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燥帛
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1 第 17 卷第 4 期生命科学研究灾燥造援员 7 晕燥援 4 圆园 13 年 8 月蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡 Aug. 圆园 13 人巨细胞病毒 pp65 蛋白的原核表达及活性鉴定许凤 a, 邱义兰 a, 邱果 a, 李桑 a, 何赛 a, 郑姣 a, 李小曼 a, 刘如石 a,b* 摘 ( 湖南师范大学 a. 生命科学学院 ;b. 医学院, 中国湖南长沙 ) 要 : 以病毒全基因组为模板, 通过 PCR 技术扩增 HCMV pp65 基因编码序列, 其产物连接到 pmd18 鄄 T 质粒, 酶切并回收目的片段后克隆到表达载体 pto 鄄 T 7, 然后将重组质粒 pto 鄄 T 7 鄄 pp65 转化大肠杆菌 ER 2566, 大量表达后将重组蛋白进行质谱法分析鉴定, 再利用 Western blot 以及间接 ELISA 进行重组蛋白的活性及抗原性鉴定. 结果显示 : 通过 SDS 鄄 PAGE 鉴定可知, 大肠杆菌可能表达出了重组蛋白, 质谱分析结果说明了重组蛋白为 pp65 蛋白, 具有极高可信度, 其相对分子质量约为 63 kd, 从 Western blot 和间接 ELISA 渊 enzyme linked im 鄄 munosorbent assay 冤的结果可知,pp65 蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性与免疫原性, 为制备相应的抗原诊断单克隆抗体打下了基础, 同时也为开发 HCMV IgG 快速诊断 ELISA 试剂盒提供了可选原料. 关键词 : 人巨细胞病毒 pp65 蛋白 ; 质谱 ; 酶联免疫吸附 (ELISA); 免疫反应性 ; 免疫原性中图分类号 : Q784; Q786 文献标识码 : A 文章编号 : 1007 鄄 7847(2013)04 鄄 0298 鄄 07 Expression and Immunoreactivity of Human Cytomegalovirus pp65 Protein in E. coli XU Feng a,qiu Yi 鄄 lan a,qiu Guo a,li Sang a,he Sai a,zheng Jiao a, LI Xiao 鄄 man a,liu Ru 鄄 shi a,b* (a. School of Life Science; b. Medical College, Hunan Normal University, Changsha , Hunan, China) Abstract:HCMV pp65 protein coding sequence was amplified by PCR using HCMV genome DNA as tem 鄄 plate. The PCR products were ligated to pmd18 鄄 Tvector, and then cut off by restriction enzyme and further ligated into the same enzyme digested multiple cloning site of pto 鄄 T 7 expression vector. The recombinant expression vectors were transformed into E. coli ER 2566 strains. After induction, recombinant protein expres 鄄 sion was confirmed by the mass spectrometry. The activity and immunoreactivity of pp65 protein were as 鄄 sayed by Western blot and indirect ELISA. The SDS 鄄 PAGE indicated the possible expression of recombinant pp65 protein in E. coli, and mass spectrometry examination further confirmed that the expressed recombi 鄄 nant protein was HCMV pp65 protein. The molecular weight of recombinant pp65 protein is 63 kd. Western blot and indirect ELISA results revealed that the recombinant pp65 protein had significant immunoreactivity and immunogenicity as antigen, which provided abasis for further developing corresponding monoclonal an 鄄 tibody for antigen diagnostic and supplying raw materials for rapid HCMV IgG ELISA kit. Key words: HCMV pp65 protein; mass spectrometry; ELISA (enzyme linked immunosorbent assay); im 鄄 munoreactivity; immunogenicity (Life Science Research,2013,17(4):298 耀 304) 人巨细胞病毒 (Human cytomegalovirus, HCMV) 为一种核酸大小约 235 kb 的双链 DNA 病毒, 直径约 200 nm, 衣壳由 162 个壳粒组成, 外有包膜包被, 属疱疹病毒科茁疱疹病毒亚科, 也是疱疹病毒中最大的病毒.HCMV 的感染非常普遍, 在我国, 成年人群感染率可达 60% 耀 100% [1], 收稿日期 : 2013 鄄 03 鄄 25; 修回日期 : 2013 鄄 05 鄄 11 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 湖南省科技计划重点项目 (2011SK2014); 长沙市科技计划重点项目 (K 鄄 31); 湖南省自然科学基金重点资助项目 (12JJ2013); 湖南省高等学校科学研究青年项目 (10B060); 湖南省科技计划项目 (2013SK3129) 作者简介 : 许凤 (1987 鄄 ), 女, 湖南沅江人, 硕士研究生, 主要从事基因工程药物与抗体方面的研究工作 ; * 通讯作者 : 刘如石 (1971 鄄 ), 男, 湖南涟源人, 湖南师范大学生命科学学院与医学院教授, 博士, 主要从事疾病免疫诊断与基因工程药物研究,Tel: 0731 鄄 , E 鄄 mail: liurushi@hunnu.edu.cn.

