病 毒 科 (Papovaviridae family), 在 1995 年 七 月 已 有 七 十 七 種 HPV 類 型 被 鑑 定 出 來, 到 1999 年 已 經 被 報 告 超 過 100 種 類 型, 所 感 染 的 疾 病 包 括 : 皮 膚 疣 瘤 菜 花 子 宮 頸 癌 口 腔 上 皮 細 胞 增 生 等 其 中 約 莫 40 種 類 型 的 HPV 會 感 染 生 殖 道, 會 感 染 生 殖 道 的 HPV genotype 可 大 致 分 為 low-risk type 和 high risk type, 其 中 low-risk type 會 造 成 良 性 的 生 殖 道 瘤 (2); 而 high-risk type 則 容 易 導 致 子 宮 頸 癌, 其 中 high-risk type 又 以 HPV16 和 HPV18 最 具 代 表 性 此 種 病 毒 是 不 含 封 套 (envelope) 的 病 毒 粒, 直 徑 約 55-60nm, 殼 體 (capsid) 呈 正 二 十 面 體 構 造, 具 有 雙 股 環 狀 的 核 酸,genome 大 小 約 8000bp, 包 括 非 結 構 區 調 控 基 因 的 六 個 早 期 基 因 -E1 E2 E4 E5 E6 E7 及 結 構 蛋 白 的 二 個 晚 期 基 因 L1 L2, 其 中 E1 E2 參 與 DNA 的 複 製,E6 和 p53 結 合 後, 使 p53 進 入 ubiquitin degradation pathway, 被 分 解 而 失 去 抑 癌 的 功 能 E7 與 抑 癌 蛋 白 Prb 結 合 干 擾 細 胞 週 期 無 法 產 生 負 調 控

7 作 用,E6 和 E7 是 主 要 HPV 導 致 癌 病 變 的 重 要 機 轉 (3,4), 像 HPV type 16 的 genome 就 容 易 自 E2 發 生 斷 裂, 目 前 全 世 界 子 宮 頸 癌 的 發 生 中, 絕 大 多 數 都 和 HPV type 16 的 感 染 有 關 大 部 分 的 high-risk HPV type 感 染 生 殖 道 後 是 不 會 有 臨 床 症 狀 的, 只 有 少 部 分 可 以 看 見 鱗 狀 細 胞 內 表 皮 的 損 傷 (squamous intraepithelial lesion-sils), 更 只 有 少 部 分 的 SILs 會 形 成 cervical cancer 子 宮 頸 癌 有 25 年 的 癌 前 病 變 階 段, 所 以 只 要 在 這 長 時 間 的 癌 前 病 變 時 期 早 期 發 現, 便 可 以 早 期 進 行 手 術 切 除 治 療, 所 以 子 宮 頸 上 皮 細 胞 癌 是 個 很 適 合 篩 檢 的 疾 病 近 年 來 藉 由 於 子 宮 頸 抹 片 (Papanicolaou smear) 檢 查 的 普 及, 子 宮 頸 癌 的 死 亡 率 也 越 來 越 低, 可 壓 抑 80% 左 右 但 儘 管 子 宮 頸 癌 的 診 斷 可 經 由 抹 片 檢 查 準 確 率 高 達 99% 以 上, 子 宮 頸 抹 片 畢 竟 還 是 一 種 篩 檢 工 具, 不 能 當 做 診 斷 用 近 年 來, 並 利 用 結 合 檢 驗 HPV 病 毒 上 DNA 是 否 出 現 甲 基 化 的 方 式 來 做 子 宮 頸 癌 的 初 步 篩 檢, 使 得 子 宮 頸 癌 發 生 率 大 大 的 降 彽 子 宮 頸 癌 的 生 物 標 記 (biomarker) 從 過 去 文 獻 來 看, 在 子 宮 頸 癌 發 現 的 biomarker 為 數 不 少, 像 是 HER-2/neu (5),Fas ligand (6), and Heppar 1 [7] 等 已 被 報 導 為 預 後 較 差 的 標 記 p21,nm23-h1,platelet-derived endothelial cell growth factor, Muc5AC,and BCL-2 (7) 則 被 報 導 為 預 後 較 好 的 標 記 還 有 已 經 被 應 用 至 臨 床 上 預 後 的 SCCA (squamous cell carcinoma antigen)(8) 和 CA125 (9), 分 別 應 用 於 鱗 狀 上 皮 細 胞 癌 (squamous cell cervical cancer), 後 者 特 別 用 於 腺 癌 (cervical adenocarcinoma) (10), 但 兩 者 必 須 在 癌 症 末 期 才 能 在 血 清 中 大 量 偵 測 到, 仍 然 不 適 合 做 為 血 清 診 斷 的

8 生 物 標 記 (13) 近 兩 年 的 子 宮 頸 癌 疫 苗 的 上 市, 也 針 對 子 宮 頸 癌 做 了 一 個 很 好 的 預 防 此 疫 苗 主 要 是 針 對 HPV 型 進 行 防 護 (11) 在 台 灣 引 起 子 宮 頸 癌 的 HPV 主 要 有 四 型, 可 以 做 到 七 成 的 防 護, 但 是 仍 需 要 良 好 的 生 物 標 記 做 臨 床 的 診 斷 和 預 後 SCCA 本 也 是 存 在 於 細 胞 內 的 蛋 白, 當 侵 襲 癌 發 生 之 後, 會 在 血 清 中 可 以 偵 測 到 少 量 的 SCCA 蛋 白 表 現 (12) 故 我 們 利 用 二 維 電 泳 蛋 白 質 體 學 (Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D-PAGE) 的 技 術, 期 望 找 出 多 種 的 子 宮 頸 癌 生 物 標 記 來 輔 助 臨 床 上 之 不 足 我 們 比 較 正 常 和 子 宮 頸 癌 組 織 中 表 現 有 顯 著 差 異 的 蛋 白, gelsolin 是 其 中 的 一 個 而 在 過 去 的 文 獻 中 指 出,gelsolin 是 一 個 actin-bindig protein, 可 以 經 由 調 節 細 胞 骨 架 進 而 影 響 細 胞 的 形 態 以 及 能 動 性, 並 且 gelsolin 也 參 與 多 種 和 細 胞 生 長 有 關 的 訊 息 傳 遞 路 徑, 這 些 功 能 或 許 和 子 宮 頸 癌 的 增 生 和 轉 移 有 關 係, 同 時 gelsolin 會 分 泌 到 血 液 中, 因 此 希 望 能 在 血 液 中 大 量 偵 測 到 gelsolin 的 表 現, 這 是 要 作 為 一 個 生 物 標 誌 (biomarker) 非 常 重 要 的 條 件, 並 且 之 前 沒 有 有 關 gelsolin 在 子 宮 頸 癌 的 研 究, 因 此 選 擇 gelsolin 做 為 進 一 步 的 研 究 對 象 Gelsolin 在 細 胞 內 的 功 能 Gelsolin 是 一 個 actin-binding protein, 在 細 胞 中 主 要 的 角 色 就 是 經 由 調 節 肌 動 蛋 白 單 體 (actin monomer,g-actin) 的 聚 合 作 用 和 肌 動 蛋 白 纖 維 體 (actin filament,f-actin) 的 去 聚 合 作 用 來 維 持 這 兩 種 狀 態 的 平 衡, 進 而 影 響 細 胞 的 morphology 和 motility (14,15) 而 當 細 胞 在 靜 止 狀 態 時,gelsolin 並 沒 有 活 性, 可 是 如 果 細 胞 要 進 行 移 動

