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瑛糊许
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1 第 40 卷分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究第期 202 年月 Chinese Journl of Anlyticl Chemistry ~ DOI:0.3724/SP.J 分子印迹电位型传感器快速检测猪尿液中的克罗特罗梁荣宁高奇,2 秦伟 * ( 中国科学院烟台海岸带研究所, 中国科学院及山东省海岸带环境过程重点实验室, 烟台 ) 2 ( 中国科学院研究生院, 北京 00049) 摘要以盐酸克伦特罗为模板分子, 采用沉淀聚合法合成了克伦特罗的分子印迹聚合物, 并以其为离子载体, 制得分子印迹聚合物膜克伦特罗离子选择性电极在最优实验条件下, 电极对克伦特罗阳离子的检出限可达 mol/l, 线性范围为 ~ mol/l, 能斯特斜率为 55.7 mv/decde 此电极具有优越的选择性快速的响应时间以及良好的稳定性 ; 已成功应用于实际猪尿样品中克伦特罗的测定, 加标回收率为 98% ~07%, 检测时间小于 3 min 关键词分子印迹聚合物 ; 电位型传感器 ; 克伦特罗引言瘦肉精的主要化学成分包括克伦特罗莱克多巴胺以及沙丁醇胺等, 其中在中国使用最广泛的是克伦特罗克伦特罗是一种肾上腺素类神经兴奋剂, 早期仅用于医学急救和肺病平喘 ; 后来发现, 将其作为饲料添加剂用于畜牧生产时, 可以提高动物瘦肉率然而, 克伦特罗使用后会在动物体组织中残留, 人食用后会对肝肾等内脏器官造成损害, 严重者甚至会死亡 [] 20 年, 我国相继发生的瘦肉精事件, 引起了人们对克伦特罗的高度关注, 因此开发生物样品中克伦特罗检测方法具有重要意义目前, 检测克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法 (HPLC) [2] 气相色谱 - 质谱法 (GC-MS) [3] 金标快速检测卡以及酶联免疫法 (ELISA) [4] 等然而,HPLC 和 GC-MS 法存在仪器成本高, 分析速度慢等缺点 ; 金标快速检测卡法的假阳性率高, 干扰因素较多 ;ELISA 法多用于定性检测, 难以进行准确定量化学传感器因其具有操作简单携带方便易于现场监测等优越性能而备受关注聚合物敏感膜离子选择性电极是化学传感器的重要分支, 它具有装置简单成本低廉选择性高等诸多优点, 已成功应用于工业分析临床化验环境监测等领域 [5~7] 然而, 采用离子选择性电极电位法检测克伦特罗的研究还未见报道分子印迹聚合物 (MIPs) 是通过分子印迹技术合成对目标分子具有特异性识别功能的聚合物 [8] MIPs 能够显著提高分析方法的选择性和灵敏度, 且 MIPs 具有较强的稳定性, 可以抵抗检测的恶劣环境因此 MIPs 是离子选择性膜电极在复杂基体中实现可靠检测的理想离子载体本研究以克伦特罗分子印迹聚合物作为离子载体, 采用离子选择性电极法, 实现了猪尿液中克伦特罗的快速高灵敏高选择性电位检测 2 实验部分 2. 仪器与试剂 PXSJ-26 离子计 ( 上海精科公司 );DU-800 紫外 / 可见光分光光度计 ( 美国 Beckmn 公司 );S-4800 冷场发射扫描电镜 ( 日本日立公司 ) 盐酸克伦特罗标准品 ( 中国食品药品检定研究院 ); 甲基丙烯酸 (MAA) 甲基丙烯酸甲酯 (MMA) 丙烯酸三甲氧基丙烷三甲酯 (TRIM) 二乙烯基苯 80(DVB 80) 高分子量聚氯乙烯 (PVC) 邻硝基苯辛醚 (o-npoe) 四 (3,5- 二 ( 三氟甲基 ) 苯基 ) 硼酸钠 (NTFPB) 四氢呋喃 (THF) 及盐酸莱克多巴胺 (Sigm- Aldrich 公司 ); 偶氮二异丁腈 (AIBN, 天津科密欧化学试剂有限公司 ) MAA TRIM DVB 80 以及 THF 收稿 ; 接受本文系国家自然科学基金 (No ) 山东省自然科学杰出青年基金 (No.JQ20084) 以及山东省泰山学者人才计划项目资助 * E-mil: wqin@ yic.c.cn

