通用缩略术语 : AC: 亲和层析, 文献中也有被记为 AC 280 nm: 在指定波长的紫外吸收 M: 物质的量的浓度单位,mol/l 的简写 mm: 物质的量的浓度单位,mmol/l 的简写 BV: 柱体积,bed volume 的简写 Mr: 相对分子量 MPa: 兆帕斯卡 Bar: 压强单位

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绕箱蒲
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1 Protein A 亲和层析介质使用说明书 UniMab NanoMab 使用之前请认真阅读产品使用手册苏州纳微科技有限公司 Suzhou Nano-Micro Tech, Co., Ltd

2 通用缩略术语 : AC: 亲和层析, 文献中也有被记为 AC 280 nm: 在指定波长的紫外吸收 M: 物质的量的浓度单位,mol/l 的简写 mm: 物质的量的浓度单位,mmol/l 的简写 BV: 柱体积,bed volume 的简写 Mr: 相对分子量 MPa: 兆帕斯卡 Bar: 压强单位, 工程上公斤力的单位 psi: 压强单位, 磅每平方英寸压强单位之间换算 :1 MPa = 10 bar 145 psi

3 索引目录 1. Protein A 亲和层析产品简介 Protein A 亲和纯化操作步骤层析柱装填柱效评价预装柱使用方法产品基本特性单分散高度均匀的粒径更快的流速更高的效率超高的结合载量更卓越的耐碱性和化学稳定性更低的配基脱落风险细胞培养液中单克隆抗体 (mab) 捕获应用储存故障排除订购信息... 12

4 1. Protein A 亲和层析介质简介 Protein A 亲和层析介质使用手册纳微科技提供全球领先的 Protein A 亲和层析介质和预装柱产品, 该产品以单分散均匀多孔型聚甲基丙烯酸酯 (PMMA) 或聚苯乙烯 / 二乙烯苯 (PS/DVB) 微球为基质, 采用领先的基因工程优化的耐碱性重组 rprotein A, 通过独特的表面键合技术制成, 专门用于单克隆抗体以和含有 Fc 片段的重组蛋白类生物大分子的分离纯化图 1.1 纳微科技 Protein A 亲和介质的制备示意图表 1.1 纳微科技 Protein A 亲和层析介质产品系列 UniMab 介质 NanoMab 介质分离原理 Protein A 亲和捕获 Protein A 亲和捕获基质聚甲基丙烯酸酯 (PMMA) 聚苯乙烯 / 二乙烯苯 (PS/DVB) 配基耐碱性 rprotein A 耐碱性 rprotein A 粒径 (μm) 50 μm 15 μm 结合载量 ( 人 IgG) > 35 mg / ml(4 min 驻留时间 ) >30 mg / ml(4 min 驻留时间 ) 纯化阶段捕获中度纯化捕获精细纯化或样品制备基本特点高载量高耐压高分离效率耐清洗中高载量极高耐压高分辨率耐清洗最大耐受压力 116 psi( 8 bar,0.8mpa ) 870 psi ( 60bar,6MPa ) ph 稳定性 CIP 在位清洗 M NaOH M NaOH 使用温度 4 ~ 40 摄氏度 4 ~ 40 摄氏度存储 20% 乙醇,2 8 摄氏度 20% 乙醇,2 8 摄氏度典型应用适合于大规模抗体和免疫球蛋白等纯化生产, 比如当克隆抗体等适合于中高压或超高压抗体类或免疫球蛋白等的制备和纯化表 2 纳微科技 Protein A 亲和层析预装柱参数规格 UniMab 预装柱 NanoMab 分析柱预装柱尺寸规格 ( 直径 * 高 ) 7 mm * 25 mm 2.1 mm * 50 mm 16 mm * 25 mm 4.6 mm * 50 mm 柱材质 Polypropylene (PP) 不锈钢 ss 人 IgG 动态载量 (4min 驻留时间 ) > 35 mg / ml > 30 mg / ml 推荐流速 ml/min ml/min 最大操作压力 72.5 psi(5 bar, 0.5 MPa) 870 psi (60 bar,6 MPa)