9 或 改 變 morphology 時, 細 胞 內 的 鈣 離 子 濃 度 會 增 加,pH 降 低, gelsolin 此 時 被 活 化, 切 斷 (severing)f-actin 並 包 蓋 住 (capping)f-actin 的 fasting-growth end, 同 時 gelsolin 也 會 和 G-actin 結 合 發 生 核 心 作 用 (nucleation), 當 作 要 組 合 成 F-actin 的 核 心 若 細 胞 要 恢 復 靜 止 狀 態, 細 胞 內 的 PIP2 增 加, 會 抑 制 gelsolin severing 和 capping 的 能 力 (Fig.1)(14) Gelsolin 主 要 是 由 六 個 homologous domain 所 組 成, 稱 為 G domain G1 & G4 domain 可 以 和 G-actin binding,g1 & G2 可 以 和 PIP2 binding,g2 可 以 和 F-actin 以 及 Tropomyosin binding(fig.2) Gelsolin 和 Apoptosis 的 關 係 1997 年 科 學 家 鑑 定 出 gelsolin 為 caspase-3 的 受 質, 當 gelsolin 被 caspase-3 切 割 後 會 導 致 細 胞 膨 脹, 懸 浮 於 培 養 基 中 並 發 生 nuclear fragmentation 的 現 象, 最 後 引 起 apoptosis(16), 可 是 在 同 一 年 藉 由 處 理 anti-fas antibody, C2-ceramide ordexamethasone (Apoptosis 的 促 進 者, 使 caspase-3 活 性 增 加 ), 在 over-expression gelsolin 的 Jurkat 細 胞 中 發 現,gelsolin 會 顯 著 的 抑 制 apoptosis, 但 不 會 改 變 細 胞 的 型 態 (17) Gelsolin 在 癌 細 胞 內 的 表 現 量 Gelsolin 是 一 個 多 功 能 的 蛋 白 質, 並 且 廣 泛 的 表 現 在 各 種 組 織 中 (18,19) Gelsolin 有 兩 種 isoforms, 分 別 為 cytoplasmic gelsolin 和 plasma gelsolin, 兩 者 是 由 同 一 個 基 因 經 由 alternative splicing 而 產 生 的 (20), 兩 者 的 差 異 主 要 是 plasma gelsolin 比 cytoplasmic

10 gelsolin 在 N-terminal 多 了 25 個 amino acid, 分 子 量 約 差 3kDa 而 在 之 前 的 研 究 指 出, 與 正 常 組 織 相 較, 肺 癌 組 織 中 的 cytoplasmic gelsolin 的 表 現 量 是 上 升 的 (21), 而 在 膀 胱 癌 (bladder cancer), 乳 癌 (breast cancer), 卵 巢 癌 (ovarian cancer) 當 中 cytoplasmic gelsolin 的 表 現 量 是 下 降 的 (18) Gelsolin 與 轉 移 (metastasis) 和 侵 入 (invasion) 的 關 係 2001 年 Hisakazu 和 Futoshi 等 人 因 為 gelsolin 可 以 調 節 肌 動 蛋 白 細 胞 骨 架 而 被 啟 發, 在 B16-BL6 老 鼠 黑 色 素 瘤 (mouse melanoma cell) 中 over-expression gelsolin 觀 察 B16-BL6 細 胞 的 motility, 更 進 一 步 的 研 究 gelsolin 和 癌 細 胞 轉 移 的 關 係, 結 果 顯 示 :gelsolin 會 抑 制 癌 細 胞 轉 移 的 能 力, 並 且 gelsolin 的 c-terminal 對 於 部 份 轉 移 的 抑 制 是 必 要 的, 然 而 完 整 的 機 制 和 訊 息 傳 遞 路 徑 至 今 仍 然 不 甚 了 解 (22,26) 2002 年, 另 一 個 group 發 現 在 MDCK-AZ,HEK293T 細 胞 中 over-expression gelsolin 會 促 進 細 胞 侵 入 I 型 膠 原 (collagen type I), 而 此 路 徑 是 經 由 Ras guaninenucleotide exchange factor(gef)sos-1 活 化 Ras 的 活 性, 再 進 一 步 活 化 下 游 的 PI3K kinase 和 Rac1 蛋 白, 將 訊 息 傳 遞 至 gelsolin, 使 癌 細 胞 發 生 侵 入 作 用 (23,24) Gelsolin 和 TR 的 關 係 在 2008 年 的 文 獻 報 導 指 出,cytoplasmic gelsolin 是 TRβ interacting protein,gelsolin 藉 由 c-terminal 和 TR(31) 的 DNA binding domain 作 用, 在 Follicular Thyroid Cancer 的 TRβ mutant

11 mouse model 中 發 現 gelsolin 的 表 現 量 是 下 降 的, 若 將 gelsolin knock down, 會 增 加 tumor cell motility Treat HDAC inhibitor (trichostatin A) 則 會 減 少 tumor cell motility(25) Plasma Gelsolin 的 功 能 Plasma gelsolin 會 分 泌 到 血 液 中, 而 plasma gelsolin 在 正 常 人 血 液 中 的 表 現 量 約 為 (mg/L) (26), 在 2006 年 的 文 獻 報 導 發 現, plasma gelsolin 為 MMP(matrix metalloproteinase) 的 受 質, 然 而 目 前 已 知 plasma gelsolin 在 血 液 當 中 最 主 要 的 功 能 是 扮 演 一 個 清 除 者 的 角 色 (actin-scavenger), 當 細 胞 死 亡 時 plasma gelsolin 會 將 F-actin 切 割 成 G-actin, 使 得 血 液 的 黏 滯 度 (viscosity) 下 降. 根 據 最 新 的 報 導 指 出 plasma gelsolin 和 早 期 敗 血 症 (Sepsis) 以 及 免 疫 反 應 的 發 生 有 關 (26-30)

12 論 文 研 究 目 的 對 於 癌 症 的 治 療 一 直 仰 賴 著 病 理 組 織 上 的 特 性 和 臨 床 分 期 的 相 關 性 但 是 即 使 擁 有 相 同 的 病 理 組 織 特 性 以 及 臨 床 分 期, 癌 症 的 預 後 卻 不 盡 相 同 所 以 找 出 正 確 並 且 更 有 效 率 的 診 斷 方 法 是 仍 須 努 力 的 目 標 為 了 尋 找 適 合 診 斷 及 預 後 的 子 宮 頸 癌 生 物 標 記, 本 實 驗 室 利 用 二 維 電 泳 的 方 式 去 偵 測 非 腫 瘤 組 織 和 腫 瘤 組 織 的 蛋 白 質 圖 譜, 從 中 找 到 一 些 在 腫 瘤 組 織 中 表 現 量 有 差 異 的 蛋 白, 希 望 可 以 從 這 些 生 物 標 記 中 找 到 適 合 臨 床 上 診 斷 或 治 療 子 宮 頸 癌 的 標 的 蛋 白. 選 擇 gelsolin 的 理 由 :1. 由 二 維 電 泳 蛋 白 質 圖 譜 觀 察,cytoplasmic gelsolin 的 表 現 差 異 顯 著 ;2. 由 過 去 文 獻 得 知,cytoplasmic gelsolin 為 actin-binding protein, 會 經 由 調 節 細 胞 骨 架 而 影 響 細 胞 的 morphology & motility, 並 且 參 與 了 多 種 和 細 胞 生 長 有 關 的 signaling pathway, cytoplasmic gelsolin 也 有 促 進 癌 細 胞 爬 行 和 入 侵 的 能 力, 所 以 在 侵 入 型 的 子 宮 頸 癌 或 許 可 做 為 一 個 診 斷 與 預 後 的 生 物 標 記 ; 3. gelsolin 還 有 另 外 一 個 isoform 稱 為 plasma gelsolin, 會 分 泌 到 血 液 中, 若 能 在 血 液 中 偵 測 到 大 量 plasma gelsolin 的 表 現, 將 來 在 診 斷 上 將 會 非 常 的 快 速 方 便, 這 是 做 為 一 個 生 物 標 誌 非 常 重 要 的 條 件 ; 4. 之 前 並 沒 有 有 關 gelsolin 在 子 宮 頸 癌 中 的 探 討, 所 以 選 擇 了 gelsolin 做 為 進 一 步 的 研 究 對 象