2 第 4 期许凤等 : 人巨细胞病毒 pp65 蛋白的原核表达及活性鉴定 299 而在发达国家中, 人群感染率为也高达 40% 耀 60%, 通常在健康人群中呈潜伏性感染, 无明显临床症状, 但在免疫功能低下的个体, 如器官移植艾滋病恶性肿瘤等患者中,HCMV 可导致严重的感染. 有研究表明,HCMV 活动性感染是器官 [2,3] 移植失败和艾滋病死亡的主要原因. 同时,HCMV 是一种最常见的引发婴幼儿先天性感染的病毒, 据统计, 在欧美新生儿 HCMV 先天性感染率为 0.2% 耀 2.2% [4], 其中出生时伴有症状者占 10% 耀 15%, 无症状的但遗留后遗症的感染婴儿占 10% 耀 15%; 而我国, 胎儿先天性 HCMV 感染率达 3.5% [5], 其中病死率为 10% 耀 30%, 而存活患儿一般均伴有遗留症状如智力低下神经性耳聋等, 概率 [6] 高达 90% 以上. 因而, 建立早期快速诊断 HCMV 感染的方法则显得十分必要. 国外普遍采用 pp65 [7] 抗原血症检测法, 也是现在最可靠的方法, 而目前国内主要以检测血清中抗体为主,pp65 蛋白为 HCMV 表达的一种早期结构蛋白, 是表明 HCMV 活动性感染的一项早期指标, 早期抗原的临床检测可以将感染病毒的窗口期提前, 因而临床早期抗原诊断具有重要的意义. 拟通过重组表达高生物活性 HCMV pp65 蛋白, 为今后建立血清特异性抗体检测方法, 也为将来制备抗 HCMV pp65 单克隆抗体, 研发双抗体夹心法检测 HCMV 抗原做准备. 本研究利用人胚肺成纤维细胞 (HEL) 培养 HCMV AD169 病毒株, 收集病毒后提取 HCMV 全基因组 DNA, 利用 PCR 技术扩增 UL83 基因, 克隆至原核表达系统中进行表达, 结果显示,pp65 蛋白获得了有效的表达, 而且实验结果表明该蛋白具有良好的特异性与免疫反应性, 纯化的蛋白通过间接 ELISA 试验说明了该蛋白具有较高的灵敏度, 通过将纯化后的 pp65 重组蛋白免疫小鼠, 间接 ELISA 检测抗血清后, 结果也证明了该蛋白具有良好的免疫原性, 因而本研究制备的 pp65 重组蛋白达到了临床检测 HCMV 活动性感染的所需要求, 为今后建立血清中 pp65 特异性抗体提供了原料, 也为将来制备相应的单克隆抗体和建立双抗体夹心法检测抗原打下了一定的前期基础. 1 材料与方法 1.1 材料动物和细胞株 BALB/C 小鼠购自中南大学湘雅医学院 ; 大肠杆菌 E.coli Top10F ER 2566 菌株 HCMV AD169 病毒株人胚肺成纤维细胞 (HEL) 由本实验室保存主要试剂 pto 鄄 T 7 HRP 鄄羊抗鼠二抗由厦门大学夏宁邵教授惠赠 ; 抗 pp65 单克隆抗体购于美国 Abcam 公司 ;pmd18 鄄 T 载体 dntps Taq 酶 T 4 DNA 连接酶 BamH 玉和 Nde 玉限制性内切酶购自日本 TAKARA 公司 ;DNA 胶回收试剂盒与质粒提取试剂盒购自上海生工生物工程公司 ;QIAamp DNA Stool Kit 为德国 QIAGEN 公司产品 ; 蛋白质相对分子质量标准购自北京康润诚业生物科技有限公司 ;HRP 鄄 DAB 底物显色试剂盒购自天根生化科技有限公司 ; 胎牛血清为浙江天杭生物科技有限公司产品 ;1640 培养基和 DMEM 培养液购自美国 Life Technologies 公司 ; 弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂为美国 Sigma 公司产品. 1.2 方法人巨细胞病毒的分离与培养用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液对人胚肺成纤维细胞 (HEL) 进行传代, 培养于 10 mm 细胞培养皿, 待细胞长至皿底表面积 40%~50% 以后, 将 HCMV AD169 病毒株感染 HEL 细胞, 即将保存的病毒液滴加至生长了 HEL 的培养皿中, 感染量为每皿 1000 pfu, 置于 5% CO 2,37 益细胞培养箱中孵育 1h 后, 换用 2% 小牛血清的 DMEM 细胞培养液培养, 感染培养 5~7 d 后, 待细胞基本上发生病变后, 收集含有 HCMV 的细胞上清液 HCMV pp65 基因的克隆采用 QIAamp DNA Stool Mini Kit 提取 HCMV DNA. 