168 任 峰, 等. 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 对 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 生 长 的 影 响 培 美 曲 塞 是 一 种 结 构 上 含 有 核 心 为 吡 咯 嘧 啶 基 团 的 抗 叶 酸 制 剂, 通 过 破 坏 细 胞 内 叶 酸 依 赖 性 的 正 常 代 谢

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1 肿 瘤 211 年 12 月 第 31 卷 第 12 期 TUMOR Vol. 31, December 基 础 研 究 Basic Research DOI: /j.issn Copyright 211 by TUMOR 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 对 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 生 长 的 影 响 任 峰 1, 陈 伟 2, 王 英 杰 2 2, 许 洪 卫 苏 州 大 学 附 属 第 四 医 院 暨 无 锡 市 第 四 人 民 医 院 1. 检 验 科 ;2. 普 外 科, 无 锡 [ 摘 要 ] 目 的 : 探 讨 培 美 曲 塞 与 奥 沙 利 铂 对 人 胃 癌 细 胞 BGC-823 的 生 长 抑 制 作 用 以 及 可 能 的 作 用 机 制 方 法 : 采 用 不 同 浓 度 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 单 独 或 联 合 作 用 于 BGC-823 细 胞 应 用 MTT 法 检 测 BGC-823 细 胞 生 长 抑 制 率, FCM 检 测 细 胞 周 期 的 变 化, 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 增 殖 细 胞 核 抗 原 (proliferating cell nuclear antigen,pcna) 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1(cell cycle D1,cyclin D1) 的 表 达 水 平 结 果 : 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 均 可 抑 制 BGC-823 细 胞 的 生 长 (P <.5), 且 呈 时 间 和 剂 量 依 赖 性 这 两 种 药 物 均 可 明 显 增 加 G 1 期 细 胞 比 例, 降 低 S 期 细 胞 比 例 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 结 果 显 示,cyclin D1 和 PCNA 表 达 量 均 明 显 降 低, 其 中 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 联 合 处 理 具 有 协 同 效 应, 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 处 理 24 h 后 序 贯 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 处 理 24 h 组 BGC-823 细 胞 的 生 长 抑 制 率 明 显 高 于 双 药 联 合 处 理 组 以 及 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 处 理 24 h 后 序 贯 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 处 理 24 h 组 (P <.5) 结 论 : 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 均 可 抑 制 胃 癌 细 胞 BGC-823 的 生 长, 细 胞 被 阻 滞 于 G 1 期 在 双 药 联 合 处 理 中, 以 培 美 曲 塞 序 贯 奥 沙 利 铂 对 胃 癌 细 胞 的 生 长 抑 制 最 强 [ 关 键 词 ] 胃 肿 瘤 ; 抗 肿 瘤 联 合 化 疗 方 案 ; 细 胞 凋 亡 ; 培 美 曲 塞 ; 奥 沙 利 铂 ; 细 胞,BGC-823 [ 中 图 分 类 号 ] R735.2 [ 文 献 标 志 码 ] A [ 文 章 编 号 ] (211) Effect of pemetrexed combined with oxaliplatin on the growth of human gastric cancer cell BGC-823 REN Feng 1, CHEN Wei 2, WANG Ying-jie 2, XU Hong-wei 2 1. Department of Clinical Laboratory; 2. Department of General Surgery, Fourth Affiliated Hospital of Soochow University, Fourth People s Hospital of Wuxi, Wuxi 21462, China [ABSTRACT] Objective: To investigate the growth inhibition effects of pemetrexed and oxaliplatin on human gastric cancer