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1 2016 年 6 月第 24 卷第 3 期 中国实验动物学报 ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICA June 2016 Vol. 24 No. 3 人 IL 37b 基因真核表达载体的构建与表达 研究报告 姚静 1, 程江 2, 裴雪枫 3, 王静宇 4 4, 袁明 (1. 石河子大学医学院, 新疆石河子 ; 2. 石河子大学第一附属医院检验科, 新疆石河子 ; 3. 辽宁医学院, 辽宁锦州 ; 4. 中国航天员科研训练中心, 航天医学基础与应用国家重点实验室, 北京 ) 摘要 目的构建 pegfp N1 / IL 37b 真核表达载体, 并检测其在 THP 1 细胞中的表达情况 方法从人 PBMCs 中提取总 RNA, 利用 RT qpcr 技术扩增出 IL 37b 基因编码区序列, 克隆至 pegfp N1 真核表达载体, 将构 建的重组质粒 pegfp N1 / IL 37b 转染到 THP 1 细胞中, 通过 RT qpcr 和 Western blot 检测 IL 37 的表达 结果 酶切及基因测序结果显示 IL 37b 基因正确插入真核表达载体 pegfp N1 中 ;RT qpcr 和 Western blot 结果显示转 染 THP 1 细胞后,IL 37 表达水平明显升高 (P < 0 01) 结论 FP N1 / IL 37b, 为进一步研究 IL 37 功能及与相关疾病的关系奠定基础 关键词 白细胞介素 37; 基因克隆 ; 真核表达载体 ;THP 1 细胞 成功构建了新型抗炎因子 IL 37 真核表达载体 peg 中图分类号 Q95 33 文献标识码 A 文章编号 (2016) Doi: / j. issn Construction and expression of eukaryotic expression vector of human IL 37b gene 双 YAO Jing 1, CHENG Jiang 2, PEI Xue feng 3, WANG Jing yu 4, YUAN Ming 4 (1. Medical College of Shihezi University, Shihezi , China; 2. Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Shihezi Medical University, Shihezi ; 3. Liaoning Medical College, Jinzhou ; 4. Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals and Application, China Astronaut Research and Training Center, Beijing ) Abstract Objective To construct the eukaryotic expression vector pegfp N1 / IL 37b and analyze the expression of IL 37 gene in THP 1 cells. Methods Total RNA was extracted from human peripheral blood mononuclear cells ( PB MCs) and the coding region of IL 37b gene was amplified by RT qpcr. Then, the gene was cloned into pegfp N1 eu karyotic expression vector. After transfected the recombinant plasmid into THP 1 cells, the expression of IL 37 was detec ted by RT qpcr and Western blot. Results Double restriction enzyme digestion and gene sequencing showed that IL 37b gene was correctly inserted into the eukaryotic expression vector pegfp N1. RT qpcr and Western blot showed that the IL 37 expression level was increased significantly (P < 0 01) after transfection in THP 1 cells. Conclusions We successful ly constructed a novel anti inflammatory cytokine IL 37 eukaryotic expression vector pegfp N1 / IL 37b, which lays a foun dation for further study on IL 37 functions and its association with related diseases. Key words Interlukin 37; Gene cloning; Eukaryotic expression vector; THP 1 cells Corresponding author: YUAN Ming, E mail:yuanming7711@ aliyun. com; CHENG Jiang,E mail: sina. com [ 基金项目 ] 国家重点基础研究发展计划 (973 计划 )(2014CB744404) [ 作者简介 ] 姚静 ( ), 女, 硕士, 研究方向 : 临床分子生物学诊断,E mail: yaojing_hnzz@ 163. com [ 通讯作者 ] 袁明 ( ), 男, 副研究员, 博士, 研究方向 : 空间生物学,E mail: yuanming7711@ aliyun. com; 程江 ( ), 男, 教授, 硕士, 研究方向 : 实验室管理及分子生物学,E mail: chengjiang1980@ sina. com