13 材 料 與 方 法 細 胞 (cell line) 子 宮 頸 癌 細 胞 株 HeLa cell 以 10% FBS DMEM 培 養 液 培 養 Clinical specimens and preparation 林 口 長 庚 醫 院 婦 產 科 提 供, 將 子 宮 頸 癌 病 人 腫 瘤 部 位 及 一 小 部 分 非 腫 瘤 部 位 切 除 後, 放 入 冷 凍 小 管, 置 於 -80 度 的 冰 箱 儲 藏 正 常 病 人 和 子 宮 頸 癌 病 人 的 血 清 取 得 後, 置 放 於 -80 度 的 冰 箱 儲 藏 Western Blot a. 組 織 蛋 白 質 電 泳 取 製 備 好 的 Total tissue lysate(15μg), 加 入 適 當 量 的 5X sample buffer, 置 於 沸 水 中 煮 5 分 鐘, 瞬 間 離 心 後 注 入 8% SDS PAGE 膠 體 中, 以 80 伏 特 進 行 stacking gel 電 泳 約 45 分 鐘, 之 後 再 加 高 伏 特 量 至 150 伏 特 進 行 separating gel 約 小 時 b. 轉 印 裁 與 膠 等 同 大 小 的 3M paper 6 張 ( 以 transfer buffer 浸 潤 ), 及 1 張 PVDF membrane ( 以 甲 醇 活 化 ) 將 跑 完 電 泳 的 SDS-PAGE 取 出, 去 除 多 餘 的 膠, 在 最 下 層 墊 三 張 3M paper, 再 依 序 墊 PVDF membrane 膠, 最 後 於 最 上 層 放 三 張 3M paper 置 於 石 墨 電 極 上 (semi-drytransfer), 以 membrane area x 0.8mA/cm2 的 電 流 轉 印 1 小 時 c. 免 疫 反 應 將 轉 印 後 的 PVDF membrane 取 出, 置 於 5% 脫 脂 牛 奶 / PBST

14 中, 作 用 一 小 時 將 P 再 將 PVDF membrane 取 出, 置 於 二 級 抗 體 (HRP-goat anti-mouse IgG 1:10000 稀 釋 於 PBST) 中 作 用 一 小 時 後, 將 PVDF membrane 以 PBST 清 洗 3 次, 每 次 10 分 鐘 後 取 出 PVDF membrane 盡 量 甩 乾 PVDF membrane 上 的 液 體, 置 於 保 鮮 膜 上, 將 2X Luminol/ Enhancer solution 及 2X Stable peroxide solution (Amershan) 等 體 積 混 合 後, 均 勻 滴 在 PVDF membrane 上, 將 溶 液 吸 乾 至 暗 房 壓 片 30 秒 至 1 分 鐘, 然 後 以 顯 影 液 及 定 影 液 沖 片 晾 乾 後 判 讀 d. 血 清 蛋 白 質 電 泳 將 正 常 人 和 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 稀 釋 10 倍 後, 取 等 量 體 積 加 入 適 當 量 的 5X sample buffer, 置 於 沸 水 中 煮 5 分 鐘, 瞬 間 離 心 後 注 入 8% SDS PAGE 膠 體 中, 以 80 伏 特 進 行 stacking gel 電 泳 約 45 分 鐘, 之 後 再 加 高 伏 特 量 至 150 伏 特 進 行 separating gel 約 小 時, 轉 印 和 免 疫 反 應 同 上 PVDF membrane 取 出, 置 於 一 級 抗 體 ( anti-gelsolin,bd,1:8000 稀 釋 於 5% 脫 脂 牛 奶 中 ) 作 用 overnight 後, 取 出 PVDF membrane, 以 PBST 清 洗 3 次, 每 次 10 分 鐘, 免 疫 組 織 染 色 法 分 析 (Immunohistochemical studies) 組 織 先 用 formalin 固 定, 接 著 包 埋 於 石 臘 當 中, 用 石 蠟 切 片 機 ( 長 庚 醫 院 病 理 科 處 理 ) 切 片,55 烤 片, 脫 臘 (Xylene 中 作 用 5min 三 次 ), 復 水 ( 於 99.9% EtOH 5 分 鐘, 再 換 至 95% EtOH 5 分 鐘, 再 換 至 75% EtOH 5 分 鐘 ) 接 著 是 抗 原 回 復 (Ag retrieval) : 將 玻 片 浸 泡 在 Trilogy 中 加 熱 煮 沸 10 分 鐘, 冷 卻 20 分 鐘 後 浸 泡 於 TBS 10 分 鐘 接 著 上 機 (Ventana IHC, 自 動 免 疫 染 色 儀 ),Anti-GSN(Sigma,1:800)

15 反 應 時 間 溫 度 為 60 分 鐘 120 完 成 後 浸 泡 於 TBS 中, 浸 潤 一 下 就 好, 然 後 用 Hematoxylin 染 色 1 分 鐘 後 立 刻 以 ddh 2 O 沖 洗 5 分 鐘, 再 脫 水 ( 75% EtOH 5 分 鐘, 換 至 95% EtOH 5 分 鐘, 換 至 99.5% EtOH 5 分 鐘 ), 再 換 至 Xylene 20 分 鐘 浸 泡 兩 次 ( 去 酒 精 ), 用 mounting gel 封 片 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay 首 先 將 一 級 抗 體 (rabbit anti-gsn) 以 1:1000 的 比 例 溶 於 含 有 1% ovabumin 的 PBS 中, 取 50μl coating 於 96 孔 盤 上, 放 置 於 4 overnight, 接 著 將 一 抗 倒 掉, 加 200μl PBS 清 洗 六 次, 再 加 入 含 有 1% ovabumin 的 PBS 200μl 放 置 於 4 overnight 進 行 Blocking 的 步 驟, 將 液 體 到 掉 後 用 200μl PBS 清 洗 六 次, 接 著 coating His-tag GSN fusion protein ( 原 始 濃 度 530ng/μl) 以 及 正 常 人 (dilute 250X) 和 子 宮 頸 癌 & 胃 癌 病 人 (dilute 500X) 血 清 50μl 放 置 於 4 overnight, 將 液 倒 掉 後 用 200μl PBS 清 洗 六 次, 接 著 incubated with 二 級 抗 體 (mouse anti-gsn,bd) 50μl, 抗 體 以 1:1000 的 比 例 溶 於 含 有 1% ovabumin 的 PBS 中, 放 置 於 室 溫 下 2hrs, 將 液 體 倒 掉 後 用 200μl PBS 清 洗 六 次, 接 著 coating AP-conjugated Goat anti-mouse antibody(sigma) 50μl, 抗 體 以 1:2000 的 比 例 溶 於 含 有 1% ovabumin 的 PBS 中, 放 置 於 4 3hr, 將 液 倒 掉 後 用 200μl PBS 清 洗 六 次, 接 著 coating MUP substrate (1:100 in AP buffer) 100μl, 最 後 利 用 ELISA reader 偵 測 fluorscence 355/460nM (exciation:355nm; emission:460nm)

16 細 胞 遷 移 實 驗 (Cell migration assay) 首 先 將 anti-gsn sirna(10μg) 利 用 lipofectamine transfect Hela cell,24hrs 後 將 5X10 4 的 Hela cell 溶 於 Serum-free DMEM 中 (total volume 250μl) 種 至 chamber 上 層, 下 層 加 入 10% FBS DMEM 800μl, 經 過 24hr 後, 用 crystal violet 染 色, 在 顯 微 鏡 下 取 六 個 視 野 再 利 用 Image J 進 行 定 量 分 析 Antibody Blocking Assay 首 先 將 5X10 4 的 Hela cell 溶 於 Serum-free DMEM 中 (total volume 250μl) 種 至 chamber 上 層, 同 時 將 anti-gsn antibody (sigma) 和 其 它 control antibody (GFP & GAPDH) 一 起 加 至 chamber 上 層, 下 層 加 入 10% FBS DMEM 800μl, 經 過 24hr 後, 用 crystal violet 染 色, 在 顯 微 鏡 下 取 六 個 視 野 再 利 用 Image J 進 行 定 量 分 析 Colony formation assay 首 先 將 construct 好 會 表 現 gelsolin 的 plasmid 利 用 lipofectamine transfect Hela cell,48hr 之 後, 種 1600 & 2000 顆 細 胞 至 6-well 中 (total vlume 2ml), 放 置 37 0 c incubator 中 10 天,10 天 後 用 crystal violet 染 色, 觀 察 細 胞 的 生 長 情 形