cell line BGC-823 in vitro, and to explore the possible mechanism. Methods: The BGC-823 cells were treated with different concentrations of pemetrexed or oxaliplatin alone or in combination. The growth inhibition rate of BGC-823 cells was detected by MTT method, and the change of cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry (FCM). The expressions levels of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and cell cycle D1 (cyclin D1) proteins in BGC-823 cells were examined by Western blotting. Results: The growth of BGC-823 cells was inhibited by pemetrexed or oxaliplatin in a dose- and time-dependent manner (P<.5). The percentage of cells in G 1 phase was increased while which in S phase was decreased by the treatment of pemetrexed or oxaliplatin. The expression levels of PCNA and cyclin D1 proteins were significantly decreased, and the combination regimen of pemetrexed and oxaliplatin exerted a synergistic effect. The growth inhibition rate of BGC-823 cells treated with pemetrexed (8 μg/ml) for 24 h followed by oxaliplatin (4 μg/ml) for 24 h was significantly decreased as compared with those of the cells treated with pemetrexed (8 μg/ml) combined with oxaliplatin (4 μg/ml) at the same time or treated with oxaliplatin (4 μg/ml) for 24 h followed by pemetrexed (8 μg/ml) for 24 h (P<.5). Conclusion: Pemetrexed and oxaliplatin can both inhibit the proliferation of gastric cancer BGC-823 cells and arrest the cells at G 1 phase. The sequential regimen of pemetrexed followed by oxaliplatin may have the strongest growth-inhibitory effect on gastric cancer cells among different doublet regimens. [KEY WORDS] Stomach neoplasms; Antineoplastic combined chemotherapy protocols; Apoptosis; Pemetrexed; Oxaliplatin; Cell, BGC-823 [TUMOR, 211, 31 (12): ] [ 基 金 项 目 ] 1. 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :317139) 2. 江 苏 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :BK28115) Correspondence to: XU Hong-wei( 许 洪 卫 ) xuhongwei@ymail.com Received Accepted

2 168 任 峰, 等. 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 对 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 生 长 的 影 响 培 美 曲 塞 是 一 种 结 构 上 含 有 核 心 为 吡 咯 嘧 啶 基 团 的 抗 叶 酸 制 剂, 通 过 破 坏 细 胞 内 叶 酸 依 赖 性 的 正 常 代 谢 过 程, 抑 制 细 胞 复 制, 从 而 抑 制 肿 瘤 的 生 长 [1] 培 美 曲 塞 在 胃 癌 患 者 中 具 有 明 显 的 抗 肿 瘤 活 性 临 床 研 究 报 道 提 示, 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 治 疗 晚 期 胃 癌 具 有 明 显 的 疗 效 [2] 奥 沙 利 铂 是 具 有 细 胞 毒 作 用 的 抗 癌 药 物, 属 于 新 的 铂 类 抗 癌 药 物, 体 内 和 体 