利用 Oligo 6.0 软件, 根据 HCMV UL83 基因序列设计引物, 在上游引物引入 Nde 玉位点 (FP 5 忆鄄 CATATGATATCCGTACTGG GTCCC 鄄 3 忆 ), 下游引物引入 BamH 玉位点 (RP: 5 忆鄄 GGATC 鄄 CCAGATTCTGACCCTGAACCG 鄄 3 忆 ), 然后以 HCMV DNA 为模板扩增 pp65 蛋白编码序列, 反应体系为 :10 伊 PCR Buffer 10 滋 L dntps (10 mmol/l) 4 滋 L 上下游引物(10 滋 mol/l) 各 4 滋 L Taq DNA 聚合酶 (5 U/ 滋 L) 0.5 滋 L DNA 8 滋 L 去离子水补足至 100 滋 L. PCR 反应条件 :94 益 5min; 94 益 40 s, 63 益 40 s, 72 益 1min 30 s, 29 个循环 ;72 益 10 min. PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 胶回收 PCR 产物并连接到 pmd18 鄄 T 载体, 转化 E. coli Top10F` 感受态细胞, 提取重组质粒并送上海生工测序. 鉴定序列正确后, 酶切回收基因片段再

3 300 生命科学研究圆园 13 年连接至表达载体 pto 鄄 T 7 上, 通过卡那霉素筛选和 Hind 芋酶切鉴定重组克隆目的蛋白的诱导表达挑取筛选的菌株, 接种到 5mL LB 液体培养基中 ( 含有 100 mg/l 硫酸卡那霉素 (Kan + ))37 益培养至 OD 600 值达到 0.6, 加入终浓度为 0.4 mmol/l 的 IPTG 进行诱导表达, 同时以转化重组表达质粒的菌株不进行诱导作为阴性对照, 其它培养条件与实验组一致.37 益诱导培养 4h, 室温 g 离心 10 s 收集菌体. 制备蛋白样品, 用 10% 的 SDS 鄄 PAGE 分析重组蛋白的表达情况质谱法分析重组蛋白重组蛋白经 SDS 鄄 PAGE 电泳后, 从凝胶上将疑似表达蛋白切下来, 待考马斯亮蓝完全除掉后, 用胰蛋白酶酶解,25 mmol/l NH 4 HCO 3 (ph 8.0) 溶液洗净凝胶, 接着用纯丙烯腈 (ACN) 进行脱水处理, 再用高速真空干燥离心机进行干燥, 胶块经 10 mmol/l DTT 57 益处理 1h 后加入 55 mmol/l IAA 室温避光处理 45 min 使之烷基化. 接着依次用溶液 A(25 mmol/l NH 4 HCO 3 ) 溶液 B(25 mmol/l NH 4 HCO 3 鄄 50% 丙烯腈 ) 溶液 C( 纯丙烯腈 ) 洗涤凝胶块, 干燥处理, 再加入 30 滋 L 含有 0.2 滋 g 胰蛋白酶的 NH 4 HCO 3 溶液 37 益酶解 16 h, 然后酶解后的多肽片段释放到溶液中, 再真空冷冻干燥, 最后利用质谱仪对多肽样品进行分析目的蛋白活性鉴定将 pp65 的阳性菌株接种到 3mL Kn + LB 液体培养基中 37 益摇床培养至 OD 600 值约为 0.6 时, 加入终浓度为 0.4 mmol/l 的 IPTG 进行诱导表达, 同时以不加 IPTG 进行诱导表达的重组菌株作为阴性对照, 其它培养条件均一致, 然后 37 益诱导培养 4h, 室温 g 离心 30 s 收集菌体, 制备蛋白样品进行 10% 的 SDS 鄄 PAGE 电泳, 再电转移到 PVDF 膜上 (200 ma, 1h). 