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笞典强
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1 doi /j.issn 基础研究小鼠VEGFR 小鼠 VEGFR 胞外胞外 -4IgG IgG样结构域的原核表达样结构域的原核表达纯化及活性鉴定王伟殷小涛李云奇田仁礼阎瑾琦高江平于继云解放军总医院泌尿外科北京军事医学科学院基础医学研究所北京摘要目的获得小鼠血管内皮生长因子Ⅱ型受体 mvegfr 胞外 -4IgG 样结构域融合蛋白并验证其免疫原性及生物活性方法利用 RT-PCR 法从孕龄 4 d 的 Balb/c 小鼠胚胎组织中扩增 mvegfrd-4 基因测序正确后将其克隆至原核表达载体 pet-4a 构建重组质粒 pet-4a-mvegfrd-4 将其转化至大肠杆菌 BL DE3 中 IPTG 诱导表达经 SDS-PAGE 分析目的蛋白用 Western blotting 鉴定后亲和层析法纯化融合蛋白 ELISA 法检测纯化蛋白的抗原活性并通过体外细胞培养检测该融合蛋白对血管内皮生长因子 VEGF 促人脐静脉内皮细胞 HUVEC 增殖的阻断作用结果测序结果证实成功扩增出目的基因 mvegfrd-4 酶切和测序结果证实 pet-4a-mvegfrd-4 原核表达载体构建成功转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白 Western blotting 证实纯化的蛋白能与特异性抗体发生反应 ELISA 检测显示纯化后的 mvegfrd-4 融合蛋白具有免疫原性并且体外细胞培养试验证实其能阻断 VEGF 对 HUVEC 的促增殖作用结论成功获得 mvegfrd-4/gst 融合蛋白该蛋白具有良好的免疫原性及生物活性为进一步研究以 VEGFR 为靶点的抗肿瘤主动免疫治疗奠定了基础关键词血管内皮生长因子Ⅱ型受体 -4IgG样结构原核表达蛋白纯化 Prokaryotic expression, purification and antigenicity identification of mouse VEGFR extracelluar -4 IgG-like domains WANG Wei,, YIN Xiaotao,, LI Yunqi,, TIAN Renli,, YAN Jinqi, GAO Jiangping, YU Jiyun Department of Urology, General Hospital of PLA, Beijing 00853, China; Institute of Basic edical Sciences, Academy of ilitary edical Sciences, Beijing 00850, China Abstract: Objective To obtain -4 IgG-like domains of mouse vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) fusion protein (mvegfrd-4/gst) and identify its antiginicity and biological activity. ethods The gene of mvegfrd-4 was amplified by RT-PCR from 4-days embryos of Balb/c mice. The PCR product was cloned into pet-4a prokaryotic expression vector to construct the recombinant plasmid pet-4a-mvegfrd-4, which was transformed into E. coli BL (DE3) strain for mvegfrd-4/gst expression. The fusion protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting, and the antigenicity of the protein purified by affinity chromatography was characterized by ELISA. The VEGF blocking effect of the purified protein in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were evaluated in in vitro cell cultures. Results The mvegfrd-4 gene was obtained, which had an identical sequence to that retrieved in GenBank. The prokaryotic expression vector for mvegfrd-4 was successfully