外 研 究 均 证 实 奥 沙 利 铂 在 顺 铂 耐 药 的 肿 瘤 模 型 中 仍 然 有 效, 在 包 括 人 结 直 肠 癌 模 型 在 内 的 多 种 肿 瘤 模 型 系 统 中, 奥 沙 利 铂 均 表 现 出 广 谱 的 体 外 细 胞 毒 及 体 内 抗 肿 瘤 活 性 [3] 然 而, 目 前 国 内 外 有 关 培 美 曲 塞 对 胃 癌 细 胞 生 长 作 用 的 研 究 报 道 还 很 少 本 研 究 以 奥 沙 利 铂 作 为 对 照, 探 讨 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 对 人 胃 癌 细 胞 BGC-823 生 长 的 影 响, 并 从 细 胞 角 度 分 析 其 可 能 的 作 用 机 制, 以 期 为 临 床 用 药 提 供 可 靠 的 实 验 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 人 胃 癌 细 胞 株 BGC-823 由 中 国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 研 究 院 细 胞 资 源 中 心 提 供 小 牛 血 清 购 自 杭 州 四 季 青 生 物 工 程 材 料 有 限 公 司 ; DMEM 培 养 液 购 自 Gibco 公 司 ; 培 美 曲 塞 与 奥 沙 利 铂 均 由 美 国 礼 来 公 司 提 供 ;MTT 购 自 美 国 Sigma 公 司 ; 电 化 学 发 光 液 兔 抗 人 增 殖 细 胞 核 抗 原 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 细 胞 周 期 蛋 白 D1(cell cycle D1, cyclin D1) 单 克 隆 抗 体 和 甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 多 克 隆 抗 体 均 购 自 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 ; 辣 根 过 氧 化 物 酶 (horseradish peroxidase,hrp) 标 记 的 羊 抗 兔 多 克 隆 抗 体 购 自 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 酶 联 免 疫 检 测 仪 购 自 美 国 Bio-Rad 公 司 ;FACSAria 流 式 细 胞 仪 购 自 美 国 Becton Dickinson 公 司 1.2 细 胞 培 养 用 含 1% 小 牛 血 清 的 DMEM 培 养 液, 在 37 CO 2 体 积 分 数 为 5% 的 培 养 箱 中 培 养 人 胃 癌 细 胞 株 BGC-823 待 细 胞 铺 满 瓶 底 后, 用.25% 胰 蛋 白 酶 和.2% 乙 二 胺 四 乙 酸 钠 混 合 消 化 液 分 散 成 单 细 胞, 进 行 传 代 培 养, 取 对 数 生 长 期 细 胞 进 行 后 续 实 验 1.3 MTT 法 检 测 细 胞 生 长 抑 制 情 况 药 物 作 用 分 组 调 整 细 胞 密 度 后, 按 个 / 孔 接 种 于 96 孔 板 上, 培 养 过 夜 后, 进 行 分 组 (1) 空 白 对 照 组 : 不 含 药 物 培 养 液 (2) 单 药 处 理 组, 培 美 曲 塞 药 物 浓 度 分 别 为 和 16 µg/ml, 奥 沙 利 铂 药 物 浓 度 分 别 为 和 12 µg/ml, 这 2 种 药 物 分 别 处 理 BGC-823 细 胞 和 48 h (3) 双 药 联 合 处 理 组, 包 括 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 和 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 联 合 处 理 BGC-823 细 胞 48 h 组 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 处 理 BGC-823 细 胞 24 h 后 序 贯 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 处 理 24 h 组 以 及 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 处 理 BGC-823 细 胞 24 h 后 序 贯 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 处 理 24 h 组 上 述 各 组 实 验 均 设 3 个 复 孔 MTT 法 检 测 细 胞 生 长 抑 制 率 待 各 组 药 物 处 理 相 应 时 间 后, 每 孔 加 入 MTT(5 mg/ml) 2 μl, 继 续 培 养 4 h, 吸 除 孔 内 液 体, 各 孔 加 入 15 μl DMSO, 震 荡 1 min 后, 在 免 疫 酶 标 仪 波 长 49 nm 处 测 吸 光 度 (D) 值, 并 计 算 药 物 对 BGC-823 细 胞 生 长 抑 制 作 用 细 胞 生 长 抑 制 率 (%)= [(1 - D 实 验 组 )/D 对 照 组 ] 1% 实 验 重 复 3 次 1.4 FCM 检 测 细 胞 周 期 按 个 / 孔 的 细 胞 密 度, 将 细 胞 接 种 于 6 孔 板 上, 待 细 胞 铺 满 板 底 达 6% 时, 以 不 含 药 物 的 培 养 液 作 为 空 白 对 照 组, 另 以 