0890 分子印迹电位型传感器快速检测猪尿液中的克罗特罗梁荣宁高奇,2 秦伟 * ( 中国科学院烟台海岸带研究所, 中国科学院及山东省海岸带环境过程重点实验室, 烟台 264003) 2 ( 中国科学院研究生院, 北京 00049) 摘要以盐酸克

2 分析化学第 40 卷使用前须真空蒸馏,AIBN 使用前经甲醇重结晶, 其余试剂均为分析纯试剂直接使用实验用水均为二次去离子水 (Pll Cscd,8.2 MΩ cm) 0. mmol/l 克伦特罗 (pk =9.6) 溶液采用 5 mmol/l Tris-HCl 缓冲溶液 (ph 7.4) 配制, 以保证克伦特罗以阳离子形式存在 ; 其余浓度均采用缓冲溶液逐级稀释得到 2.2 克伦特罗分子印迹聚合物的合成 [9] 采用沉淀聚合法合成克伦特罗分子印迹聚合物, 具体合成步骤如下 : 取 0.4 mmol 盐酸克伦特罗 2.5 mmol MAA 和 0.83 mmol MMA, 溶于 40 ml 甲醇中, 静置 h 将 mmol TRIM 和 0.4 mmol DVB 及 0.5 mmol AIBN 加入到上述混合物中, 通氮气 0 min 将上述反应容器在氮气氛围下密封, 于 70 下反应 24 h, 得到白色固体颗粒将所得白色固体颗粒分别采用甲醇 - 乙酸溶液 (9,V/V) 及甲醇多次洗涤, 直至洗脱液于紫外光谱下 λ=245 nm 处无吸收峰为止非分子印迹聚合物 (NIP) 的制备步骤除不加入盐酸克伦特罗外, 其余均与分子印迹的制备过程相同模板克伦特罗分子以及功能单体 MAA 与 MMA 的分子结构式如下所示 : 2.3 分子印迹聚合物膜离子选择性电极的制备电极膜由分子印迹聚合物 (MIP) 或非分子印迹聚合物 (NIP) 亲脂性的阳离子交换剂 (NTFPB) 增塑剂 (o-npoe) 和膜基体 (PVC) 组成取 5.0% (w/w)mip 或 NIP.0% (w/w)ntfpb 62.6% (w/w) o-npoe 及 3.4% (w/w)pvc, 共 mg, 溶于 3.5 ml THF 中, 得到电活性物质溶液搅拌 2 h 至溶液均匀后, 倒入直径为 3.6 cm 的玻璃圆环中, 室温下自然挥发 2 h, 即得分子印迹聚合物敏感膜利用打孔器将敏感膜切割成直径 9 mm 的均匀圆形切片, 采用 THF 将敏感膜粘附于聚氯乙烯管顶端测定电极对克伦特罗的电位响应时, 电极内充液和活化液均为 mol/l 克伦特罗溶液 (5 mmol/l Tris- HCl 溶液,pH 7.4), 使用前活化 24 h 测定选择性系数时, 电极内充液和活化液均为 0.0 mol/l NCl, 使用前活化 24 h 2.4 检测方法以自制分子印迹电极为工作电极,Ag/AgCl 电极为参比电极, 采用 PXSJ-26 离子计记录电极电位其中, 测试电池的结构为 :Hg 2 Cl 2, Hg KCl( 饱和溶液 ) 待测液 PVC 敏感膜内充液 Ag, AgCl (3 mol/l KCl) 采用 Henderson 公式和 Debye-Hückel 方程分别对液接电位及活度系数进行校正 3 结果与讨论 3. MIP 与 NIP 形貌表征采用扫描电镜对所合成的克伦特罗 MIP 与 NIP 颗粒进行了形貌表征如图所示, 沉淀聚合所得图 Fig. 克伦特罗分子印迹聚合物以及非印迹聚合物颗粒的扫描电镜图 SEM imges of the obtined () clenbuteroḻ MIP nd (b) NIP beds

5 mmol MAA 和 0.83 mmol MMA, 溶于 40 ml 甲醇中, 静置 h 将 mmol TRIM 和 0.4 mmol DVB 及 0.