constructed as confirmed by enzyme digestion and DNA sequencing. Both Western blotting and ELISA demonstrated the antigenicity of the purified mvegfrd-4 fusion protein, which obviously blocked the effect of VEGF in promoting HUVEC proliferation in vitro. Conclusion The mvegfrd-4/gst fusion protein obtained shows a strong antigenicity and biological activity to facilitate further study of active anti-tumor immunotherapy targeting VEGFR. Key words: vascular endothelial growth factor receptor-; -4 IgG-like domains; prokaryotic expression; protein purification 0 世纪 70 年代由 Judah Folkman 提出的有关血管生成的理论已被广泛接受血管内皮生长因子 VEGF 及其Ⅱ型受体 VEGFR 介导的信号传导是调收稿日期基金项目国家自然科学基金国家高技术研究发展计划 863 项目 007AA0Z45 Supported by National Natural Science Foundation of China ( ) and National High Technology Research and Development (863) Program of China (007AA0Z45). 作者简介王伟博士 wayewong6@yahoo.cn 通信作者于继云副研究员电话 yujyun@6. com 对肿瘤的发生发展起至关节血管生成最关键的步骤重要的作用 VEGFR是典型的跨膜蛋白它由7个类 IgG样结构域组成的胞外区一个跨膜结构区和胞质内酪氨酸激酶结构区组成 VEGF 与胞外区结合后导致 VEGFR 二聚化其胞内段酪氨酸位点发生自磷酸化激活下游的信号传导通路 3-4 只含有胞外区的 VEGFR以可溶形式存在称为sVEGFR svegfr 能与 VEGF 结合但不能激活下游信号通路从而有效 5 阻断VEGF的促血管生成作用此外 Shinkai等 6 研究表明在VEGFR的7个胞外IgG样结构域中第3个结构域对于配受体结合起关键作用缺失该结构域可导致配受体结合的功能完全丧失第及 4 结构域在维

2 4 持配受体的高结合力上起主要作用 ; 其余结构域对于配 [7-8] 体结合到受体后的固定是必须的 Wei 等研究表明, 异种肿瘤疫苗能打破免疫耐受, 诱导有效的抗肿瘤免疫反应鉴于小鼠与人的 VEGFR 在氨基酸水平上的高度同源性,mVEGFR 成为目前抗肿瘤血管生成主动免疫治疗研究中理想的异种化靶抗原, 因此, 本研究钓取了 mvegfr 胞外最重要的 -4 个 IgG 样结构域基因 mvegfrd-4, 构建了该蛋白的原核表达载体, 纯化得到了 mvegfrd-4/gst 融合蛋白并对其免疫原性及生物学活性进行了相关检测, 为进一步以其为靶位构建抗肿瘤血管生成治疗性疫苗的研究奠定基础材料和方法. 材料孕龄 4 d 雌性 Balb/c 小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心 ; 质粒 pet-4a 感受态大肠杆菌 E.coli.DH5α 和 E.coli.BL(DE3) 为本实验室保存 ; pd8-t 载体及 T 4 DNA 连接酶为 TaKaRa 产品 ;DNA 限制性内切酶 unⅠ 和 XhoⅠ 购自 New England Biolabs; 所用 PCR 引物均由 Invitrogen 合成 ;DNA 片段纯化试剂盒 DNA 片段凝胶回收试剂盒质粒小量提取试剂盒均购自北京三博远志生物技术有限公司 ;Trizol 为 Invitrogen 产品 ;DEPC 购自 Sigma,RT-PCR 试剂盒 (ReverTra Ace-α) 购自 TOYOBO; 兔抗人 VEGFR 单克隆抗体为 Cell Signaling 产品 ; 兔抗小鼠 IgG 抗体和 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 抗体购自北京中杉金桥公司 ; Western blotting 超敏发光液购自普利莱公司 ;IPTG 购自 Promega; 标准相对分子质量蛋白 arker 购自 Bio- Rad; 谷胱甘肽琼脂糖凝胶 Glutathione Sepharose T 4B 纯化试剂购自 GE Healthcare;Human Endothelial-HSF 培养基和 Ⅰ 型胶原酶为 Gibco 产品 ; 胎牛血清为 Hyclone 产品 ; 内皮细胞生长支持物 (ECGS) 购自北京迈晨科技有限公司 ; 健康新生儿脐带在征得产妇及家属同意后, 由北京中西医结合医院妇产科协助取得. 