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 和 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 单 药 或 双 药 联 合 ( 按 照 1.3 节 ) 处 理 BGC-823 细 胞 48 h, 每 组 设 2 个 复 孔 收 集 细 胞 后, 用 PBS 洗 涤 细 胞 2 次,111 g 离 心 5 min; 加 入 4 预 冷 的 7% 乙 醇 溶 液 重 悬 固 定 细 胞,4 处 理 过 夜 ;25 g 离 心 1 min, 去 除 乙 醇 溶 液 ; PBS 洗 涤 细 胞 2 次,111 g 离 心 5 min, 弃 上 清 液, 用 1 ml PBS 重 悬 细 胞, 加 入 质 量 浓 度 为 8 μg/ml 的 RNase A 12.5 µl, 于 37 水 浴 中 处 理 3 min, 加 质 量 浓 度 为 1 mg/ml 的 碘 化 丙 啶 (propidium iodide,pi)1 µl 混 匀 后,4 避 光 染 色 4 min,4 目 筛 网 过 滤 后, 用 流 式 细 胞 仪 进 行 检 测 实 验 重 复 3 次 1.5 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 cyclin D1 和 PCNA 蛋 白 的 表 达 将 个 BGC-823 细 胞 接 种 至 6 孔 板 上 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 和 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 单 药 或 双 药 联 合 ( 按 照 1.3 节 ) 处 理 细 胞 48 h 后, 采 用 细 胞 裂 解 液 提 取 细 胞 总 蛋 白, 应 用 Brandford 法 测 定 总 蛋 白 浓 度, 取 每 孔 2 µg 总 蛋 白 进 行 1% SDS-PAGE 以 分 离 蛋 白, 在 4 9 ma 恒 流 条 件 下 将 分 离 后 的 蛋 白 转 移 至 聚 偏 二 氟 乙 烯 (polyvinylidene fluoride,pvdf) 膜 ( 过 夜 ) 电 转 移 结 束 后, 取 出 PVDF, 用 含 5% 脱 脂 奶 粉 的 TBS-T 缓 冲 液 室 温 条 件 下 封 闭 1 h; 随 后 在 膜 上 分 别 滴 加 一 抗 [ 兔 抗 人 cyclin D1 和 PCNA 单 克 隆 抗 体 ( 均 1 : 2 稀 释 ) 和 抗 GAPDH 多 克 隆 抗 体 (1 : 1 稀 释 )],4 孵 育 过 夜 ;TBS-T 漂 洗 蛋 白 转 移 膜 后, 再 滴 加 HRP 标 记 二 抗 (1 : 5 稀

3 任 峰, 等. 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 对 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 生 长 的 影 响 169 释 ), 室 温 孵 育 2 h, 每 次 孵 育 后 以 TBS-T 洗 膜 3 次 应 用 电 化 学 发 光 剂 显 示 阳 性 条 带, 并 使 用 美 国 GE Typhoon 94 多 功 能 激 光 扫 描 成 像 系 统 检 测 和 分 析 目 的 条 带 灰 度 值, 以 目 的 条 带 灰 度 值 与 GAPDH 蛋 白 条 带 灰 度 值 的 比 值 表 示 目 的 蛋 白 的 相 对 表 达 量 实 验 重 复 5 次 1.6 统 计 学 分 析 应 用 SPSS 16. 统 计 学 软 件 对 实 验 结 果 进 行 统 计 学 分 析 数 据 以 ±s 表 示, 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 P <.5 为 差 异 有 统 计 学 意 义 2 结 果 2.1 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 单 药 对 BGC-823 细 胞 生 长 的 抑 制 作 用 MTT 法 检 测 结 果 显 示, 培 美 曲 塞 (> 1 µg/ml) 和 奥 沙 利 铂 均 可 抑 制 BGC-823 细 胞 的 生 长 (P <.5), 随 着 药 物 浓 度 的 增 加 和 药 物 处 理 时 间 的 延 长,2 种 药 物 对 BGC-823 细 胞 生 长 的 抑 制 作 用 逐 渐 增 强 ( 图 1) 培 美 曲 塞 ( 4 µg/ml) 组 或 奥 沙 利 铂 ( 2 µg/ml) 组 相 邻 时 间 点 之 间 的 细 胞 生 长 抑 制 率 差 异 有 统 计 学 意 义 (P <.5) A h 24 h 48 h B h 24 h 48 h Pemetrexed/(μg ml -1 ) Oxaliplatin/(μg ml -1 ) Fig. 1 The growth inhibition rates of human gastric cancer BGC-823 cells treated with single agent [A: pemetrexed (1, 2, 4, 8 and 16 µg/ml); B: oxaliplatin (1, 2, 4, 8 and 12 μg/ml). The inhibitory effect was enhanced in a dose- and timedependent manner (MTT method, n=3). 