然后用含 5% 的脱脂奶的 TN 缓冲液 (50 mmol/l Tris HCl, 150 mmol/l NaCl, ph 7.5) 封闭 2h, 用 TNT 缓冲液 (50 mmol/l Tris HCl, 150 mmol/l NaCl, 0.05% Tween 鄄 20, ph 7.5) 洗膜 3 次, 每次 10 min, 再加入一抗 ( 按 1 颐 1000 的比例用脱脂奶稀释单抗 ), 室温反应 2h, 洗膜 3 次, 每次 10 min, 加入 HRP 酶标羊抗鼠二抗, 按 1 颐 3000 的比例用脱脂奶稀释, 室温反应 2h 后,TNT 洗膜 33 次, 每次 10 min, 最后用 HRP 鄄 DAB 底物显色试剂盒进行显色重组蛋白的纯化与鉴定将重组表达菌株接种到 50 ml LB (Kan + ) 培养基中培养 12 h, 然后以 1% 的比例接种至 2L Kn + LB 液体培养基中培养. 待菌液 OD 600 值达到 0.6 后加入至终浓度为 0.4 mmol/l 的 IPTG 进行诱导表达.4h 后, 室温, g 离心 8min 收集菌体. 加入 100 ml 裂解液 (50 mmol/l Tris HCl, 1 mmol/l EDTA, 100 mmol/l NaCl, ph 8.0), 囟 10 mm 探头 200 W 功率超声破碎细胞 g 离心 10 min, 分别收集上清和沉淀制成蛋白样品, 通过 SDS 鄄 PAGE 鉴定 pp65 蛋白的表达方式. 用 100 ml buffer 玉 (20 mmol/l Tris HCl 5 mmol/l EDTA 100 mmol/l NaCl) 和 2% TritonX 100 鄄 buffer 玉分别洗涤包涵体 2 次, 再用 50 ml buffer 玉配制的 2 4 8mol/L 尿素依次溶解包涵体. 取包涵体溶解度最大的组分进行 SDS 鄄 PAGE(13 cm 伊 18 cm 伊 1.5 mm), 先 90 V 电泳 40 min, 然后 120 V 电泳 12 h. 从胶块中切下目的蛋白条带, 置于透析袋后进行电洗脱. 电洗脱后将蛋白液装入透析袋中, 在 20 倍体积的 PBS 溶液中进行透析过夜. 收集透析后蛋白用 SDS 鄄 PAGE 鉴定纯度及及生物活性间接 ELISA 检测重组蛋白的抗原反应性将纯化后的 pp65 重组蛋白用 CB 稀释液 (15 mmol/l Na 2 CO 3 35 mmol/l NaHCO 3 ) 稀释至浓度梯度为 mg/l, 然后作为抗原包被 ELISA 用 96 孔板,4 益过夜. 洗板一次后, 加入 1 颐 1000 比例稀释的抗 pp65 单克隆抗体,37 益孵育 30 min 后, 洗板 5 次, 加入 HRP 鄄羊抗鼠二抗,37 益孵育 30min, 洗板 5 次, 最后加入 TMB 底物显色剂,37 益反应 10 min, 加入终止液终止反应, 最后利用酶标仪双波长 (450 nm/630 nm) 进行检测 pp65 重组蛋白的免疫原性检测将纯化后的 pp65 蛋白用 PBS 缓冲液稀释至终浓度为 0.5 g/l, 1 颐 1 加入弗氏完全佐剂充分乳化, 共 2mL. 取 3 只 BALB/C 小鼠做好标记, 采用皮下多点免疫的方法, 对 3 只小鼠分别以每只 100 滋 g 的剂量进行初次免疫 ; 两周后, 进行再次免疫时 1 颐 1 加入蛋白溶液和弗式不完全佐剂, 充分乳化后以同样剂量免疫小鼠, 一共 3 次加强免疫, 每次间隔 2 周. 在每次免疫的前一天收集小鼠血清进行间接 ELISA, 以检测 pp65 重组蛋白的免疫原性及血清抗体效价. 2 结果与分析 2.1 人巨细胞病毒培养人成纤维细胞 (HEL) 在感染病毒前细胞为细

4 第 4 期许凤等 : 人巨细胞病毒 pp65 蛋白的原核表达及活性鉴定 301 长的纤维状 ( 图 1A), 经 HCMV 感染 3d 后, 显微镜下观察细胞已发生明显病变, 细胞肿大核内出现包涵体 ( 图 1B), 而同步生长的未感染 HCMV 的对照组细胞则未出现这种情况, 细胞形态仍为纤维放射状, 可相互平行排列似栅栏状 ( 图 1C), 且细胞密度比感染了病毒的 HEL 细胞高, 可见, HCMV 影响了 HEL 的生长速度, 因此, 待这种形态特征出现时即可收集病毒. (A) (B) (C) 图 1 病毒感染前后人胚肺成纤维细胞生长状况 (100 伊 ) (A) HEL 