2 中国实验动物学报 2016 年 6 月第 24 卷第 3 期 Acta Lab Anim Sci Sin,June 2016,Vol. 24 No IL 37 作为 IL 1 家族 11 个成员之一, 最初是由 [1] Kumar 等于 2000 年利用计算机进行生物信息学 [2] 分析时发现的, 并命名为 IL 1H4 后由 Dunn 等 [3] 于 2001 年命名为 IL 1F 年,Nold 等正式 将 IL 1F7 更名为 IL 37 IL 37 基因位于人类第二 号染色体上, 共有五种不同的剪切亚型, 即 IL 37a ~ e, 其中 IL 37b 是五种亚型中分子量最大的一 个 [4, 5] IL 37 具有广泛的炎症抑制作用, 可抑制外 周血单个核细胞 树突状细胞 巨噬细胞及上皮细胞 等细胞炎症因子的产生 [3, 6], 另外在感染性休克 系 统性红斑狼疮 炎症性肠病 肝损伤 肝癌等疾病中 发挥重要作用 [3, 7 10] 本实验利用基因工程相关技 术, 从人外周血单个核细胞中成功克隆出 IL 37b 全 长编码区序列, 并构建了其真核表达载体, 且成功在 THP 1 细胞中实现了过表达, 为进一步研究 IL 37 的生物学功能奠定基础 1 材料与方法 材料 血液标本 5 ml 人外周血由本实验室课题组成员提供 质粒 菌株及细胞 pegfp N1 质粒 THP 1 细胞由本实验室保存 ; 转化态 E. coli DH5α 购自康为世纪 主要试剂 淋巴细胞分离液 LPS 购自 Sigma;Pfu DNA 聚合 酶 质粒抽提试剂盒 胶回收及 DNA 产物纯化试剂盒 购自康为世纪 ; 限制性内切酶 BamHI 及 EcoRI T4 DNA 连接酶购自 NEB; 反转录试剂盒 SYBR Green 荧光定量试剂盒购自 TaKaRa;TRIzol 试剂购自 In vitrogen;il 37 单克隆抗体购自 Abcam ( ab57187); GAPDH 单克隆抗体购自 CST(D16H11); 胎牛血清 RPMI1640 及 Opti MEM 培养基购自 Gibco; Entran stertm D4000 转染试剂购自 Engreen 实验方法 总 RNA 提取和 cdna 合成 分离健康人新鲜外周血单个核细胞于含 10% FBS 的 RPMI1640 培养基中, 加入 1 μg / ml 刺激浓 度的 LPS, 置于 37 5% CO 2 培养箱中培养 24 h, 收 集细胞 用 TRIzol 法对所收集的细胞进行总 RNA 提取, 用反转录试剂盒进行 RT PCR 合成 cdna 目的基因的扩增 根据 GenBank 中 IL 37b( NM_ ) 的序 列分别设计用于扩增 CDs 全长 (660 bp) 的上下游引物, 上游 : 5 TCGAATTCTTGAAAATGTCCTTTGT GGGG G 3, 下游 : 5 AAGGATCCATATCGCTGAC CTCACTGGGGCT 3 ( 下划线分别为 EcoRI 和 BamHI 酶切位点 ) 以合成的 cdna 为模板, 用上述引物及 Pfu DNA 聚合酶进行 PCR 扩增, 反应条件如下 [11] : 94 预变性 2 min 94 变性 30 s 60 退火 30 s 72 延伸 60 s, 共 35 个循环, 最后 72 终延伸 5 min PCR 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化 真核表达载体 pegfp N1 / IL 37b 的构建用限制性内切酶 EcoRI 和 BamHI 分别对回收的 PCR 产物和 pegfp N1 空载体进行 37 双酶切过夜, 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化后, 在 T4 DNA 连接酶作用下 16 连接过夜 将连接产物转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 转化液涂布于含卡那霉素的 LB 平板上,37 培养过夜, 次日随机挑取 8 个平板上单克隆菌落进行菌落 PCR, 筛选阳性单克隆菌落扩增提取质粒, 进一步对质粒进行双酶切及测序鉴定 THP 1 细胞的培养及转染复苏 THP 1 细胞于含 10% FBS 的 RPMI1640 培养基中, 置于 37 5% CO 2 培养箱中培养 24 h, 次日换液, 之后每隔 3 ~ 4 d 进行传代培养, 待细胞密度至 70% 左右时, 按照 EntransterTM D4000 转染说明书操作, 培养 72 h 后, 给予 1 μg / ml 的 LPS 刺激细胞, 继续培养 8 h, 离心收集细胞 重组质粒在 THP 1 细胞中的表达及检测分别提取 THP 1 细胞总 RNA 和总蛋白, 采用 RT qpcr 和 Western blot 方法检测转染前后 THP 1 细胞中 IL 37 mrna 和蛋白水平的变化 相关引物序列见表 统计分析实验数据采用 SPSS 17 0 进行统计学分析, 以 x ± s 表示, 组间比较采用 t 检验, 以 P < 0 05 为差异有统计学意义, 图表采用 GraphPad Prism 5 0 软件进行绘制分析 2 结果 2 1 IL 37b 基因扩增产物的鉴定 IL 37b 基因 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳后, 可见两条略小于 700 bp 且大小相近的一明一暗条带 ( 见图 1), 大小与预期相符