图 1 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 单 药 对 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 生 长 的 抑 制 作 用 (MTT 法,n = 3) 2.2 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 对 BGC-823 细 胞 生 长 的 抑 制 作 用 MTT 法 检 测 结 果 显 示, 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 和 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 双 药 联 合 同 时 处 理 组 对 BGC-823 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用 明 显 强 于 各 单 药 组 (P <.5); 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 处 理 24 h 后 序 贯 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 处 理 24 h 对 BGC-823 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用 明 显 强 于 双 药 联 合 同 时 处 理 组 以 及 奥 沙 利 铂 (4 µg/ ml) 处 理 24 h 后 序 贯 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 处 理 24 h 组 (P <.5), 见 图 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 对 BGC-823 细 胞 周 期 的 影 响 FCM 检 测 结 果 显 示, 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 和 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 单 药 或 双 药 联 合 同 时 处 理 BGC-823 细 胞 48 h 后,G 1 期 细 胞 所 占 比 例 增 加,S 期 细 胞 比 例 下 降, 与 空 白 对 照 组 的 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P <.5) 给 药 次 序 也 对 BGC-823 细 胞 周 期 有 所 影 响, 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 处 理 24 h 后 序 贯 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 处 理 24 h 对 BGC-823 细 胞 生 长 的 抑 制 作 用 明 显 强 于 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 处 理 24 h 后 序 贯 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 处 理 24 h 组 以 及 双 药 联 合 同 时 处 理 组 (P <.5, 图 3) 2.4 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 对 cyclin D1 和 PCNA 8 4 Control P O OP P+O PO Fig. 2 The growth inhibition rates of human gastric cancer BGC-823 cells treated with pemetrexed (8 μg/ml) or oxaliplatin (4 μg/ml) alone or pemetrexed (8 μg/ml) combined with oxaliplatin (4 μg/ml) were detected by MTT assay. Control: Treated with no drugs; P: Pemetrexed (8 μg/ml) alone; O: Oxaliplatin (4 μg/ml) alone; OP: Oxaliplatin (4 μg/ml) for 24 h followed by pemetrexed (8 μg /m L) for 2 4 h; P+O: Pemet re xed (8 μg /m L) combi ned w it h ox a l iplat i n (4 μg /m L) at t he sa me time; PO: Pemetrexed (8 μg/ml) for 24 h followed by oxaliplatin (4 μg/ml) for 24 h. * P <.5, ** P <.1, vs control group; P <.5, vs P+O group; P <.5, vs PO group (MTT method, n=3). 图 2 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 对 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 生 长 的 抑 制 作 用 (MTT 法,n = 3) 蛋 白 表 达 的 影 响 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 结 果 显 示, 空 白 对 照 组 的 cyclin D1 和 PCNA 呈 高 表 达 ( 分 别 为 1.12 ±.32 和 1.8 ±.42); 培 美 曲 塞 单 药 组 ( 分 别 为.812 ±.28 和.788 ±.52)