3 第期梁荣宁等 : 分子印迹电位型传感器快速检测猪尿液中的瘦肉精 [0] 到的 MIP 颗粒粒径较规整均一, 粒径多分布在 0.5~.0 mm 之间根据本研究组已报道的研究结果可知, 与主体聚合所得到的不规则粒径颗粒相比, 粒径均一的 MIP 颗粒较易分散于 PVC 基体的聚合物膜相中, 从而使得膜相中产生更多的有效键合位点本研究发现, 采用粒径均一的 MIP 颗粒作为载体的电极响应时间较短, 且电位噪音较小由图 b 可知,NIP 与 MIP 颗粒具有类似的表观形貌与粒径分布 3.2 电极膜组成优化聚合物膜组成对电极响应性能有重要影响本离子选择性电极膜组分包括 MIP NTFPB 增塑剂及 PVC 其中,MIP 是离子载体 MIP 上的功能单体 MAA 和 MMA 中的氧基可与克伦特罗分子中的氨基形成较强的氢键作用, 选择性地识别克伦特罗阳离子, 并将其萃取入有机膜相 ;NTFPB 作为阳离子交换剂, 不仅可以提供阳离子位点及电极的选择性, 而且有利于降低电极膜阻抗 ; 增塑剂可以将离子载体与离子位点均匀溶解于膜中, 并促进膜内离子的迁移 ;PVC 构成膜的基体部分, 保证有机液膜具有良好的机械稳定性如表所示, 离子交换剂含量对电极响应性能有较大影响随着离子交换剂含量增加, 电极能斯特响应范围逐渐变宽, 但当其含量超过 % 时, 电极响应范围变窄, 推测可能为离子交换剂量越大, 膜上阳离子位点越多, 导致膜对干扰离子选择性降低离子载体 MIP 的含量决定了电极膜上选择性键合位点的数量, 伴随着 MIP 的加入, 电位线性响应范围逐渐变宽 ; 然而, 当 MIP 的量大于 5% 时,MIP 在膜相中难以完全分散, 膜变得不透明, 导致电极响应性能降低另外, 极性增塑剂 o-npoe( 介电常数 εr =24.0) 与非极性增塑剂 DOS(εr =4.8) 或 DOP(εr =5.0) 相比, 相应电极具有更宽的线性响应范围这可能是由于在极性条件下, 电极对于克伦特罗阳离子具有更高的选择性本实验中, 膜电极的最佳组成为 3.3% (w/w)pvc,62.7% (w/w)npoe,% (w/w)ntfpb,5% (w/w)mip 表膜组成对电极响应的影响 Tble Influence of membrne composition on theelectrode response PVC 增塑剂 Plsticizer NPOE DOS DOP NTFPB MIP 线性范围 Liner rnge (mol/l) 斜率 Slope (mv/decde) ~ ± ~ ± ~ ± ~ ± ~ ± ~ ± ~ ±0.5 3 次测量平均值 ± 标准偏差 (Averge from three mesurements ±stndrd devition) 3.3 溶液 ph 值的影响在 ph ~ 范围内, 考察了样品酸度对电极电位检测的影响, 结果如图 2 所示在 ph 7.0~ 8.5 范围内, 电极电位响应基本恒定当 ph>8.5 时, 电极电位逐渐下降, 这是因为随着溶液 ph 值升高, 克伦特罗将逐渐以电中性分子形式存在, 而无法被离子选择性电极所检测 ; 当 ph< 7.0 时, 电极电位响应逐渐降低, 其原因可能是克伦特罗在酸性条件下发生 [] 水解反应, 导致其浓度减小 3.4 电极校正曲线图 2 样品溶液 ph 值对 0. mmol/l 克伦特罗电位检如图 3 所示, 在最佳电极膜组成条件下, MIP 膜测的影响电极响应的线性范围为 ~ mol/l, Fig.2 Effect of smple ph on the electrode response of 斜率为 55.7 mv/decde, 电极的检出限为 mmol/l clenbuterol mol/l 可以看出,MIP 膜电极与对照 (NIP) 膜电极以及空白膜 ( 不含任何印迹聚合物 ) 电极相比线性响应范围更宽检出限更低 MIP 膜电极良好的电位响

作为载体的电极响应时间较短, 且电位噪音较小由图 b 可知,NIP 与 MIP 颗粒具有类似的表观形貌与粒径分布 3.