3 270 中国实验动物学报 2016 年 6 月第 24 卷第 3 期 表1 Tab 1 基因 Acta Lab Anim Sci Sin June 2016 Vol 24 No 3 实时荧光定量 PCR 扩增引物 Primer pairs for the real time PCR 引物序列 Gene name Forward IL 37b 5 GTCCAGGACCAGTACTTTGTGA 3 Reverse 5 TCTCGCTCCTGGAAGATGG 3 产物长度 bp Product length 5 CTTAGAAGACCCGGCTGGAAG 3 Reverse Forward GAPDH Sequence 145 5 CGGATTTGGTCGTATTGGG 3 216 注 M Marker a b 阴性克隆菌落 PCR 产物 1 8 阳性克隆菌落 PCR 产物 图2 注 M Marker 1 PCR 产物 图1 Fig 1 2 2 菌落 PCR 琼脂糖凝胶电泳 Note M Marker a b Negative control IL 37b 基因 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳 Note M Marker 1 PCR products Fig 2 Agarose gel electrophoresis of IL 37b PCR products 1 8 Positive colony PCR products PCR agarose gel electrophoresis of the bacterial colonies 重组质粒的鉴定 重组质粒单克隆菌落 PCR 产物琼脂糖凝胶电 泳显示 8 号菌落在略小于 750 bp 处有一明亮的 特异性条带 见图 2 对其进行增菌提取质粒 进 一步双酶 切 EcoRI BamHI 产 物 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳显示 可 见 约 4700 bp 的 载 体 片 段 和 660 bp 左 右的 目 的 基 因 片 段 见 图 3 大 小 与 预 期 相 符 DNA 测序结 果 显 示 构 建 的 重 组 质 粒 pegfp N1 IL 37b 中含 有 IL 37b 的 全 长 序 列 660 bp Blast 同源 性 分 析 显 示 与 GenBank 中 登 录 的 IL 37b 注 M Marker 1 阴性对照 2 pegfp N1 IL 37b 双酶切产物 NM 014439 3 序列相比 发 现 有 两 处 碱 基 存 在 图3 差异 即 G T 和 A G 见图 4 经查证是单核苷酸 多态性 SNP 2 3 Note M Marker 1 Negative control 2 Restriction IL 37b 在 THP 1 细胞中的表达 enzyme digestion products of pegfp N1 IL 37b 重组 质 粒 pegfp N1 IL 37b 转 染 THP 1 细 胞 Fig 3 后 RT qpcr 检测结果显示 见图 5 IL 37b 表达较 对照组明显升高 P 0 01 且给予 LPS 刺激后 差 异有显著性 P 0 001 Western blot 检测结果显示 见图 6 在 50 10 左右处可见特异性条带 与预期 3 结果相符 对条带进行光密度量化分析结果显示 IL 37 表达转染组较对照组明显升高 P 0 01 pegfp N1 IL 37b 双酶切 产物琼脂糖凝胶电泳 Agarose gel electrophoresis of restriction enzyme digestion products of pegfp N1 IL 37b 3 讨论 IL 1 超家族共有 11 个成员 绝大多数是促炎性 细胞因子 其中 7 个为激动剂 IL 1α 1L 1β IL 18 IL 33 IL 36α IL 36β IL 36γ 2 个为天然的受体拮

4 中国实验动物学报 2016 年 6 月第 24 卷第 3 期 271 Acta Lab Anim Sci Sin June 2016 Vol 24 No 3 DNA 序列比对分析部分结果 图4 Analysis of DNA sequence alignment Fig 4 抗剂 IL 1Ra IL 36Ra IL 37 作为第 7 个成员 是 一种天然的免疫抑制物 IL 37 作为一种天然的免疫 抑制物 可由 TLRs 配体以及一些促炎性细胞因子 IL 1β TNF α IFN γ 等 刺激的人外周血单个核细 胞 PBMCs 树突状细胞 DCs 诱导产生 能够抑制 多种炎症因子的表达 IL 37 基因共有 6 个外显子 通过不同的剪切 形成 5 个剪切亚型 IL 37a e 但是 不同的剪切亚型具有组织特异性 如 IL 37a b c 主要 表达于淋巴结 胸腺 骨髓 肺 睾丸 胎盘 子宫 皮 肤 结肠 NK 细胞 单核细胞 角蛋白细胞和受刺激的 B 细胞中 而 IL 