细胞在 HCMV 感染前生长状况图 ;(B) HEL 在 HCMV 感染 3d 后细胞生长状况图 ;(C) HEL 细胞未感染 HCMV 生长 3d 后状况图. Fig.1 The growth of HEL cell before and after HCMV infection (100 伊 ) (A) The growth of HEL cell before infected with HCMV; (B) The growth of HEL cell after infected with HCMV; (C) The growth of HEL cell without HCMV. 2.2 原核表达载体构建与鉴定提取 HCMV DNA 之后, 用 PCR 扩增 pp65 蛋可见两条条带, 与预期结果一致 ( 图 2B Lane 2), 经过上海生工公司测序, 证明为 pp65 编码序列. 白编码序列, 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定后, 可于 1500 bp 位置处发现唯一一条清晰的大小约为 1500 bp 的 DNA 条带 ( 图 2A Lane 2), 相对分子质量大小与 pp65 基因大小相符, 因此可初步确定为目的条带. 通过连接至 pmd18 鄄 T 载体上后构成重组载体 pmd18 鄄 T 鄄 pp65, 经 Hind 芋鉴定后然后用 Nde 玉和 BamH 玉酶切并回收 pp65 基因片段, 亚克隆到 pto 鄄 T 7 表达质粒中, 重组质粒 pto 鄄 T 7 鄄 pp65 经 Hind 芋酶切和电泳检测后, 结果在 250 ~500 bp 和大于 5000 bp 位置处观察到两条 DNA 条带 ( 图 2C Lane 2), 说明 pp65 基因已经成功克隆到表达载体上. bp M 1 2 bp M 1 2 bp M (A) (B) (C) 图 2 重组质粒 pto 鄄 T 7 鄄 pp65 的构建过程与酶切鉴定 (A) HCMV pp65 基因 PCR 扩增电泳图谱.M: DNA 相对分子质量标准 ;1: 阴性对照 ;2: HCMV pp65 基因. (B) 亚克隆质粒 pmd18 鄄 T 鄄 pp65 酶切鉴定电泳图谱.M: DNA 相对分子质量标准 ;1: 重组质粒 pmd18 鄄 T 鄄 pp65; 2: 重组质粒 pmd18 鄄 T 鄄 pp65 经 Hind 芋酶切后. (C) 重组表达质粒 pto 鄄 T 7 鄄 pp65 酶切鉴定电泳图谱.M: DNA 相对分子质量标准 ;1: 重组质粒 pto 鄄 T7 鄄 pp65; 2: 重组质粒 pto 鄄 T 7 鄄 pp65 经 Hind 芋酶切后. Fig.2 The construction and identification of recombinant plasmid pto 鄄 T 7 鄄 pp65 (A) PCRproductofHCMV pp65genefragment. M: DNAmarkerDL5000; 1: Thenegativecontrol; 2: HCMV pp65gene. (B) Restriction map of recombinant plasmid pmd18 鄄 T 鄄 pp65 identified by enzyme digestion. M: DNA marker DL5000; 1: recombi 鄄 nant plasmid pmd18 鄄 T 鄄 pp65; 2: recombinant plasmid pmd18 鄄 T 鄄 pp65 digested by Hind 芋 ; (C) Restriction map of recombinant plasmid pto 鄄 T 7 鄄 pp65. M: DNA marker D2000 plus; 1: recombinant plasmid pto 鄄 T 7 鄄 pp65; 2: recombinant plasmid pto 鄄 T 7 鄄 pp65 digested by Hind 芋.