17 實 驗 結 果 以 二 維 電 泳 方 法 找 尋 正 常 組 織 和 子 宮 頸 癌 組 織 表 現 差 異 的 蛋 白 質 比 較 子 宮 頸 癌 組 織 和 其 周 圍 正 常 組 織 的 蛋 白 質 圖 譜 (protein profile), 將 其 有 差 異 的 蛋 白 擷 取 下 來, 做 In-gel digestion, 接 著 做 MALDI-TOF 質 譜 儀 分 析 (Figure 3.), 從 五 對 病 人 的 檢 體 中 找 到 了 40 個 有 差 異 的 蛋 白, 其 中 選 擇 了 cytoplasmic gelsolin 作 為 進 一 步 的 研 究 選 擇 cytoplasmic gelsolin 做 為 研 究 的 主 題 是 因 為 (1) 由 蛋 白 質 譜 觀 察,cytoplasmic gelsolin 的 表 現 有 顯 著 差 異 ;(2) cytoplasmic gelsolin 是 一 個 actin-bindng protein, 會 經 由 調 節 細 胞 骨 架 的 型 態, 進 而 影 響 細 胞 的 morphology 和 motility, 同 時 cytoplasmic gelsolin 也 參 與 了 許 多 和 細 胞 生 長 有 關 的 訊 息 傳 遞 路 徑, 而 去 影 響 細 胞 入 侵 爬 行 轉 移 的 能 力, 所 以 在 侵 入 性 的 子 宮 頸 癌 或 許 可 以 做 為 一 個 診 斷 與 預 後 的 生 物 標 誌 (3) cytoplasmic gelsolin 還 有 另 外 一 個 isoform 稱 為 plasma gelsolin,plasma gelsolin 可 以 分 泌 到 血 液 中, 若 能 夠 在 血 液 中 就 能 大 量 偵 測 的 到, 那 麼 未 來 在 診 斷 病 人 上 將 會 非 常 的 方 便 快 速 以 西 方 墨 點 法 偵 側 正 常 組 織 和 子 宮 頸 癌 組 織 的 cytoplasmic gelsolin 的 表 現 量 將 正 常 組 織 和 子 宮 頸 癌 組 織 的 蛋 白 質 分 別 萃 取 出 來 之 後, 利 用 西 方 點 墨 法 比 較 兩 者 的 差 異 (Figure 4A.), 比 較 了 四 對 檢 體, 發 現 cytoplasmic gelsolin 在 子 宮 頸 癌 組 織 的 表 現 量 和 正 常 組 織 相 比 是 有 差 異 的, 比 正 常 組 織 高 了 1.3 倍 (Figure 4B.)

18 以 免 疫 組 織 化 學 染 色 偵 測 子 宮 頸 癌 組 織 中 Gelsolin 的 表 現 量 總 共 進 行 了 92 對 臨 床 子 宮 頸 癌 檢 體, 發 現 不 管 是 在 腺 癌 (adenocarcinoma) 以 及 鱗 狀 上 皮 細 胞 癌 (squamous cell carcinoma) 中, gelsolin 的 表 現 量 皆 比 正 常 細 胞 高 (Figure 5A.), 初 步 統 計 結 果 發 現 有 80.3% gelsolin 在 癌 細 胞 中 表 現 量 ( score = percentage x intensity) 比 正 常 細 胞 高 (Figure 5B.), 經 由 SPSS 軟 體 的 臨 床 統 計 分 析 也 確 定 gelsolin 在 子 宮 頸 癌 細 胞 中 的 表 現 量 比 正 常 細 胞 要 高 (Figure 5C.) 以 西 方 墨 點 法 確 認 plasma gelsolin 是 否 會 分 泌 至 細 胞 外 和 血 液 中 由 於 Gelsolin 有 兩 個 isoform, 為 了 確 認 plasma gelslin 是 否 會 分 泌 至 細 胞 外 以 及 血 液 中, 因 此 收 集 了 Hela cell 的 condition medium 以 及 子 宮 頸 癌 病 人 血 清, 利 用 西 方 點 墨 法 來 偵 測 plasma gelsolin 的 表 現 (Figure 6.) 經 由 實 驗 結 果 顯 示,plasma gelsolin 確 實 會 分 泌 至 細 胞 外 以 及 子 宮 頸 癌 病 人 的 血 液 中 以 西 方 墨 點 法 比 較 plasma gelsolin 在 正 常 人 和 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 內 的 表 現 情 形 由 於 plasma gelsolin 確 定 會 分 泌 至 子 宮 頸 癌 病 人 的 血 液 中, 所 以 初 步 利 用 西 方 點 墨 法 來 觀 察 plasma gelsolin 在 正 常 人 和 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 的 表 現 情 況, 發 現 plasma gelsolin 不 管 是 在 adenocarcinoma (n=7) 以 及 squamous cell carcinoma (n=12) 病 人 血 清 中 的 表 現 量 皆 比 正 常 人 要 高 (Figure 7A.), 經 由 Image Gauge V3.46 軟 體 定 量, 將 所 有 正 常 人 定 量 所 得 的 值 加 總 起 來 取 平 均 值,

19 子 宮 頸 癌 患 者 的 血 清 也 是 相 同, 然 後 利 用 Prism 4 比 較 兩 者 的 差 異 並 繪 圖 發 現 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量 比 正 常 人 高 了 1.69 倍 (Figure 7B.) 以 Sandwich ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 正 常 人 和 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 內 的 表 現 量 為 了 更 精 確 的 得 知 plasma gelsolin 在 正 常 人 和 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 的 含 量, 因 此 利 用 Ssndwich ELISA 來 偵 測 總 共 偵 測 了 正 常 人 血 清 102 個 病 例, 子 宮 頸 癌 病 人 135 個 病 例, 發 現 plasma gelsolin 在 正 常 人 血 清 內 的 含 量 為 70.5(μg/ml), 而 在 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 內 的 含 量 為 155.0(μg/ml), 比 正 常 人 高 了 2.2 倍 (Figure 8.) 以 Sandwich ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 正 常 人 和 胃 癌 病 人 血 清 內 的 表 現 量 為 了 探 討 plasma gelsolin 在 其 它 癌 症 當 中 是 否 和 子 宮 頸 癌 一 樣 有 過 度 表 現 的 情 形, 因 此 利 用 Sandwich ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 胃 癌 病 人 血 清 中 的 含 量 總 共 偵 測 了 正 常 人 血 清 102 個 病 例, 胃 癌 病 人 66 個 病 例, 發 現 plasma gelsolin 在 正 常 人 血 清 內 的 含 量 為 70.5(μg/ml), 而 在 胃 癌 病 人 血 清 內 的 含 量 為 59.2(μg/ml), 比 正 常 人 低 了 1.19 倍 (Figure 9.) 所 以 plasma gelsolin 在 胃 癌 病 人 血 清 當 中, 並 沒 有 發 生 過 度 表 現 的 情 形 以 Sandwich ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 不 同 子 宮 頸 癌 型 態 病 人 血 清 內 的 表 現 量 子 宮 頸 癌 的 型 態 可 分 為 兩 種,90% 的 病 人 是 鱗 狀 上 皮 細 胞 癌