4 17 任 峰, 等. 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 对 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 生 长 的 影 响 G 1 /% 6.35±1.12 S /% 37.15±.63 G 2 /% 2.5±.15 G 1 /% 63.95±2.14 S /% 27.89±1.8 G 2 /% 8.16±.8 G 1 /% 65.45±2.6 S /% 29.61±1.56 G 2 /% 4.94±.21 G 1 /% 66.32±3.1 S /% 27.15±1.81 G 2 /% 6.53±.36 G 1 /% 67.15±3.34 S /% 23.85±1.45 G 2 /% 9.±.19 G 1 /% 78.81±3.72 S /% 14.15±1.28 G 2 /% 7.4±.27 Fig. 3 The cell cycle distribution of human gastric cancer BGC-823 cells treated with pemetrexed (8 μg/ml) or oxaliplatin (4 μg/ml) alone or pemetrexed (8 μg/ml) combined with oxaliplatin (4 μg/ml) were detected by flow cytometry (FCM). Control: Treated with no drugs; P: Pemetrexed (8 μg/ml) alone; O: Oxaliplatin (4 μg/ml) alone; OP: Oxaliplatin (4 μg/ ml) for 24 h followed by pemetrexed (8 μg/ml) for 24 h; P+O: Pemetrexed (8 μg/ml) combined with oxaliplatin (4 μg/ml) at the same time; PO: Pemetrexed (8 μg/ml) for 24 h followed by oxaliplatin (4 μg/ml) for 24 h (n = 3). 图 3 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 单 药 或 双 药 联 合 对 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 周 期 的 影 响 (n = 3) 和 奥 沙 利 铂 单 药 组 ( 分 别 为.841 ±.34 和.692 ±.62) 的 cyclin D1 和 PCNA 表 达 量 均 下 降, 与 空 白 对 照 组 相 比, 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P <.5); 培 美 曲 塞 (8 μg/ml) 处 理 24 h 后 序 贯 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 处 理 24 h 组 的 cyclin D1 和 PCNA 的 表 达 受 抑 制,cyclin D1 和 PCNA 的 表 达 量 分 别 为.538 ±.31 和.339 ±.21, 均 明 显 低 于 双 药 联 合 同 时 处 理 组 ( 分 别 为.733 ±.38 和.478 ±.49) 以 及 奥 沙 利 铂 (4 µg/ml) 处 理 24 h 后 序 贯 培 美 曲 塞 (8 μg/ml) 处 理 24 h 组 ( 分 别 为.78 ±.34 和.725 ±.83)(P <.5, 图 4) A Control P O OP P+O PO cyclin D1 PCNA GAPDH B CyclinD1(PCNA)/GAPDH CyclinD1 PCNA Control P O OP P+O PO Fig. 4 Expressions of cyclin D1 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) proteins in human gastric cancer BGC-823 cells treated with pemetrexed (8 μg/ml) or oxaliplatin (4 μg/ml) alone or pemetrexed (8 μg/ml) combined with oxaliplatin (4 μg/ml) were detected by Western blotting (A) and semi-quantificational analysis (B). Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as the internal control. Control: Treated with no drugs; P: Pemetrexed (8 μg/ ml) alone; O: Oxaliplatin (4 μg/ml) alone; OP: Oxaliplatin (4 μg/ml) for 24 h followed by pemetrexed (8 μg/ml) for 24 h; P+O: Pemetrexed (8 μg/ml) combined with oxaliplatin (4 μg/ml) at the same time; PO: Pemetrexed (8 μg/ml) for 24 h followed by oxaliplatin (4 μg/ml) for 24 h (n = 3). * P <.5, ** P <.1, vs control; P <.5, vs OP and P+O groups. 图 4 培 美 曲 塞 与 奥 沙 利 铂 单 独 和 联 合 对 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 中 PCNA 和 cyclind1 蛋 白 表 达 的 影 响 3 讨 论 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 通 过 不 同 的 途 径 抑 制 DNA 的 合 成 和 复 制 [4] 体 外 研 究 显 示, 培 美 曲 塞 能 够 抑 制 胸 苷 酸 合 成 酶 二 氢 叶 酸 还 原 酶 和 甘 氨 酰 胺 核 糖 核 苷 酸 甲 酰 转 移 酶 的 活 性 [5] 奥 沙 利 铂 则 通 过 产 生 烷 化 结 合 物 作 用 于 DNA, 形 成 链 内 和 链 间 交 联, 从 而 抑 制 DNA 的 合 成 和 复 制

5 任 峰, 等. 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 对 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 生 长 的 影 响 171 前 期 研 究 显 示, 奥 沙 利 铂 在 多 种 肿 瘤 模 型 系 统 中 都 表 现 出 广 谱 的 体 外 细 胞 毒 和 体 内 抗 肿 瘤 活 性 胃 癌 细 胞 实 验 证 实, 奥 沙 利 铂 单 独 或 联 合 替 尼 泊 苷 可 以 抑 制 BGC-823 细 胞 的 生 长 并 诱 导 细 胞 凋 亡 [6] 培 美 曲 塞 在 晚 期 乳 腺 癌 和 恶 性 胸 膜 间 皮 瘤 患 者 中, 显 示 出 较 好 的 抗 肿 瘤 活 性 [7] 培 美 曲 塞 单 独 或 联 合 顺 铂 治 疗 晚 期 非 小 细 胞 肺 癌 具 有 明 显 的 疗 效 [8], 整 体 疗 效 与 吉 西 他 滨 联 合 顺 铂 相 似, 而 治 疗 非 鳞 状 细 胞 型 非 小 细 胞 肺 癌 的 疗 效 要 优 于 吉 西 他 滨 培 美 曲 塞 联 合 卡 铂 与 吉 西 他 滨 联 合 卡 铂 对 非 小 细 胞 肺 癌 患 者 生 活 质 量 的 影 响 无 明 显 差 异, 但 前 者 的 不 良 反 应 尤 其 是 血 液 学 毒 性 较 轻 [9] 既 往 研 究 表 明, 培 美 曲 塞 与 顺 铂 联 合 对 非 [1, 小 细 胞 肺 癌 和 胃 癌 细 胞 具 有 协 同 作 用 11] 临 床 研 究 证 实, 培 美 曲 塞 联 合 奥 沙 利 铂 治 疗 晚 期 胃 癌 患 者 显 示 出 明 显 的 疗 效 [2] 因 此, 本 研 究 以 奥 沙 利 铂 作 为 对 照, 探 索 培 美 曲 塞 对 胃 癌 细 胞 生 长 抑 制 的 影 响 以 及 培 美 曲 塞 与 奥 沙 利 铂 联 合 对 胃 癌 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用 是 否 具 有 协 同 性 结 果 表 明, 培 美 曲 塞 (1 ~ 16 µg/ml) 和 奥 沙 利 铂 (1 ~ 12 µg/ml) 均 可 明 显 抑 制 人 胃 癌 BGC-823 细 胞 的 生 长, 且 奥 沙 利 铂 对 BGC-823 细 胞 的 抑 制 作 用 明 显 强 于 培 美 曲 塞 8 µg/ml 培 美 曲 塞 和 4 µg/ ml 奥 沙 利 铂 是 最 佳 抑 制 浓 度, 而 更 高 浓 度 的 药 物 则 明 显 诱 导 细 胞 死 亡, 因 此 本 研 究 选 择 8 µg/ ml 培 美 曲 塞 和 4 µg/ml 奥 沙 利 铂 进 行 联 合 分 析 与 单 药 组 相 比, 同 时 或 序 贯 给 药 组 BGC-823 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用 明 显 增 强, 尤 以 培 美 曲 塞 (8 µg/ml) 处 理 24 h 后 序 贯 奥 沙 利 铂 (4 μg/ml) 处 理 24 h 对 BGC-823 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用 最 强 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 均 可 增 加 G 1 期 细 胞 比 例, 降 低 S 期 细 胞 比 例, 将 细 胞 周 期 阻 滞 于 G 1 期, 但 培 美 曲 塞 对 细 胞 周 期 的 影 响 明 显 弱 于 奥 沙 利 铂, 而 双 药 联 合 则 可 明 显 增 强 对 细 胞 周 期 的 阻 滞 作 用 PCNA 是 真 核 细 胞 DNA 合 成 期 的 必 需 物 质, 可 作 为 评 价 细 胞 增 殖 状 态 的 一 个 指 标 [12] Cyclin D1 是 G 1 期 的 细 胞 周 期 素, 主 要 作 用 是 促 进 细 胞 通 过 G 1 /S 检 测 点 蛋 白 质 免 疫 印 迹 法 证 