方法.. mvegfrd-4 基因的扩增根据 Gene Bank 中小鼠 VEGFR 序列 ( 序列号 :GI:5793) 选取编码 -46 氨基酸的第碱基 (50 ) 作为目的基因, 该区域包含 VEGFR 胞外 -4IgG 样结构域, 设计上下游引物, 分别引入 unⅠ 和 XhoⅠ 酶切位点 ( 划线部分 ): 上游引物 F:5'-CGCAATTGATGGAGAGCAAGGC- GCTG-3'; 下游引物 R:5'-CGCTCGAGAGAGACCAT- GTGGCTCTG-3' 用 Trizol 一步法提取小鼠胚胎组织中的总 mrna, 按照 TOYOBO 公司逆转录试剂盒说明书逆转录为 cdna, 以其为模板进行 PCR 扩增 PCR 反应条件为 :95 预变性 5 min;94 变性 45 s,56 退火 45 s,7 延伸 90 s, 扩增 5 个循环 ;7 继续延伸 5 min 取反应产物 50 μl 琼脂糖凝胶电泳, 胶回收纯化 PCR 产物将 PCR 产物连入 pd8-t 载体, 连接产物转化入感受态细菌 E.coli. DH5α, 挑取阳性克隆, 提取质粒, 送 Invitrogen 公司测序, 测序比对正确的质粒命名为 pd8-t-mvegfrd-4.. mvegfrd-4 原核表达载体的构建及鉴定将测序正确的质粒 pd8-t-mvegfrd-4 和 pet-4a 载体分别用 unⅠ 和 XhoⅠ 双酶切, 酶切产物纯化后用 T 4 DNA 连接酶连接, 连接产物转化感受态菌 E.coli. DH5α, 卡那霉素平板筛选阳性克隆, 提取阳性克隆质粒, 用 unⅠ 和 XhoⅠ 双酶切及 PCR 鉴定正确的质粒送测序, 测序正确的质粒命名为 pet-4amvegfrd-4..3 mvegfrd-4/gst 融合蛋白的诱导表达分别将重组表达质粒 pet-4a-mvegfrd-4 及 pet-4a 空载体转化至感受态菌 E.coli.BL(DE3) 中, 挑取阳性克隆,37 培养过夜分别将 50 μl 上述两种菌液接种于 5 ml Kana 抗性 LB 培养基中,37 振荡培养至 D , 分别取出 ml 未诱导的菌液作为对照, 其余液体加入 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/l,8 诱导培养 6 h 后分别取 ml 菌液放到离心管中,4, 000 r/min 离心 min, 弃上清后用 80 μl PBS 重悬, 加入 5 SDS 上样缓冲液 0 μl,00 加热 5 min, 进行 0% 的 SDS-PAGE 电泳分析, 鉴定融合蛋白的诱导表达..4 mvegfrd-4/gst 融合蛋白的纯化对含重组质粒 pet-4a-mvegfrd-4 的 E.coli.BL(DE3) 菌落进行大量扩增,37 培养至菌液 D 时, 加入 IPTG 终浓度为 0.5 mmol/l,8 诱导培养 6 h 4, 8000 r/min 离心 5 min 收集菌体, 用 8 ml 预冷的 PBS 溶液重悬菌体后超声波碎菌,4, 000 r/min 离心 30 min 收集上清液进行纯化具体纯化操作参照 GE Healthcare 公司的 Glutathione Sepharose T 4B 纯化试剂说明书进行将得到的蛋白样品测浓度后分装保存于 -70 冰箱备用取部分样品用 5 SDS 上样缓冲液处理后进行 0% 的 SDS-PAGE 电泳分析..5 mvegfrd-4/gst 融合蛋白的 Western blotting 检测融合蛋白 mvegfrd-4/gst 经 0% SDS- PAGE 电泳分离后电转移至 PVDF 膜, 用含 5% 脱脂牛奶的 TBST 室温封闭 h, 500 稀释兔抗人 VEGFR 单克隆抗体孵育过夜,TBST 洗膜 3 次,0 min/ 次, 最后加入 000 稀释的 HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体,37 孵育 h,tbst 洗膜 3 次,0 min/ 次, 显影未诱导的转化 pet-4a-mvegfrd-4 质粒的菌液总蛋白按相同步骤操作, 设为对照..6 ELISA 检测纯化的 mvegfrd-4/gst 融合蛋白用包被液将纯化后的 mvegfrd-4/gst 融合蛋白稀释至 μg/ml,00 μl 包被 96 孔 ELISA 酶标板,4

5 过夜 PBST洗板3次 min/次 % BSA 37 封闭 h PBST 洗板3次 min/次各孔分别加入按照 00 00 400 800 600 300 稀释兔抗人 VEGFR单克隆抗体00 μl 并以同型无关抗体兔抗小鼠 IgG 抗体作阴性对照以 PBS 为空白对照每个浓度设立3个复孔 37 孵育 h PBST洗板3次 min/次加入 000 稀释的 HRP

% Ⅰ型胶原酶 37 消化约 0 min 收集细胞悬液离心重悬后接种于含0%胎牛血清及 % ECGS 的 Human Endothelial-HSF 培养基中于37 5% CO培养箱中培养.