4 分析化学第 40 卷应归因于电极敏感膜中的 MIP 与待测克伦特罗阳离子之间的强特异性键合作用, 而 NIP 膜电极以及空白膜电极的弱电位响应缘于电极膜对于克伦特罗阳离子的非特异性结合作用 3.5 选择性研究由于动物尿液样品组成复杂, 需要考虑共存离子对于电极检测的影响研究中采用分别溶液法测定电极的选择性系数 [2], 由 Nicolskii-Eisenmn 方程计算电极对干扰离子的选择性系数 KI, Jpot [3] 如表 2 所示, 所采用的分子印迹聚合物膜离子选择性电极对实际样品中常见无机干扰离子及有机胺类化合物具有良好的选择性, 其中对 N +, K +, C 2+, Mg 2+, NH + 4 及莱克多巴胺阳离子的选择性系数 logki, Jpot 分别为 -7.57,-5.94,-7.43,-7.78,-6.7 和图 3 克伦特罗分子印迹非印迹以及空白膜电极的电位响应曲线 Fig. 3 blnk membrnes Clibrtion curves for clenbuteroḻ MIP, NIP nd 由此证明, 所采用的电极适用于动物尿液中克伦特罗的电位测定另外, 分子印迹膜电极对常见的 N +, K + 的选择性比非分子印迹对照膜电极更加优越, 从而进一步证明了分子印迹方法的有效性 3.6 电极响应时间与稳定性测定了电极检测克伦特罗的响应时间 ( 达 95% 平衡电位的时间 ), 结果如图 4 所示当克伦特罗浓度在 0-5 ~ 0-4 mol/l 之间变化时, 电极响应时间小于 5 s 待测的克伦特罗溶液的浓度无论从低到高 ( 0-5 ~ 0-4 mol/l) 变化, 还是从高到低 ( 0-4 ~ 0-5 mol/l) 变化, 电极电位响应均能在相同的时间内达到相应的平衡电位值, 从而证明所研制的传感器具有良好的可逆性表 2 克伦特罗分子印迹聚合物膜电极电位选择性系数 (n=3) Tble 2 Potentiometric selectivitycoefficientsfor the MIP-bsed clenbuterol ISE (n=3) 干扰离子 Interfering ion 选择性系数 logk 干扰离子 Interfering ion 选择性系数 logk N (-6.28) Cu K (-4.96) Zn H Rctopmine ion C Ethylenedimine ion Mg NH 括号中为 NIP 膜电极的选择性系数 (Vlues in the prentheses re the selectivity coefficients for the NIP membrne electrode) 通过对电极长期稳定性考察发现 : 电极干态放置于 4 条件下储存个月后, 电位响应变化的相对偏差为 6.4% 3.7 实际样品分析将分子印迹聚合物膜离子选择性电极应用于猪尿样品中克伦特罗含量的测定, 采用标准加入法计算经 0.22 mm 微孔滤膜过滤后的猪尿样品, 测试结果见表 3 样品分析的加标回收率在 98% ~07% 之间, 说明此分子印迹电位型传感器具有较高的准确性 ; 另外, 猪尿样品仅经简单过滤而直接测定且电极响应时间较短, 总检测时间在 3 min 内因此, 本方法有望用于猪尿液样品中克伦特罗含量的快速准表 3 所研制的电极应用于不同猪尿样品加标样中克伦特罗含量的检测 Tble 3 Appliction ofthe proposed electrode to determintion of clenbuterol in pig urine smples spiked with different mounts of clenbuterol 样品 Smple 加入量 Amount dded 测定量 Amount found 回收率 Recovery (% ) ± ± ± ± 次测量平均值 ± 标准偏差 (Averge from three mesurements ± stndrd devition) 图 4 Fig.4 分子印迹聚合物膜电极响应时间测定 Test of response time of the MIP bsed ISE

的分子印迹聚合物膜离子选择性电极对实际样品中常见无机干扰离子及有机胺类化合物具有良好的选择性, 其中对 N +, K +, C 2+, Mg 2+, NH + 4 及莱克多巴胺阳离子的选择性系数 logki, Jpot 分别为 -7.57,-5.94,-7.43,-7.