20 (squamous cell carcinoma),10% 的 病 人 是 腺 癌 (adenocarcinoma), 為 了 觀 察 plasma gelsolin 的 表 現 量 是 否 會 因 為 不 同 型 態 的 子 宮 頸 癌 而 有 差 異, 所 以 利 用 Sandwich ELISA 來 偵 測. 總 共 偵 測 了 腺 癌 病 人 13 個 病 例, 鱗 狀 上 皮 細 胞 癌 122 個 病 例, 發 現 plasma gelsolin 在 腺 癌 的 含 量 為 156.5(μg/ml), 在 鱗 狀 上 皮 細 胞 癌 的 表 現 量 為 154.8(μg/ml), 兩 者 的 表 現 量 大 約 相 同 (Figure 10.), 表 示 plasma gelsolin 不 會 因 為 不 同 的 子 宮 頸 癌 型 態 而 表 現 量 不 同 利 用 Sandwich ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 不 同 stage 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量 為 了 探 討 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量 是 否 會 隨 著 stage 而 不 同, 因 此 利 用 Sandwich ELISA 偵 測 不 同 stage 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 plasma gelsolin 的 含 量, 經 由 實 驗 結 果 顯 示, plasma gelsolin 的 表 現 量 隨 著 stage 呈 現 上 升 的 趨 勢 (Figure 11.), 表 示 若 過 度 表 現 plasma gelsolin 可 能 會 造 成 不 良 的 預 後 (prognosis) 情 況 利 用 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 不 同 stage 的 胃 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量 為 了 探 討 plasma gelsolin 在 不 同 stage 胃 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量 是 否 和 子 宮 頸 癌 一 樣 呈 現 上 升 的 趨 勢, 因 此 利 用 Sandwich ELISA 偵 測 不 同 stage 胃 癌 病 人 血 清 中 plasma gelsolin 的 含 量, 經 由 實 驗 結 果 顯 示, plasma gelsolin 的 表 現 量 並 沒 有 隨 著 stage 呈 現 上 升 的 趨 勢 (Figure 12.)

21 利 用 西 方 點 墨 法 偵 測 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 血 清 內 的 表 現 量 由 於 之 前 的 實 驗 顯 示 plasma gelsolin 的 表 現 量 隨 著 stage 而 上 升 (Figure 11.), 表 示 plasma gelsolin 的 過 度 表 現 可 能 會 造 成 不 好 的 預 後 情 況, 因 此 初 步 利 用 西 方 點 墨 法 觀 察 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 血 清 中 的 表 現 情 況, 發 現 plasma gelsolin 在 復 發 病 人 血 清 中 的 表 現 量 比 正 常 人 要 高 (Figure 13A.), 經 由 Image Gauge V3.46 軟 體 定 量, 將 所 有 正 常 人 定 量 所 得 的 值 加 總 起 來 取 平 均 值, 子 宮 頸 癌 復 發 患 者 的 血 清 也 是 相 同 然 後 利 用 Prism 4 比 較 兩 者 的 差 異 並 繪 圖 發 現 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 血 清 中 的 表 現 量 比 正 常 人 高 了 1.78 倍 (Figure 13B.) 利 用 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 血 清 中 的 表 現 量 經 由 西 方 點 墨 法 得 知 plasma gelsolin 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 血 清 中 的 表 現 量 比 正 常 人 高 了 1.78 倍 (Figure 13B.), 為 了 更 精 確 的 得 知 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 血 清 中 的 含 量, 因 此 利 用 Ssndwich ELISA 來 偵 測 總 共 偵 測 了 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 18 個 病 例, 發 現 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 血 清 內 的 含 量 為 120.6(μg/ml), 比 正 常 人 高 了 1.71 倍 (Figure 14A.) 經 由 ELISA 的 統 計 結 果, plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 病 人 的 表 現 量 最 高, 其 次 是 復 發 病 人, 最 後 是 正 常 人, 西 方 點 墨 法 的 結 果 和 ELISA 一 致 (Figure 14B.)

22 以 免 疫 組 織 化 學 染 色 偵 測 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 組 織 中 Gelsolin 的 表 現 量 此 病 例 是 經 過 外 科 手 術 治 療 後, 卻 又 發 生 復 發 的 情 況, 根 據 免 疫 組 織 化 學 染 色 的 結 果 顯 示,Gelsolin 在 癌 細 胞 的 表 現 量 比 正 常 細 胞 要 高 (Figure 15.) 利 用 transient transfection 的 方 式 探 討 gelsolin 對 於 子 宮 頸 癌 細 胞 爬 行 能 力 的 影 響 由 於 之 前 的 文 獻 報 導 指 出 gelsolin 是 一 個 actin-binding protein, 會 經 由 調 節 細 胞 骨 架 的 型 態 而 去 影 響 細 胞 的 motility, 不 過 gelsolin 對 於 子 宮 頸 癌 細 胞 的 影 響 並 沒 有 相 關 的 文 獻 報 導, 因 此 利 用 transient transfection 的 方 式, 在 Hela cell 中 將 gelsolin knock down, 經 由 實 驗 結 果 發 現, 若 在 細 胞 中 將 gelsolin knock down 則 會 抑 制 細 胞 爬 行 的 能 力 (Figure 16.) 在 子 宮 頸 癌 細 胞 中 knock down gelsolin 會 經 由 Ras-Rac signaling pathway 造 成 細 胞 爬 行 的 能 力 下 降 之 前 的 實 驗 顯 示, 若 在 細 胞 中 將 gelsolin knock down 則 會 抑 制 細 胞 爬 行 的 能 力 (Figure 16.), 因 此 想 探 討 是 經 由 何 種 signaling pathway 造 成 細 胞 的 移 動 能 力 下 降, 之 前 的 文 獻 報 導 指 出, 在 MDCK/HEK293 中 over-expression gelsolin 會 經 由 Ras-Rac signaling pathway 增 加 細 胞 爬 行 的 能 力, 所 以 想 觀 察 在 knock down gelsolin 的 細 胞 中,N-Ras & K-Ras 的 活 性 是 否 會 下 降 經 由 實 驗 結 果 顯 示,N-Ras & K-Ras 在 knock down gelsolin 的 細 胞 中, 活 性 呈 現 下 降 的 趨 勢 (Figure 17A&B.), 表 示 若 在 子 宮 頸 癌 細 胞 中 將

23 gelsolin knock down 會 經 由 Ras-Rac signaling pathway 抑 制 癌 細 胞 的 爬 行 能 力 利 用 colony formation assay 探 討 gelsolin 對 於 細 胞 生 長 的 影 響 為 了 探 討 若 在 子 宮 頸 癌 細 胞 中 over-expression gelsolin 是 否 會 促 進 癌 細 胞 的 生 長, 因 此 利 用 colony formation assay 來 觀 察, 經 由 實 驗 結 果 發 現, 在 Hela cell 中 over-expression gelsolin 會 促 近 癌 細 胞 colony 的 形 成 (Figure 18.) 利 用 Antibody blocking assay 探 討 plasma gelsolin 對 於 癌 細 胞 爬 行 能 力 的 影 響 目 前 已 知 plasma gelsolin 最 主 要 的 功 能 是 在 血 液 中 扮 演 一 個 actin-scavenger 的 角 色, 使 血 液 的 viscosity 下 降 由 於 plasma gelsolin 也 是 一 個 actin-binding protein, 所 以 想 知 道 plasma gelsolin 是 否 會 影 響 癌 細 胞 的 移 動, 因 此 利 用 Antibody blocking assay 來 觀 察 經 由 實 驗 結 果 發 現, 當 加 入 較 高 劑 量 anti-gsn 抗 體 時, 會 抑 制 癌 細 胞 的 移 動 (Figure 19.), 表 示 若 過 度 表 現 plasma gelsolin 會 增 加 癌 細 胞 爬 行 的 能 力, 因 此 plasma gelsolin 是 一 個 會 影 響 子 宮 頸 癌 細 胞 爬 行 能 力 的 因 子