3 5 过夜 PBST洗板3次 min/次 % BSA 37 封闭 h PBST 洗板3次 min/次各孔分别加入按照稀释兔抗人 VEGFR单克隆抗体00 μl 并以同型无关抗体兔抗小鼠 IgG 抗体作阴性对照以 PBS 为空白对照每个浓度设立3个复孔 37 孵育 h PBST洗板3次 min/次加入 000 稀释的 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 50 μl 37 孵育 h PBST 洗板 3 次 TB 底物显色后以 mol/l HSO4终止 D450测定吸光度值..7 人脐静脉血管内皮细胞 HUVEC 的分离和培养按文献报道方法分离和培养 HUVEC 细胞 9 简述如下取长度约 0 cm 的新鲜脐带 PBS 反复冲洗脐带静脉内残存的血液后用 0.% Ⅰ型胶原酶 37 消化约 0 min 收集细胞悬液离心重悬后接种于含0%胎牛血清及 % ECGS 的 Human Endothelial-HSF 培养基中于37 5% CO培养箱中培养..8 mvegfrd-4/gst 融合蛋白阻断 VEGF 促 HUVEC 增殖作用的检测将传代 3 代后的 HUVEC 接种于4孔板中 05/孔分为3组每组设4个复孔第组空白组用含0%胎牛血清的Human EndothelialHSF培养基培养第组条件培养基组用含0%胎牛血清及 % ECGS 的 Human Endothelial-HSF 的完全条件培养基培养第3组阻断组用上述完全条件养基培养同时加入 0 μg/孔的 mvegfrd-4/gst 融合蛋培养7 h后倒置显微镜下观察细胞生长状态并采用细胞计数板计数 HUVEC 的数量结果用均数±标准差表示.3 统计学处理应用 SPSS6.0 软件进行统计学分析组间比较采用卡方检验以P<0.05为差异有统计学意义结果. mvegfrd-4目的基因的扩增及序列测定用 Trizol 一步法成功提取小鼠胚胎组织中的总 mrna 反转录成 cdna 后作为模板进行 PCR 反应成功扩增出约为50 目的条带经%琼脂糖凝胶电泳分析与预期的片段长度一致图连接入 pd8-t 载体后测序证实与 GenBank 中公布的序列一致序列号 GI:5793. pet-4a-mvegfrd-4重组质粒的鉴定将纯化后的目的基因片段连接入 pet-4a 载体中构建成重组质粒 pet-4a-mvegfrd-4 该重组质粒用unⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定可以获得约为50 的基因片段图鉴定正确的质粒送测序将测序正确的重组质粒命名为pET-4a-mVEGFRD-4.3 mvegfrd-4/gst 融合蛋白的诱导表达及纯化的SDS-PAGE分析图 mvegfrd-4目的抗原基因琼脂糖电泳图 Fig. Agarose gel electrophoresis of the RT-PCR product of mvegfrd-4 gene. : DNA arker 000; Lane : Fragment of mvegfrd-4 gene (50 ) 图重组质粒pET-4a-mVEGFRD-4酶切鉴定电泳图 Fig. Identification of the recombinant plasmid pet-4amvegfrd-4 by enzyme digestion. : DNA arker 000 mvegfrd-4; Lane : Purified DNA fragment of mvegfrd-4 with an identical sequence to that retrieved in GenBank (50 ); Lane : Purified pet-4a vector digested by un Ⅰ and Xho Ⅰ (5300 ); Lane 3: Recombinant plasmid pet-4a-mvegfrd-4 (6550 ); Lane 4: Identification of the recombinant plasmid pet4a-mvegfrd-4 by unⅠ and XhoⅠ enzyme digestion; : DNA arker 在预试验中通过对IPTG浓度诱导温度和时间进行了一系列的优化最终确定融合蛋白可溶性表达最佳诱导条件为 IPTG 终浓度为 0.5 mmol/l 8 诱导 6 h 纯化后的融合蛋白经 SDS-PAGE 分析可见一条清晰的相对分子质量约为70 000的条带 4号泳道箭头所指与预期的蛋白大小相符图 3 pet-4a 空载体可见诱导的GST蛋白的表达号泳道箭头所指.4 mvegfrd-4/gst 融合蛋白的 Western blotting 检测 mvegfrd-4/gst融合蛋白应用特异性的抗小鼠VEGFR抗体可以检测到相对分子质量与预期大小一致的特异性条带图4 证实纯化得到的该融合蛋白具有与特异性抗体结合的能力