实, 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 都 能 抑 制 PCNA 和 cyclind1 蛋 白 的 表 达, 且 双 药 联 合 的 抑 制 作 用 更 强, 并 与 给 药 次 序 相 关 由 此 提 示, 培 美 曲 塞 和 奥 沙 利 铂 可 能 是 通 过 抑 制 细 胞 增 殖 活 跃 物 质 的 合 成 以 及 周 期 调 节 蛋 白 的 表 达, 进 而 影 响 细 胞 增 殖 的 [ 参 考 文 献 ] [1] ROTHBART S B, RACANELLI A C, MORAN R G. Pemetrexed indirectly activates the metabolic kinase AMPK in human carcinomas[j]. Cancer Res, 21, 7(24): [2] CELIO L, STERNBERG CN, LABIANCA R, et al. Pemetrexed in combination with oxaliplatin as a first-line therapy for advanced gastric cancer: a multi-institutional phase Ⅱ study[j]. Ann Oncol, 29, 2(6): [3] 车 晓 玲, 李 进, 何 敬 东, 等. 康 莱 特 注 射 液 联 合 奥 沙 利 铂 对 SW48 细 胞 株 增 殖 和 凋 亡 的 影 响 [J]. 肿 瘤, 211, 31(4): [4] SARAVANAN K, BARLOW H C, BARTON M, et al. Nucleoside transport inhibitors: structureactivity relationships for pyrimido [5, 4-d] p y r i m i d i n e d e r i v a t i v e s t h a t p o t e n t i a t e pemetrexed cytotoxicity in the presence of α (1)-acid glycoprotein[j]. J Med Chem, 211, 54(6): [5] CHEN C Y, CHANG Y L, SHIH J Y, et al. Thymidylate synthase and dihydrofolate reductase expression in non-small cell lung carcinoma: The association with treatment efficacy of pemetrexed[j]. Lung Cancer, 211, 74(1): [6] 马 望, 高 明. 奥 沙 利 铂 联 合 替 尼 泊 苷 抑 制 胃 癌 BGC-823 细 胞 生 长 和 诱 导 凋 亡 的 作 用 [J]. 肿 瘤, 21, 3(1): [7] LOPES G, CHOPRA A, KUKUTSCHKA J, et al. Pemetrexed in the treatment of thoracic malignancies: a single centre experience i n S i n g a p o r e [ J ]. S i n g a p o r e M e d J, 2 1 1, 52(3): [8] 钟 巍, 赵 静, 张 晓 彤, 等. 培 美 曲 赛 单 药 治 疗 晚 期 非 小 细 胞 肺 癌 的 疗 效 与 安 全 性 [J]. 中 华 内 科 杂 志, 21, 49(8): [9] CHUNG F T, LEE K Y, FANG Y F, et al. Low-dose weekly docetaxel is as tolerable as pemetrexed in previously treated advanced non-small-cell lung cancer[j]. Chemotherapy, 211, 57(2): [1] GADGEEL S M, RUCKDESCHEL J C, PATEL B B, et al. Phase Ⅱ study of pemetrexed and cisplatin, with chest radiotherapy followed by docetaxel in patients with stage Ⅲ non-small cell lung cancer[j]. J Thorac Oncol, 211, 6(5): [11] KIM J H, LEE K W, JUNG Y, et al. Cytotoxic effects of pemetrexed in gastric cancer cells[j]. Cancer Sci, 25, 96(6): [12] EMANUELE M J, CICCIA A, ELIA A E, et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)- associated KIAA11/PAF15 protein is a cell cycle-regulated anaphase-promoting complex/ cyclosome substrate[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, 211, 18(24): [ 本 文 编 辑 ] 林 琳

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