24 討 論 發 展 新 的 系 統 生 物 學 的 方 法 分 析 整 個 細 胞 或 是 整 塊 組 織 的 功 能 性 基 因 體 和 蛋 白 質 體 已 經 成 為 近 年 來 的 趨 勢, 人 們 想 從 中 了 解 腫 瘤 的 發 生 過 程 中, 有 那 些 分 子 異 常 的 表 現, 而 在 這 異 常 表 現 的 分 子 當 中, 又 扮 演 了 什 麼 的 角 色 呢? 最 近 非 常 熱 門 的 itraq 定 量 蛋 白 體 技 術 比 起 先 前 傳 統 的 技 術 可 以 更 精 確 的 偵 測 出 分 子 在 腫 瘤 組 織 中 ( 和 非 腫 瘤 組 織 相 比 ) 是 上 升 或 下 降 幾 倍, 進 而 探 討 此 分 子 在 癌 症 中 所 扮 演 的 角 色 或 功 能, 希 望 能 夠 找 到 一 個 適 合 的 生 物 標 誌 應 用 在 臨 床 上, 幫 助 進 行 診 斷 與 預 後 的 工 作, 使 得 癌 症 發 生 或 復 發 的 機 率 降 低, 同 時 也 希 望 達 到 早 期 發 現 早 期 治 療 的 目 的 於 是 本 實 驗 室 想 要 有 效 率 的 找 出 子 宮 頸 癌 的 生 物 標 記 (biomarker), 藉 由 二 維 電 泳 的 蛋 白 質 體 技 術 分 析 正 常 子 宮 頸 組 織 和 子 宮 頸 癌 的 protein profile, 系 統 性 了 解 在 正 常 組 織 和 子 宮 頸 癌 組 織 中 有 那 些 分 子 有 變 化, 從 許 多 表 現 差 異 蛋 白 質 中 我 們 發 現 其 中 一 個 細 胞 內 骨 架 蛋 白 - gelsolin, 在 子 宮 頸 癌 中 有 表 現 量 調 降 的 情 況 為 了 做 進 一 步 的 確 認, 我 們 藉 由 西 方 點 墨 法 和 免 疫 組 織 染 色 法, 去 看 gelsolin 在 子 宮 頸 癌 組 織 中 的 表 現 量, 卻 意 外 發 現, 西 方 點 墨 法 的 結 果 和 免 疫 組 織 染 色 的 結 果 與 二 維 電 泳 是 不 一 致 的 因 為 組 織 染 色 的 結 果 是 較 為 直 接, 所 以 我 們 採 信 免 疫 組 織 染 色 的 結 果, 並 且 综 合 以 上 觀 察 到 的 現 象, 我 們 認 為 二 維 電 泳 結 果 會 和 免 疫 組 織 染 色 結 果 相 反 的 肇 因 是 由 於 檢 體 分 離 的 問 題 我 們 發 現 可 能 是 檢 體 的 分 離 不 精 確, 無 法 完 全 擷 取 到 全 部 都 是 癌 組 織 的 區 域, 受 到 正 常 組 織 的 污 染, gelsolin 在 基 質 (stroma) 的 高 表 現 量 可 以 解 釋 二 維 電 泳 和 免 疫 組 織 化 學 染 色 法 不 一 致 的 結 果 若 在 檢 體 的 分 離 上, 正 常 組 織 是 以 腫 瘤 周

25 圍 非 正 常 組 織 定 義, 則 此 結 果 可 以 解 釋 因 為 在 腫 瘤 周 圍 的 組 織 包 含 有 許 多 的 纖 維 細 胞 肌 肉 細 胞 神 經 細 胞 血 管 等 等, 而 這 些 細 胞 中 都 含 有 gelsolin 的 高 表 現 量, 的 確 會 干 擾 二 維 電 泳 所 看 到 的 表 現 量. 而 為 了 解 決 檢 體 分 離 不 精 確 的 問 題, 可 以 利 用 雷 射 顯 微 擷 取 技 術 (Laser-capture microdissection) 的 技 術 將 檢 體 作 一 個 正 確 的 分 離 子 宮 頸 癌 血 清 腫 瘤 標 記 要 找 出 有 效 能 快 速 偵 測 的 生 物 標 的 分 子, 當 然 是 希 望 可 以 從 血 清 裡 面 偵 測 到 的 標 的 蛋 白 質 目 前 主 要 應 用 在 臨 床 上 的 子 宮 頸 癌 生 物 標 誌 只 有 SCCA (squamous cell carcinoma antigen), SCCA 主 要 在 鱗 狀 上 皮 細 胞 癌 病 患 的 血 清 中 大 量 被 偵 測 到, 但 是 是 在 較 晚 期 和 復 發 的 病 患 中 偵 測 到, 在 子 宮 頸 癌 早 期 的 血 清 中 量 太 少 不 易 被 偵 測 到, 所 以 不 適 合 做 為 診 斷 的 依 據 根 據 本 實 驗 ELISA 的 結 果 得 知, plasma gelsolin 會 分 泌 至 子 宮 頸 癌 病 人 的 血 液 當 中 並 且 偵 測 到, 而 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 患 者 的 表 現 量 蠻 高 的, 比 正 常 人 要 高 了 2.2 倍, 且 在 早 期 就 能 被 偵 測 到, 未 來 若 能 再 進 行 大 規 模 的 病 人 測 試, 並 和 病 人 的 病 理 資 料 一 起 進 行 統 計 分 析, 評 估 是 否 有 其 相 關 性, 或 許 plasma gelsolin 可 做 為 子 宮 頸 癌 早 期 診 斷 的 生 物 標 誌 由 於 經 由 實 驗 發 現,plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 患 者 血 液 中 的 表 現 量 有 隨 著 stage 上 升 的 趨 勢, 所 以 也 可 以 進 行 病 理 資 料 的 統 計 分 析, 分 析 plasma gelsolin 是 否 和 cervical cancer stage 相 關, 可 提 供 臨 床 醫 師 評 估 病 患 是 早 期 或 晚 期 以 及 其 嚴 重 程 度 由 於 plasma gelsolin 在 復 發 患 者 的 表 現 量 也 比 正 常 人 高, 不 過 目 前 實 驗 的 病 例 數 太 少, 未 來 必 須 增 加 病 例 數, 並 進 行 病 理 資 料 的 統 計 分 析, 評 估 plasma gelsolin

26 是 否 和 復 發 相 關, 或 許 可 做 為 復 發 的 指 標 之 前 的 研 究 報 導 也 指 出 gelsolin 在 胃 癌 肺 癌 大 腸 直 腸 癌 中 有 異 常 表 現 的 情 況, 所 以 gelsolin 或 許 也 可 以 當 作 偵 測 其 它 癌 症 發 生 的 標 的 蛋 白, 並 不 是 僅 專 一 於 偵 測 子 宮 頸 癌 的 發 生 Plasma gesolin 在 子 宮 頸 癌 中 的 功 能 目 前 已 知 plasma gelsolin 最 主 要 的 功 能 是 扮 演 一 個 actin-scavenger 的 角 色, 當 細 胞 死 亡 或 受 到 傷 害 的 時 候,actin 會 分 泌 至 細 胞 外, 經 由 plasma gelsolin 的 作 用, 將 血 液 中 的 actin 給 清 除 掉, 使 血 液 的 黏 稠 度 下 降 近 來 的 文 獻 也 指 出, 在 早 期 敗 血 症 的 患 者 中, 因 為 plasma gelsolin 的 表 現 量 下 降, 使 得 血 液 中 的 actin 比 正 常 人 要 高 而 當 細 胞 產 生 發 炎 的 情 況, 或 是 急 性 傷 害 的 時 候,plasma gelsolin 的 表 現 量 也 呈 現 下 降 的 趨 勢 所 以 plasma gelsolin 的 表 現 量 高 低 可 能 和 一 些 疾 病 的 發 生 有 關, 因 此 plasma gelsolin 在 生 物 體 內 的 角 色 是 非 常 重 要 的 經 由 Antibody blocking assay 得 知, 若 過 度 表 現 plasma gelsolin 可 能 會 促 進 細 胞 的 migration, 而 plasma gelsolin 又 隨 著 stage 而 上 升, 因 此 在 子 宮 頸 癌 患 者 中, 若 plasma gelsolin 表 現 量 高 可 能 使 得 癌 細 胞 較 容 易 爬 行 進 而 發 生 轉 移 的 情 況, 使 得 病 情 更 加 惡 化 因 此 plasma gelsolin 或 許 不 僅 可 以 做 為 一 個 診 斷 以 及 預 後 的 marker, 也 可 以 當 做 新 藥 開 發 的 標 的, 使 的 癌 細 胞 不 會 發 生 轉 移 的 情 況, 讓 病 情 能 被 控 制 住, 使 得 治 療 能 夠 更 有 效 率