37d e 只表达与骨髓和睾丸中 大脑 中仅表达 IL 37a 肾脏中仅表达 IL 37b 心脏中仅表 注 转染组与空转组相比较 P 0 05 达 IL 37c 4 值得一提的是 IL 37 是目前鼠科同系 物中唯一没有发现的 IL 1 家族成员 12 IL 37b 是五种亚型中分子量最大的一个 包含 除 3 号外显子以外的其他 5 个外显子 4 5 且 1 号 图5 Note THP 1 细胞中 IL 37b 基因 mrna 水平的表达 P 0 05 Fig 5 外显子 可 编 码 caspase 1 酶 切 位 点 IL 37b 前 体 经 P 0 01 P 0 001 P 0 01 P 0 001 for IL 37b expression vs mock transfected IL 37b mrna expression level in the THP 1 cells 注 转染组与空转组相比较 P 0 05 P 0 01 P 0 001 图6 representation of Western blot THP 1 细胞中 IL 37 蛋白水平的表达 Note Electrophoresis left and quantification right P 0 05 Fig 6 P 0 01 P 0 001 for IL 37b expression vs mock transfected IL 37 protein expression levels in the THP 1 cells

5 272 中国实验动物学报 2016 年 6 月第 24 卷第 3 期 Acta Lab Anim Sci Sin,June 2016,Vol. 24 No. 3 caspase 1 切割活化后进入细胞核内参与转录调控, 实验结果也证实在 caspase 1 催化活性缺失后,IL 37b 的入核能力丧失, 同时其炎症抑制作用下降 [13] 然而, 入核参与转录调控并不是 IL 37 发挥负向调节作用的唯一方式 研究者发现重组 IL 37 能够有效抑制脂多糖 (LPS) 引起的 IL 6 和 IL 1α 的产生, 以及胞内蛋白激酶 JNK MAPK(p38) ERK 的磷酸化, 从而实现抑制炎症信号的传导, 由此证明分泌到胞外的 IL 37 也具有抑制炎症的作用 [14] 此外 IL 37 还可通过与 IL 18Rα 结合, 进一步募集 IL 1R8, 形成一个三聚体装配在细胞表面, 抑制 LPS 与其受体 TLR4 的结合, 从而抑制炎症反应 [15] 在免疫调节方面,IL 37 可抑制树突状细胞的成熟, 使其维持在半成熟状态, 从而不能有效地发挥其在免疫应答中捕获 处理和呈递抗原的作用, 抑制免疫系统识别并且靶标新抗原的能力 [6] 一些动物实验已经证实,IL 37 在疾病的进展中, 起到保护作用, 如在脂多糖 (LPS) 诱导的感染性休克 葡聚糖硫酸钠 ( DSS) 诱导的结肠炎 刀豆素 A (ConA) 诱导的肝炎 烟曲霉菌诱导的肺部真菌感染中, 发现 IL 37 转基因小鼠的全身炎症反应 局部器官组织的损伤程度较野生对照小鼠减轻 炎症因子的产 [3, 8, 9, 生减少 16] 另外一些来源于临床样本的研究结果分析显示 [17], 不同的炎症性疾病及自身免疫性疾病中,IL 37 的表达有不同程度的上调或下调 基于 IL 37 潜在的临床应用价值, 本实验室从 LPS 刺激的 PBMCs 中成功克隆出大 IL 37b 全长序列, 通过琼脂糖凝胶电泳, 发现在略小于 700 bp 处有上下两条大小相近的一明一暗条带, 根据文献报道 [4],PBMCs 中可表达 IL 37b 和 IL 37c 两种剪切亚型, 因此我们考虑明亮且分子量稍大的条带为 IL 37b, 而另一条灰暗且分子量略小的为 IL 37c 对 IL 37b 进行胶回收及后续实验, 将 IL 37b 编码区全长序列克隆入真核表达载体 pegfp N1, 该载体含有 SV40 和 CMV 启动子及绿色荧光蛋白 GFP, 具有稳定表达 利于检测基因转染效率等优点 经酶切及测序鉴定, 发现与 GenBank 中登录的 IL 37b( NM _ ) 序列有两处碱基存在差异, 即 GGA / GTA( 甘氨酸 / 缬氨酸 ) 和 ACC / GCC ( 苏氨酸 / 丙氨酸 ), 经查证均为该基因的两处单核苷酸多态性 (SNP:rs 和 rs ) 进一步转染 THP 1 细胞, 检测到无论是否给与 LPS 刺激,IL 37 表达均显著升高, 成功地实现了其在 THP 1 细胞中的过表达, 为后续研究 IL 37 与其他免疫调节细胞因子相互作用的分子机制及与相关疾病的关系奠定基础 参考文献 [ 1 ] Kumar S, McDonnell PC, Lehr R,et al. Identification and initial characterization of four novel members of the interleukin 1 family [J]. J Biol Chem, (14): [ 2 ] Dunn E, Sims JE, Nicklin MJ,et al. Annotating genes with po tential roles in the immune system: six new members of the IL 1 family[j]. Trends Immunol, (10): [ 3 ] Nold MF, Nold Petry CA, Zepp JA,et al. IL 37 is a fundamen tal inhibitor of innate immunity [ J]. Nat Immunol, (11): [ 