6.5 间接ELISA法鉴定mVEGFRD-4/GST融合蛋白的抗原性以纯化后的 mvegfrd-4/gst 融合蛋白按 00 稀释后包被酶标板用不同稀释倍数的兔抗小鼠 VEGFR 抗体对包被蛋白进行 ELISA 检测以同型无关抗体兔抗鼠IgG作阴性对照每个稀释度做3个复孔所有数据用均数±标准差计算以抗体浓度为横坐标 (x) 以 D450 值为纵坐标(y)绘制曲线

55 05/孔]相比含 ECGS 的完全条件培养基能促进 HUVEC 细胞的增殖 [细胞计数 5.38±.0 05/孔 P<0.0] 且细胞生长状态良好而阻断组中细胞计数[3.96±0.6 05/孔] 纯化得到的mVEGFRD-4/GST融合蛋够部分阻断完全条件培养基中 VEGF 对 HUVEC 增殖的促进作用 P< 0.

是目前各种抗肿瘤血管生成研究中最吸引人的靶位 0 正常情况下机体对自身抗原具有免疫耐受性不产生免疫应答但通过交叉抗原和非特异性免疫细胞刺 A r 50 000 50 000 00 000 75 000 3 4 5 50 000 37 000 5 000 0 000 图 3 mvegfrd-4/gst 融合蛋白的诱导表达及其纯化产物的SDS-PAGE分析 Fig.

: Prestained protein ladder; Lane : Bacterial lysates of cells containing pet-4a vector without induction; Lane : Lysates of E.

4 6.5 间接ELISA法鉴定mVEGFRD-4/GST融合蛋白的抗原性以纯化后的 mvegfrd-4/gst 融合蛋白按 00 稀释后包被酶标板用不同稀释倍数的兔抗小鼠 VEGFR 抗体对包被蛋白进行 ELISA 检测以同型无关抗体兔抗鼠IgG作阴性对照每个稀释度做3个复孔所有数据用均数±标准差计算以抗体浓度为横坐标 (x) 以 D450 值为纵坐标(y)绘制曲线并计算得到线性回归方程为y=0.7938x 相关系数R=0.9944>0.9 可判定为 y 与 x 之间为高度线性相关因此可以判断纯化得到的mVEGFRD-4/GST融合蛋白具有较高的抗原特异性及灵敏性.6 mvegfrd-4/gst融合蛋白生物学活性检测与空白组[细胞计数.8± /孔]相比含 ECGS 的完全条件培养基能促进 HUVEC 细胞的增殖 [细胞计数 5.38±.0 05/孔 P<0.0] 且细胞生长状态良好而阻断组中细胞计数[3.96±0.6 05/孔] 纯化得到的mVEGFRD-4/GST融合蛋够部分阻断完全条件培养基中 VEGF 对 HUVEC 增殖的促进作用 P< 0.0 并且细胞的生长状态较差图5 3 讨论近年来各种以肿瘤血管生成相关刺激因子及其受体为靶位的抗肿瘤血管生成治疗已经成为肿瘤学治疗领域及基础研究领域的热点由于 VEGF/VEGFR 信号传导不仅在生理性血管生成而且在病理性血管生成中都是最重要的限速步骤在各种实体肿瘤如黑色素瘤乳腺癌膀胱癌及肾癌等中均发挥重要作用因此 VEGF 及 VEGFR 是目前各种抗肿瘤血管生成研究中最吸引人的靶位 0 正常情况下机体对自身抗原具有免疫耐受性不产生免疫应答但通过交叉抗原和非特异性免疫细胞刺 A r 图 3 mvegfrd-4/gst 融合蛋白的诱导表达及其纯化产物的SDS-PAGE分析 Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expressed and purified products of mvegfrd-4/gst fusion protein. : Prestained protein ladder; Lane : Bacterial lysates of cells containing pet-4a vector without induction; Lane : Lysates of E. coli cells containing pet-4a vector after induction; Lane 3: Lysates of E. coli cells containing pet-4a-mvegfrd-4 without induction; Lane 4: Lysates of E. coli cells containing pet-4a-mvegfrd-4 after induction; Lane 5: Purified mvegfrd-4/gst fusion protein. 