5 302 生命科学研究圆园 13 年 2.3 重组蛋白的诱导表达将诱导好的重组菌株和对照组菌株制备成蛋白样品进行 SDS 鄄 PAGE, 结果经 IPTG 诱导的重组菌株的试验组和不经 IPTG 诱导的对照组有差异, 诱导后的菌株表达了一个大小约 65 kd 的蛋白 ( 图 3Lane 2 耀 4), 而在对照组中没有出现这一条带 ( 图 3Lane 1), 初步说明重组基因在大肠杆菌中获得了有效表达. kd M 图 3 SDS 鄄 PAGE 鉴定重组蛋白 M: 蛋白质相对分子质量标准 ;1: 不加 IPTG 诱导的重组菌株表达的总蛋白 ;2 耀 4: 重组菌株经 IPTG 诱导后表达的总蛋白. Fig.3 IdentificationofrecombinantproteinbySDS 鄄 PAGE M: protein marker; 1: total protein expression profile of E. coli without IPTG induction; 2 耀 4: total protein expression of E. coli with IPTG. induction. 2.4 质谱法检测重组蛋白性质重组蛋白经过质谱仪分析后, 将得到的数据输入数据库进行匹配分析, 结果显示检测蛋白与数据库中 HCMV AD169 pp65 蛋白相符, 由 UL83 基因编码. 软件分析结果显示,Protein score 超过 2000 ( 图 4), 说明匹配度很高, 结果可靠 ; 数据显示, 蛋白质酶解后鉴定到了匹配的肽段数为 68 条, 其中可靠的为 51 条, 同时, 蛋白质覆盖率为 44%( 表 1), 表明质谱分析结果可信度较高 ; 质谱结果显示 pp65 重组蛋白的相对分子质量为 D, 与天然 pp65 蛋白的相对分子质量大小符合, 这也进一步提高了 pp65 重组蛋白的可信度 ( 表 1) Protein score 2400 图 4 质谱鉴定 Mascot 得分直方图 Fig.4 Analysis of recombinant protein by mass spec 鄄 trometry Table 1 表 1 质谱分析重组表达 pp65 蛋白性质与可信度 The confidence and characteristic of recombinant protein pp65 by mass spectroscopy Protein name HCMV pp65 M.W pi 6.78 Mascot Score 2115 注 :M. W: 相对分子质量 ;pi: 等电点. Notes: M. W: molecular weight; pi: isoelectric point. Number of matching peptide 68(51) Number of matching peptide 68(51) Protein sequence coverage/(%) 重组蛋白的免疫反应性性鉴定 Western blot 结果显示, 表达的重组蛋白与抗 pp65 单克隆抗体发生了反应, 在大小约为 65 kd 处有一条特异性的条带 ( 图 5B Lane 2 耀 4), 而阴性对照则没有此条带的出现 ( 图 5B Lane 1), 进一步说明了重组蛋白为 pp65 蛋白, 而且具有良好的免疫反应活性. 2.6 重组蛋白表达方式鉴定及纯化将细胞进行超声波破碎后, 取少量悬液离心, 分别收集上清和沉淀制成蛋白样品. 通过 SDS 鄄 PAGE 检测后, 结果显示目的蛋白主要分布在沉淀中 ( 图 6A Lane 4), 同时 Western blot 鉴定结果显示, 沉淀中有与抗 pp65 单克隆抗体特异性结合的条带 ( 图 6B Lane 4), 说明 pp65 蛋白是以包涵体的形式进行表达. 电洗脱后的 pp65 的纯度很高, 从丙烯酰胺凝胶上看不到其他杂带 ( 图 7A Lane 3), 而 Western blot 结果显示纯化后的 pp65 蛋白仍保持着较好的免疫反应源性 ( 图 7B Lane 3), 而通过透析后绝大部分 pp65 蛋白能够很好地溶于 PBS 缓冲液中 ( 图 7B Lane 4). 2.7 间接 ELISA 检测重组蛋白反应灵敏度以低浓度的 pp65 重组蛋白 (0.5 mg/l) 作为抗原包被 ELISA 板后, 加入抗 pp65 单克隆抗体进行 ELISA 检测后, 结果显示, 在包被浓度为 0.5 mg/l 时便产生了阳性值 ( 一般以阴性值的 2.1 倍设为临界值 ), 低浓度包被 pp65 可与抗体发生免