4 ] Boraschi D, Lucchesi D, Hainzl S,et al. IL 37: A new anti in flammatory cytokine of the IL 1 family[ J]. Eur Cytokine Netw, (3): [ 5 ] Banchereau J, Pascual V, O Garra A. From IL 2 to IL 37: The expanding spectrum of anti inflammatory cytokines[ J]. Nat Im munol, (10): [ 6 ] Luo Y, Cai X, Liu S,et al. Suppression of antigen specific adaptive immunity by IL 37 via induction of tolerogenic dendritic cells[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, (42): [ 7 ] Ye L, Ji L, Wen Z,et al. IL 37 Inhibits the production of in flammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells of pa tients with systemic lupus erythematosus: its correlation with dis ease activity[j]. J Transl Med, : 69. [ 8 ] McNamee EN, Masterson JC, Jedlicka P, et al. Interleukin 37 expression protects mice from colitis[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, (40): [ 9 ] Bulau AM, Fink M, Maucksch C,et al. In vivo expression of inter leukin 37 reduces local and systemic inflammation in concanavalin a induced hepatitis[j]. Scient World J, : [10] Zhao JJ, Pan QZ, Pan K,et al. Interleukin 37 mediates the anti tumor activity in hepatocellular carcinoma: role for CD57 + NK cells[j]. Sci Rep, : [11] 严磊, 李晶, 赵婷婷, 等. 大鼠 CB1 基因真核表达载体的构建及其对 CaSki 细胞凋亡的影响 [ J]. 中国实验动物学报, 2015, 23(02): [12] Bufler P, Azam T, Gamboni Robertson F, et al. A complex of the IL 1 homologue IL 1F7b and IL 18 binding protein reduces IL 18 activity[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, (21): [13] Bulau AM, Nold MF, Li S,et al. Role of caspase 1 in nuclear translocation of IL 37, release of the cytokine, and IL 37 inhibi tion of innate immune responses[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, (7): [14] Li S, Neff CP, Barber K,et al. Extracellular forms of IL 37 in hibit innate inflammation in vitro and in vivo but require the IL 1 family decoy receptor IL 1R8 [ J]. Proc Natl Acad Sci U S A, (8): [15] Nold Petry CA, Lo CY, Rudloff I,et al. IL 37 Requires the re ceptors IL 18Ra lpha and IL 1R8 (SIGIRR) to carry out its mul tifaceted anti inflammatory program upon innate signal transduc tion [J]. Nat Immunol, (4): [16] Moretti S, Bozza S, Oikonomou V,et al. IL 37 inhibits inflam masome activation and disease severity in murine aspergillosis [J]. PLoS Pathog, (11): e [17] Chen HM, Fujita M. IL 37: a new player in immune tolerance [J]. Cytokine, (1): [ 收稿日期 ]

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