图 4 mvegfrd-4/gst 融合蛋白的 Western blotting鉴定 Fig.4 Identification of mvegfrd-4/gst fusion protein by Western blotting. Lane : Purified mvegfrd-4/gst fusion protein; Lane : Negative control (lysates of E. coli cells containing the recombinant plasmid without induction). 激剂等均可诱导自身免疫反应并通过多种途径作用于靶抗原所在的细胞或组织许多异种同源分子在生物进化过程中相对保守有研究表明鹌鹑 VEGFR 氨 B C 图5 倒置显微镜下观察mVEGFRD-4/GST融合蛋白阻断VEGF对HUVEC的促增殖作用 Fig.5 Blocking effects of mvegfrd-4/gst fusion protein on VEGF-induced HUVEC proliferation (Inverted microscope, original magnification: 00). A: Blank group; B: Conditional medium group; C: VEGF blocking group.

5 7 基酸序列与人和小鼠分别有 70% 和 67% 相同 [], 与编码 VEGFR 胞膜外区全长序列的基因疫苗相比, 编码胞膜外 ~4 结构域的基因疫苗同样能够降低免疫小鼠血清中 VEGF 水平 [], 产生特异性抗体, 激活淋巴细胞, 减少肿瘤转移率延长肿瘤潜伏期及荷瘤小鼠的存活时 [3] [4] 间此外,Konner 等在动物模型中已证实 VEGF- Trap( 一种可溶性重组血管内皮生长因子受体, 通过与 VEGF 结合阻止其与 VEGFR 的结合, 并且比 VEGF 单抗与 VEGF 的结合更紧密, 对 VEGF 功能的抑制更完全 ) 能有效抑制肿瘤血管形成, 导致肿瘤处于几乎完全无血 [5] 供的状态, 从而抑制肿瘤生长 ; 金璐等研究表明, 小鼠 svegfr 同样具有阻断异种 HUVEC 的 VEGF/VEGFR 信号传导通路的作用由于目前以 VEGFR 为靶点的抗肿瘤免疫治疗研究的靶抗原多集中在胞膜外区 -4 结构域, 且临床前评价大多都在小鼠或转基因小鼠荷瘤模型中进行, 因此, 获得具有良好免疫原性的小鼠 VEGFR 胞外 -4 结构域蛋白对于这方面的研究具有重要作用, 可以用于评价血清中抗 VEGR 抗体水平致敏 DC 制备单克隆抗体以及对免疫治疗机制方面的研究将目的蛋白与 GST 以融合蛋白形式在大肠杆菌 BL 中表达是目前使用非常广泛的表达系统之一, 它不仅表达量高, 而且具有纯化方便的优点 [6] 本研究中, 我们将 RT-PCR 扩增得到的小鼠 VEGFR 胞外 -4IgG 样结构域的编码基因连接到原核表达载体 pet-4a 中, 并在大肠杆菌 E.coli.BL(DE3) 中诱导表达, 实现了对 mvegfrd-4/gst 融合蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达及纯化对纯化得到的 mvegfrd-4/gst 融合蛋白进行了 Western blot 检测, 证实该蛋白能与特异性抗体发生反应 ; 同时对该蛋白进行 ELISA 检测, 且其 D 450 值与抗体浓度变化呈高度线性相关, 证实该蛋白具有良好的抗原性 ; 进一步的体外细胞培养实验表明该融合蛋白可能通过中和培养基中的 VEGF, 竞争性抑制 VEGF 与 HUVEC 表面的 VEGFR 结合, 阻断 VEGF/VEGFR 信号通路, 从而抑制 HUVEC 增殖, 发挥类似于 VEGF-Trap 的功效, 理论上能够抑制新生血管形成, 有望为肿瘤抗血管生成主动免疫治疗提供一种新的选择, 同时也为进一步以小鼠 VEGFR 为靶位的抗肿瘤血管生成的主动免疫治疗研究奠定了坚实基础参考文献 : [] Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications[j]. N Engl J ed, 97, 85(): 8-6. [] Robert RR. Vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling in tumor progression[j]. Crit Rev Oncol Hematol, 007, 6(3): [3] Roskoski R Jr. VEGF receptor protein-tyrosine kinases: Structure and regulation[j]. Biochem Biophys Res Commun, 008, 375(3): [4] Ferrara N, Gerber HP, Lecouter J. The biology of VEGF and its receptors[j]. Nat ed, 003, 9(6): [5] Holash J, Davis S, Papadopoulos N, et al. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 00, 99(7): [6] Shinkai A, Ito, Anazawa H, et al. apping of the sites involved in ligand association and dissociation at the extracellular domain of the kinase insert domain-containing receptor for vascular endothelial growth factor[j]. J Biol Chem, 998, 73(47): [7] Wei YQ. Immunotherapy of tumors with vaccines based on xenogeneic homologous molecules[j]. Anticancer Drugs, 00, 3 (3): [8] Liu JY, Wei YQ, Yang L, et al. Immunotherapy of tumors with vaccine based on quail homologous vascular endothelial growth factor receptor-[j]. Blood, 003, 0(5): [9] Baudin B, Bruneel A, Bosselut N, et al. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells[j]. Nat Protoc, 007, (3): [0]Ferrara N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors[j]. Nat Rev Cancer, 00, (0): []Folkman J. Tumour angiogenesis[j]. Adv Cancer Res, 985(43): []Dong J, Yang J, Chen Q, et al. A comparative study of gene vaccines encoding different extracellular domains of the vascular endothelial growth factor receptor in the mouse model of colon adenocarcinoma CT-6[J]. Cancer Biol Ther, 008, 7(4): [3]Holash J, Thurst OG, Rudge JS, et al. Inhibitors of growth factor receptors, signaling pathways and angiogenesis as therapeutic molecular agents[j]. Cancer etastasis Rev, 006, 5(): [4]Konner J, Dupont J. Use of soluble recombinant decoy receptor vascular endothelial growth factor trap (VEGF Trap) to inhibit vascular endothelial growth factor activity[j]. Clin Colorectal Cancer, 004, 4(Suppl ): S8-5. [5] 金璐, 赵玉伟, 李知勉, 等. 真核表达人和鼠可溶性 VEGFR 的双基因疫苗的构建及抗肿瘤实验研究 [J]. 四川大学学报 : 医学版, 00, 4(4): [6] 董金凯, 罗津, 阎瑾琦, 等. 小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达纯化及抗原活性检测 [J]. 南方医科大学学报, 0, 3(4): ( 编辑 : 黄开颜 )

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502 南方医科大学学报 J South Med Univ 202;32(4) 基础研究小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达纯化及抗原活性检测董金凯 2 罗津 3 阎瑾琦 2 张亮 2 高江平于继云 2 中国人民解放军总医院泌尿外科北京 00853 2 军事医学科学院基础医学研究所北京 00850 3 湖南省永州市人民医院湖南永州 425000 摘要目的 RT-PCR 扩增小鼠前列腺干细胞抗原