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29 29.Lee PS, Waxman AB, Cotich KL, Chung SW, Perrella MA, Stossel TP.Crit Care Med. Plasma gelsolin is a marker and therapeutic agent in animal sepsis Mar;35(3): Park SM, Hwang IK, Kim SY, Lee SJ, Park KS, Lee ST. Characterization of plasma gelsolin as a substrate for matrix metalloproteinases.proteomics Feb;6(4): Chen RN, Huang YH, Lin YC, Yeh CT, Liang Y, Chen SL, Lin KH. Thyroid hormone promotes cell invasion through activation of furin expression in human hepatoma cell lines. Endocrinology Aug;149(8): Epub 2008 May 8.

30 附 錄 Figure 1. A model of gelsolin s interaction with actin in the cell. 當 在 靜 止 狀 態 時, gelsolin 並 沒 有 表 現 出 功 能, 如 果 細 胞 發 生 motility 或 morphology change 時, 細 胞 內 Ca2+ 濃 度 增 加 或 而 ph 降 低, gelsolin 此 時 被 活 化, 切 斷 (severing) F-actin, 並 蓋 住 (capping) F-actin 的 fasting-growth end ; 同 時 gelsolin 也 會 和 actin monomer 結 合 發 生 核 心 作 用 (nucleation), 即 當 作 要 組 合 成 F-actin 的 核 心 若 細 胞 要 恢 復 靜 止 狀 態, 細 胞 內 的 phosphatidylinositol 3,4 or 4,5-bisphosphate (PIP2) 增 加, 抑 制 gelsolin 的 severing 和 capping activity (Current Opinion in Cell Biology 1999;11: )

31 Figure 2. The structure of Gelsolin. Gelsolin 主 要 是 由 六 個 homologous domain 所 組 成, 稱 為 G domain 而 Gelsolin 為 一 個 actin-binding protein,g1 & G4 domain 和 G-actin binding,g1 & G2 domain 和 PIP2 binding,g2 domain 和 F-actin 以 及 Tropomyosin binding (Kopef & Burtnick 1992; Maciver et al, 2000)

32 (A) (B). (C) Figure 3. 比 較 正 常 組 織 和 子 宮 頸 癌 組 織 的 蛋 白 質 圖 譜. (A) 從 子 宮 頸 上 皮 細 胞 癌 組 織 及 其 鄰 近 的 非 腫 瘤 組 織 所 萃 取 出 來 的 total protein (200μg), 先 放 在 linear strips (ph3-10) 上 依 等 電 點 分 離 蛋 白, 二 維 時 依 分 子 量 分 離 蛋 白 (12.5% SDS-PAGE) 比 較 正 常 組 織 和 子 宮 頸 癌 組 織 的 protein profile, 子 宮 頸 癌 組 織 的 protein profile, cytoplasmic gelsolin 的 表 現 量 有 明 顯 的 下 降, 箭 頭 所 指 的 位 置 經 由 鑑 定 就 是 cytoplasmic gelsolin, 而 (B) 就 是 MALDI-TOF mass 分 析 所 得 到 的 結 果 和 所 比 對 到 的 cytoplasmic gelsolin amino acid sequence (C) 由 (A) 擷 取 放 大 的 影 像, 觀 察 到 在 子 宮 頸 癌 組 織 中 cytoplasmic gelsolin 表 現 量 有 明 顯 下 降

33 (A) Hela N T N T N T N T cytoplasmic gelsolin (93kDa) β-actin (B) 2 T>N 1.3 fold * Relative intensity 1 0 Normal Tumor Figure 4. 比 較 cytoplasmic gelsolin 在 正 常 組 織 和 子 宮 頸 癌 組 織 表 現 量. 利 用 西 方 點 墨 法 分 析 子 宮 頸 癌 病 人 癌 組 織 和 正 常 組 織 中 cytoplasmic gelsolin 表 現 量 的 差 異, 發 現 cytoplasmic gelsolin 在 子 宮 頸 癌 組 織 的 表 現 量 比 正 常 組 織 高 了 1.3 倍 (P<0.05)

34 (A) Normal Tumor(SCC) Normal Tumor(SCC) Normal Tumor(AD) Normal Tumor(AD)

35 (B) Total Case 92(66) 所 佔 總 case 的 百 分 比 (%) N>T % N=T 5 7.6% N<T % Figure 5. Gelsolin 免 疫 組 織 染 色 (Immunohistochemistry) 目 前 已 經 進 行 了 92 組 臨 床 子 宮 頸 癌 病 人 的 免 疫 組 織 染 色, 發 現 gelsolin 在 子 宮 頸 癌 組 織 ( squamous cell carcinoma & adenocarcinoma ) 的 表 現 量 比 正 常 組 織 要 高, 初 步 估 算 在 子 宮 頸 癌 組 織 中 gelsolin 表 現 量 大 於 正 常 組 織 的 佔 了 80.3%

36 C.M serum plasma gelsolin (100kDa) Figure 6. 利 用 西 方 點 墨 法 確 認 plasma gelsolin 在 Hela cell & 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 內 是 否 存 在. 收 集 Hela cell condition medium(100μg) 以 及 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 (0.5μl), 利 用 西 方 點 墨 法 證 實 plasma gesolin 確 實 會 分 泌 到 細 胞 外 以 及 血 液 中

37 (A) Normal Tumor(AD) pgsn Normal Tumor(SCC) pgsn Normal Tumor(SCC) pgsn (B) Relative intensity T>N 1.69 fold 0.9 * Normal Tumor Figure 7. 比 較 plasma gelsolin 在 正 常 人 血 清 和 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 內 的 表 現 量. 利 用 西 方 點 墨 法 分 析 正 常 人 和 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 plasma gelsolin 的 表 現 量, 發 現 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量 比 正 常 人 高 了 1.69 倍 (P<0.05).

38 pgsn expression(ug/ml) T>H 2.2 fold(p<0.0001) Health control Tumor H=102,T=135 Figure 8. 利 用 ELISA 偵 測 正 常 人 和 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 內 plasma gelsolin 的 表 現 量. 經 由 ELISA 發 現 plasma gelsolin 在 正 常 人 的 血 清 中 表 現 量 70.5(μg/ml), 而 在 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 為 155.0(μg /ml), 和 正 常 人 相 比 高 了 2.2 倍 (P<0.0001)

39 H>T 1.19 fold(p=0.1331) ug/ml Health control N=102 T=66 Tumor Figure 9. 利 用 ELISA 偵 測 正 常 人 和 胃 癌 病 人 血 清 內 plasma gelsolin 的 表 現 量. 為 了 想 探 討 plasma gelsolin 在 其 它 癌 症 血 清 當 中, 是 否 和 子 宮 頸 癌 一 樣 有 過 度 表 現 的 情 況, 所 以 利 用 ELISA 來 偵 測 plasma gelsolin 在 胃 癌 血 清 中 的 表 現 量. 經 由 實 驗 結 果 顯 示, plasma gelsolin 在 胃 癌 血 清 中 的 表 現 量 為 59.2(μg/ml), 比 正 常 人 低 了 1.19 倍, 因 此 plasma gelsolin 在 胃 癌 血 清 中 並 沒 有 像 子 宮 頸 癌 一 樣 有 過 度 表 現 的 情 形