5 2. Protein A 亲和纯化操作步骤 Protein A 亲和层析介质使用手册 2.1 层析柱装填匀浆液的浓度是指层析介质沉降至恒定体积时的体积与匀浆液的总体积的比值为了获取最佳的 Protein A 亲和层析介质的装柱效果, 我们推荐 0.5 M NaCl 平衡过夜, 再用 0.5 M NaCl 溶液进行匀浆, 匀浆液浓度为 65~70% 具体装柱方法如下 : 1) 首先计算所装色谱柱的柱体积 Vc,Vc=Ac L,Ac=π r 2 * Vc: 色谱柱柱体积 ;Ac: 色谱柱横截面积 ;L: 色谱柱高度 ;r: 色谱柱半径 2) 在原容器中轻轻搅动 Protein A 亲和层析介质, 使其完全分散在液体中形成匀浆液量取所需原液的质量或体积 * * 一般情况下,Protein A 层析介质在压力作用下都会被压紧导致体积收缩, 为了获得紧密的柱床, 推荐介质的体积过量一些, 一般为柱体积的 1.2 倍左右 3) 倾出介质中 20% 乙醇保存液, 用 0.5 M NaCl 溶液置换 20% 乙醇, 平衡过夜 4) 装柱之前, 用 0.5 M NaCl 溶液调整匀浆浓度为 65 ~ 70%; 将匀浆一次性倒入层析柱, 沉降平衡后标注高度 5) 将分配器装入, 调节高度使得压缩系数为 1.05 ~ 1.10; 然后启动输液泵, 用 1.5~2 倍工作流速使柱床稳定 (-2 柱体积 ) 6) 按照 SOP 进行柱效和对称性的测定, 须达到预定标准 2.2 柱效评价装好的色谱柱应使用 2 BV 0.5 M NaCl 溶液平衡, 再用 2.0 M NaCl 以 100 cm/h 流速进行柱效测试, 具体测试参数详见下表 : 表 2.2 Protein A 装填亲和柱的柱效测试方法样品 : 上样量 : 洗脱液 : 线性流速 : 检测 : 2 M NaCl 溶液 1~5 % 柱体积 0.5 M NaCl 溶液 100 cm/h 280 nm 2 M NaCl 上样 : 电导检测仪

6 2.3 预装柱使用方法 1 使用之前用平衡缓冲液替换层析柱中 20% 乙醇保存液 ; 2 依次用洗脱液 ( 如 100 mm Gly, ph 3.0) 和平衡液 ( 如 20 mm PBS, 150 mm NaCl, ph 7.0) 冲洗并平衡 UniMab 柱 ; 3 进样, 用 10 CV 平衡液清洗至基线平衡 ; 4 洗脱, 用 15 CV 洗脱液清洗至基线平衡 ; 5 再平衡, 用 15 CV 平衡液清洗至基线平衡 ; 6 使用结束后, 先用纯水替换分析柱中缓冲盐, 然后用 20% 乙醇保存注意 : 分析过程中, 所用样品及流动相均必须用孔径为 0.45 μm 滤膜膜过滤 3. 产品优势特性 UniMab Protein A 亲和层析介质的机械强度高, 反压低, 化学稳定性好, 耐碱性强, 即使在高流速下仍然能保持较高动态吸附载量, 可以满足从实验室制备中试及工业化生产的需求产品特点或属性单分散高度均匀的粒径高机械强度高流速高载量高耐碱性能够带给客户的益处批次重现性更好装柱更容易耐压更高, 可装填更大尺寸规模的制备柱分离效率更高性价比更高化学稳定性更好清洗更便捷 3.1 单分散高度均匀的粒径 UniMab 和 NanoMab 亲和层析介质采用全球领先的单分散高度均一粒径和精确的孔径的微球为基质, 批次重现性好, 装柱容易

7 图 3.1 UniMab 扫描电镜图显示其单分散均匀的粒径 3.2 更快的流速更高的效率采用聚甲基丙烯酸酯微球为基质, 相比传统的琼脂糖基质, 其耐反压的性能更强, 可承受 > 0.5 MPa 压力, 可实现更快的流速, 帮助生产节省宝贵时间, 大幅提高生产效率, 同时降低抗体的生产成本测试条件 : 柱尺寸 :XK 16 mm 400 mm 流动相 :20 mm PB,0.15 M NaCl 图 3.2 UniMab 压力相对流速曲线注 :UniMab 匀浆装柱和柱压检测使用的缓冲液均为 20 mm PB,0.15 M NaCl, 压缩系数为 1.1, 柱床高度为 250 mm 3.3 超高的结合载量在高流速情况下, 纳微科技 Protein A 层析介质的结合载量显著高于传统琼脂糖基质,