5 第期梁荣宁等 : 分子印迹电位型传感器快速检测猪尿液中的瘦肉精确检测 References vnvynchtg,preeces,gsprp,mghuiṉrogisterg,depuwe.j.chromtogr.a,996,750(-2):43~49 2 WU YiṉLing,YANG Ting,SHAN Ji-Ho,HUANGFU Wei-Guo.ChineseJ.Anl.Chem.,200,38(6): 833~837 吴银良, 杨挺, 单吉浩, 皇甫伟国. 分析化学,200,38(6):833~837 3 WU YiṉLing,LIXio-Wei,LIU Su-Ying,SHENJiṉZhong,YANG Ting.ChineseJ.Anl.Chem.,2006, 34(8):083~086 吴银良, 李晓薇, 刘素英, 沈建忠, 杨挺. 分析化学,2006,34(8):083~086 4 RodA,MnetAC,PizzF,SimoniF,LeliR.Tlnt,2000,52(2):3~38 5 SoklskiT,CeresA,ZwicklT,PretschE.J.Am.Chem.Soc.,997,9(46):347~348 6 BkkerE,PretschE.Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46(30):5660~ DingJW,Qin W.J.Am.Chem.Soc.,2009,3(4):4640~464 8 HuptK,MosbchK.Chem.Rev.,2000,00(7):2495~ YoshimtsuK,ReimhultK,KrozerA,MosbchK,SodeK,YeL.Anl.Chim.Act,2007,584():2~2 0 LingR N,SongD A,ZhngR M,Qin W.Angew.Chem.Int.Ed.,200,22(4):260~263 ShnJ,PnC,ZhngJ,Niu W.ActChromtogr.,2008,20():43~57 2 BkkerE.J.Electrochem.Soc.,996,43(4):L83~L85 3 Smith MJ,MnhnSE.Anl.Chem.,973,45(6):836~839 PotentiometricSensorBsedon MoleculrlyImprintedPolymerfor RpidDetermintionofClenbuterolinPigUrine LIANG Rong-Ning,GAO Qi,2,QIN Wei * (ChineseAcdemyofSciencesndShndongProvincilKeyLbortoryofCostlZoneEnvironmentlProceses, YntiInstituteofCostlZoneReserch,ChineseAcdemyofSciences,Ynti264003) 2 (GrduteUniversityofChineseAcdemyofSciences,Beijing00049) Abstrct A polymeric membrneioṉselectiveelectrodeforthe determintion ofclenbuterolis described.itisbsedonmoleculrlyimprintedpolymer(mip)snionophoreformoleculrrecognition,whichcnbesynthesizedbyprecipittionpolymeriztionusingclenbuterolhydrochlorides templte molecule. Underthe optimized conditions,the proposed membrne electrode exhibits Nernstinresponsetotheprotontedclenbuterolovertheconcentrtionrngeof mol/lwithslopeof55.7mv/decde,ndthedetectionlimitis mol/l.themipbsedsensorshowsexcelentselectivity,rpidresponsetimendstisfctorylongṯermstbility.the potentiometricsensorhsbeensuccessfulyppliedtodeterminetheclenbuterolinpigurinesmples withrecoveriesbetween98% nd07% ndnnlyticltimeoflessthn3 min. Keywords Moleculrlyimprintedpolymer;Potentiometricsensor;Clenbuterol (Received0August20;ccepted22September20)

分析化学,200,38(6):833~837 3 WU YiṉLing,LIXio-Wei,LIU Su-Ying,SHENJiṉZhong,YANG Ting.ChineseJ.Anl.Chem.,2006, 34(8):083~086 吴银良, 李晓薇, 刘素英, 沈建忠, 杨挺.

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