40 pgsn expression(ug/ml) AD SCC Health control AD SCC H=102,A=13,S=122 Figure 10. 利 用 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 不 同 子 宮 頸 癌 型 態 (adenocarcinoma & squmous cell carcinoma) 血 清 中 的 表 現 量. 為 了 探 討 plasma gelsolin 的 表 現 量 是 否 會 因 為 不 同 型 態 的 子 宮 型 態 而 有 差 異, 因 此 利 用 ELISA 來 偵 測 並 進 行 統 計 分 析 經 由 實 驗 結 果 顯 示,plasma gelsolin 在 adenocarcinoma 血 清 中 的 表 現 量 為 156.5(μg/ml), 而 在 squamous cell carcinoma 血 清 中 的 表 現 量 為 154.8(μg/ml),plasma gelsolin 在 兩 種 型 態 的 表 現 量 是 相 似 的 (P=0.9507), 表 示 plasma gelsolin 並 不 是 一 個 專 一 於 某 種 子 宮 型 態 血 清 中 過 度 表 現 的 蛋 白 質

41 P< P< P< P< pgsn expresion(ug/ml) Normal stage I stage II stage III stage IV n=102 n=34 n=31 n=24 n=21 Figure 11. 利 用 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 不 同 stage 子 宮 頸 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量. 為 了 探 討 plasma gelsolin 的 表 現 量 是 否 會 隨 著 不 同 階 段 的 子 宮 頸 癌 而 有 差 異, 因 此 利 用 ELISA 來 偵 測 並 進 行 統 計 分 析 經 由 實 驗 結 果 顯 示,plasma gelsolin 的 表 現 量 會 隨 著 stage 而 上 升 (P<0.0001), 表 示 若 過 度 表 現 plasma gelsolin 可 能 會 造 成 不 好 的 預 後 (poor prognosis) 情 形.

42 300 P= P= P= P= ug/ml health control stage I stage II stage III stage IV Figure 12. 利 用 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 不 同 stage 胃 癌 病 人 血 清 中 的 表 現 量. 為 了 探 討 plasma gelsolin 的 表 現 量 在 胃 癌 當 中 是 否 和 子 宮 頸 癌 一 樣 有 隨 著 stage 上 升 的 趨 勢, 因 此 利 用 ELISA 來 偵 測 並 進 行 統 計 分 析 經 由 實 驗 結 果 發 現,plasma gelsolin 的 表 現 量 在 胃 癌 當 中 並 不 會 隨 著 stage 而 上 升 (P>0.05)

43 (A) Normal Recurrence pgsn (B) 1.5 R>N 1.78 fold *** Relative intensity Normal Recurrence Figure 13. 比 較 plasma gesolin 在 正 常 人 和 子 宮 頸 癌 復 發 病 人 血 清 內 的 表 現 量. 利 用 西 方 點 墨 法 比 較 正 常 人 (n=18) 和 子 宮 頸 癌 復 發 患 者 (n=18) 血 清 內 plasma gelsolin 的 表 現 量 是 否 有 差 異 經 由 實 驗 結 果 顯 示,plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 復 發 患 者 血 清 內 的 表 現 量 比 正 常 人 高 了 1.78 倍 (P<0.0001)

44 (A) pgsn expresion(ug/ml) health control tumor recurrence N=102,T=135,R=18 (B) Normal Tumor Recurrence Figure 14. 利 用 ELISA 偵 測 plasma gelsolin 在 子 宮 頸 癌 復 發 患 者 血 清 中 的 表 現 量. 為 了 更 精 確 的 得 知 plasma gelsolin 在 復 發 病 人 血 清 中 的 含 量, 所 以 利 用 ELISA 來 偵 測 經 由 實 驗 結 果 顯 示, 發 現 plasma gesolin 在 復 發 患 者 血 清 中 的 含 量 為 120.6(μg/ml)(A 圖 ), 比 正 常 人 高 了 1.71 倍 (P=0.0002), 比 無 復 發 患 者 低 了 1.28 倍 (P=0.1183), 西 方 點 墨 法 的 結 果 和 ELISA 一 致 (B 圖 )

45 40X Recurrence(83097) Normal(83097) Tumor(83097) Figure15. Gelsolin 免 疫 組 織 染 色 (recurrent patient) 此 病 例 為 子 宮 頸 癌 早 期 的 患 者, 經 過 治 療 後 又 發 生 復 發 的 情 況, 經 由 免 疫 組 織 染 色 發 現 Gelsolin 在 復 發 患 者 腫 瘤 組 織 中 的 表 現 量 比 鄰 近 正 常 組 織 要 高

46 (A) C1 C2 S2 S3 Pool c-gsn β-actin (B) C1 C2 S2 S3 Pool (C) Migration 3 Fold induction 2 1 * * * 0 C1 C2 S2 S3 Pool

47 Figure16. 利 用 in vitro transwell migration assay 探 討 gelsolin 對 於 癌 細 胞 爬 行 能 力 的 影 響. 在 Hela cell 中, 利 用 transient transfection 的 方 式 將 gelsolin knock down, 經 過 24hr 之 後, 種 5x10 4 個 細 胞 到 transwell 中,24hr 後 觀 察 細 胞 移 動 的 情 形 經 由 實 驗 結 果 發 現, 當 利 用 sirna 將 gelsolin 在 Hela cell 中 knock down 時, 會 抑 制 細 胞 爬 行 的 能 力

48 (A) C1 C2 S2 S3 Pool N-Ras K-Ras β-actin (B) 1.0 N-Ras 2 K-Ras Relative intensity 0.5 Relative intensity Ctrl1 Ctrl2 S2 S3 Pool 0 Ctrl1 Ctrl2 S2 S3 Pool Figure17. 利 用 西 方 點 墨 法 偵 測 N-Ras & K-Ras 的 表 現. 經 由 實 驗 結 果 發 現, 在 將 gelsolin knock down 的 細 胞 當 中,N-Ras & K-Ras 的 表 現 量 呈 現 下 降 的 趨 勢, 表 示 在 細 胞 中 若 將 gelsolin knock down 可 能 會 經 由 Ras-Rac signaling pathway 造 成 細 胞 爬 行 能 力 的 下 降

49 (A) C1 C2 Over-GSN c-gsn β-actin (B) 3 Relative intensity Ctrl1 Ctrl2 Over-GSN (C) C1 C2 Over-GSN

50 Figure18.Colony formation assay. 為 了 探 討 gelsoin 對 於 癌 細 胞 生 長 的 影 響, 因 此 利 用 transient transfection 的 方 式, 在 Hela cell 中 over-expression gelsolin,48hr 後 種 1600 & 2000 顆 細 胞 到 含 有 10% FBS DMEM 的 6 well 中,10 天 後 觀 察 有 沒 有 colony 的 形 成 經 由 實 驗 結 果 發 現, 若 在 細 胞 中 over-expression gelsolin 會 促 進 癌 細 胞 colony 的 形 成

51 (A) Control(no ab) Negtive Ctrl-1(4ug) Negtive Ctrl-2(4ug) Anti-GSN(2ug) Anti-GSN(4ug) (B) cell nomber Ab blocking assay * ** no Ab ctrl1 ctrl2 2ug 4ug Figure 19. Antibody blocking assay. 為 了 探 討 plasma gelsolin 在 細 胞 中 所 扮 演 的 角 色, 所 以 利 用 Antibody blocking assay 來 分 析 plasma gelsolin 對 於 細 胞 爬 行 能 力 的 影 響 經 由 實 驗 結 果 發 現, 當 施 予 較 高 劑 量 anti-gsn 的 抗 體 時, 會 抑 制 癌 細 胞 的 移 動 能 力, 表 示 若 過 度 表 現 plasma gelsolin, 會 促 進 細 胞 的 爬 行,plasma gelsolin 是 一 個 會 影 響 癌 細 胞 爬 行 能 力 的 因 子