8 在 4-6 min 驻留时间下, 动态结合载量也超过了琼脂糖类介质测试条件 : Uni Mab 柱尺寸 :7 mm 25 mm 样品 :Human IgG, 2 mg/ml 平衡 :20 mm PBS, ph 7.0, 0.15 M NaCl 洗脱 :0.1 M Glycine, ph 3.0 Agarose Type Protein A Media 图 3.3 UniMab 与国际知名厂商 Protein A 亲和介质载量对比 3.4 更卓越的耐碱性和化学稳定性纳微科技 Protein A 亲和层析介质在 ph 3-12 范围内均可正常使用, 在位清洗可用 0.1 M-0.5 M NaOH, 用 0.5 M NaOH 120 次 CIP(Clean-In-Place) 循环清洗实验之后,IgG 动态吸附载量仍然保持不变测试组为 UniMab 柱每次处理走 20 个上述循环,Control 为不做任何处理的 UniMab 柱实验条件 :Binding Buffer: 20 mm PB mm ph3.0;cip: 0.5M NaOH;Size:1 ml PP NaCl ph7.0;elution Buffer: 20 mm Citric Acid 淋洗 :10 CV Binding Buffer 洗脱 :6 CV Elution Buffer 平衡 :3 CV Binding Buffer CIP:0.5 M NaOH, 15 min 再平衡 :6 CV Binding Buffer 流速 : 1 ml/min (150cm/h) 柱尺寸 :1mL PP Column (7*25 mm) 图 3.4 UniMab 键合耐碱性 rprotein A 耐受 0.5 M NaOH 清洗

9 3.5 更低的配基脱落风险实验采用 0.5 M NaOH 进行 120 个循环的碱处理, 并未造成层析介质 Protein A 配基脱落的增加, 未造成动态载量明显下降表 3.5 Protein A 碱洗脱落情况测定结果循环次数 Control (ppm) Test (ppm) 60 循环循环循环循环注 :Control 柱与 Test 柱脱落 Protein A 配对 t 检验,p=0.62, 无统计学差异 4. 细胞培养液单克隆抗体 (mab) 捕获应用下面是纳微科技 UniMab Protein A 亲和介质在捕获细胞培养液中单克隆抗体与国际某知名品牌的 MabSelect SuRe 介质的性能对比实验表明, 纳微科技 UniMab 具有卓越的单克隆抗体的亲和捕获能力, 性能可以跟该国际品牌媲美实验条件 :Binding Buffer: 10 mm PB,pH 6.0;Elution Buffer: 20 mm CB, ph 3.4. 测试条件 : 仪器 :AKTA purifier 柱尺寸 :7 mm 25 mm 样品 : 单克隆抗体细胞培养液上清,5 ml 淋洗 :15 CV Binding Buffer 洗脱 :10 CV Elution Buffer 再平衡 :15 CV Binding Buffer 驻留时间 :4 min

10 mau Protein A 亲和层析介质使用手册 3500 UniMab Competitor 测试条件 : 仪器 :AKTA purifier 柱尺寸 :7 mm 25 mm 样品 : 单克隆抗体细胞培养液上清,5 ml 淋洗 :15 CV Binding Buffer 洗脱 :10 CV Elution Buffer 再平衡 :15 CV Binding Buffer 驻留时间 :0.5 min ml 图 4.1 UniMab 与 MabSelect SuRe 对细胞培养液中单克隆抗体纯化分离性能对比表 4.1 UniMab 与 MabSelect SuRe 介质捕获 mab 的回收率情况名称驻留时间 (min) 上样体积 (ml) 上样量 (mg) 回收量 (mg/ml) 回收率 (%) UniMab MabSelect Sure 在高流速条件下 ( 驻留时间 <2 min),unimab 的捕获效率高于 MabSelect SuRe; 在低流速条件下 ( 驻留时间 >2 min),unimab 捕获效率与 MabSelect SuRe 相当 5. 储存暂时不使用的层析介质需保存在 4~35 的 20% 乙醇中, 并盖紧瓶盖, 已经装好层析柱应保存在含 20% 乙醇的缓冲液 (ph 7.0) 中

11 6. 故障排除如果您在使用 Protein A 亲和层析产品遇到任何问题, 请参考下表进行解决或联系苏州纳微科技有限公司表 6 Protein A 亲和柱的常见问题及故障排除可能遇到的情况原因分析建议措施柱压升高流速过高降低流速样品吸附不够充分泵和收集器之间的阀门未打开仪器的滤膜堵塞柱前堵塞样品在柱子上发生沉淀样品较脏, 或一些吸附作用较强的物质留在介质上柱床被压缩色谱柱使用时间过长样品溶液中离子强度太高样品的 ph 不合适打开出口去除杂质并清洗, 或者替换, 在使用前对样品和洗脱液用 0.45μm 或 0.2μm 进行过滤使用 20BV 流动相反冲色谱柱遵循清洗步骤, 调节洗脱液来维持样品溶剂度执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 重新填装柱子更换色谱柱或更换层析介质降低样品溶液中的离子强度, 如可采用稀释或脱盐等手段调节 ph 增加结合样品在洗脱过程中不被洗脱洗脱液的离子强度过低增加洗脱液的浓度洗脱液的洗脱能力过低洗脱液的 ph 不合适更换洗脱能力更强的洗脱液调整洗脱液的 ph 分辨率降低进样若干次后对样品的吸附能力降低使用中柱床出现裂痕色谱柱有残留疏水性较强的杂质执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 不合适的洗脱条件, 如梯度过陡或流速过高柱子未装填好在柱子顶端或柱后有大部分的混合空间柱子过载粒径较大选择性差样品中的杂质结合在介质上, 干扰了正常的结合溶胀未充分消除改变洗脱条件, 采用较缓的梯度洗脱或等度洗脱, 降低流速重新装柱加高介质的上表面或减少柱子后体积清洗并重新平衡色谱柱, 降低上样量更换同种类型粒径更小的介质更换其他类型介质执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 用 0.5 M NaCl 混合均匀, 充分平衡基线漂移溶液中有气泡外部空气进入系统色谱柱未平衡好洗脱液 A,B 在同一紫外波长下吸收系数不同洗脱液不纯减压过滤除气加入更多缓冲液, 将气体充分赶出增加平衡时间使用不同的波长或走没有样品的空白梯度使用高纯度的 HPLC 级试剂

可能遇到的情况原因分析建议措施出现不明杂峰前一个样品的不完全洗脱洗脱液不纯痕量离子性杂质结合在色谱柱上, 在平衡和上样过程中被浓缩, 洗脱时出峰不稳定的非重现性的不明杂峰洗脱色谱柱运行没有样品的空白梯度对照, 或使用高纯度的 HPLC 级别试剂清洗色谱柱 ( 参考再生条件 ) 或采取适当方法将结合在色谱柱上的杂质洗脱下来与仪器的稳定性有关 7.

12 可能遇到的情况原因分析建议措施出现不明杂峰前一个样品的不完全洗脱洗脱液不纯痕量离子性杂质结合在色谱柱上, 在平衡和上样过程中被浓缩, 洗脱时出峰不稳定的非重现性的不明杂峰洗脱色谱柱运行没有样品的空白梯度对照, 或使用高纯度的 HPLC 级别试剂清洗色谱柱 ( 参考再生条件 ) 或采取适当方法将结合在色谱柱上的杂质洗脱下来与仪器的稳定性有关 7. 订购信息 Protein A 亲和层析介质规格型号包装体积 / 货号信息 25mL 200mL 1L 5L 10L UniMab-50um UMB5025 UMB50200 UMB501L UMB505L UMB5010L NanoMab-15um UMB1525 UMB15200 UMB151L UMB155L UMB1510L Protein A 亲和层析预装柱预装制备柱分析柱规格型号 7*25mm 16*25mm 2.1*50mm 4.6*50mm UniMab-50um UMB5019 UMB5020 NanoMab-15um NMB151 NMB152 全国服务热线 : 苏州纳微科技有限公司 (Suzhou Nanomicro Technology, Co., Ltd) 地址 : 苏州工业园区百川街 2 号江苏中国售后邮箱 :info@nanomicrotech.com 中文官网 : English Website:

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