6 第 4 期许凤等 : 人巨细胞病毒 pp65 蛋白的原核表达及活性鉴定 303 kd M M kd M M (A) 图 5 重组蛋白 pp65 在大肠杆菌中的表达鉴定 (A) SDS 鄄 PAGE 鉴定结果图谱 ; (B) Western blot 鉴定结果图.M: 蛋白质相对分子质量标准 ;1: 不加 IPTG 诱导的重组菌株表达的总蛋白 ;2 耀 4: 重组菌株经 IPTG 诱导后表达的总蛋白. Fig.5 Identification of recombinant protein pp65 ex 鄄 pressed in E. coli (A) The result of SDS 鄄 PAGE; (B) The result of Western blot. M: proteinmarker; 1: Totalproteinexpressionprofileof E. coli without IPTG induction; 2 耀 4: Total protein expression profileof E. coli withiptg induction. kd (B) M M (A) 图 6 重组蛋白 pp65 在大肠杆菌中的表达方式鉴定 (A) SDS 鄄 PAGE 鉴定结果 ;(B) Western blot 鉴定结果.M: 蛋白质相对分子质量标准 ;1: 阴性对照 ;2: 细胞破碎后悬液 ; 3: 细胞破碎离心后上清总蛋白 ;4: 细胞破碎离心后沉淀总蛋白. Fig.6 Identification of recombinant protein pp65 ex 鄄 pressive form in E. coli (A) The result of SDS 鄄 PAGE; (B) The result of Western blot. M: protein marker; 1: The negative control; 2: The total pro 鄄 tein expression profile of E. coli; 3: The total proteins in su 鄄 pernatant; 4: The total proteins of precipitate. (B) (A) (B) 图 7 pp65 蛋白纯化后鉴定 (A) SDS 鄄 PAGE 鉴定结果 ;(B) Western blot 鉴定结果.M: 蛋白质相对分子质量标准 ;1: 阴性对照 ;2: 纯化前的重组蛋白 ;3: 电洗脱纯化后的重组蛋白 ;4: 透析后的重组蛋白. Fig.7 Identification of protein pp65 after purified (A) The result of SDS 鄄 PAGE; (B) The result of Western blot. M: Protein Marker; 1: The negative control; 2: Recombinant protein before purified; 3: Recombinant protein after elec 鄄 troelution; 4: Recombinan protein after dialysis. 疫反应, 表明该重组蛋白具有极高的反应灵敏度 ( 表 2), 说明该重组菌株表达的重组抗原具有作为抗体检测的潜力, 同时可以用来制备抗 HCMV 抗原单克隆抗体, 因此该重组菌株具有较好的应用前景. 2.8 间接 ELISA 检测重组蛋白免疫原性以小鼠免疫前血清为阴性对照, 通过间接 ELISA 试验检测血清中抗体效价, 一般以 2.1 倍阴性值设定为临界值来判定是否为阳性值, 小鼠在初次免疫后体内 IgG 抗体水平很低, 在第一次加强免疫后血清即转阳 ( 表 3), 说明了 pp65 重组蛋白作为抗原具有良好的免疫原性, 能在小鼠体内引起较强的免疫反应, 且在第 4 次免疫之后, 百万倍稀释后血清中 IgG 效价已高达 1.0 以上 ( 图 8), 此时已达到制备单克隆抗体的要求. 表 2 间接 ELISA 检测 pp65 重组蛋白免疫反应性 Table 2The immunoreactivity of recombinant protein pp65 detected by indirect ELISA Antigen concen tration/( 滋 g ml -1 ) Numbers of mice Table Absorption value of repeat hole (OD) 表 3 间接 ELISA 检测小鼠血清中抗体效价 The antibody titers of serum in mice detected by indirected ELISA Before immunization After one immunization Absorption value (OD) After two immunizations After three immunizations After four immunizations

7 304 生命科学研究圆园 13 年 3 讨论 HCMV pp65 蛋白是 HCMV 早期产生的一种结构蛋白, 在激活状态的 HCMV 感染时,pp65 蛋白于 6 耀 24 h 内表达于外周血淋巴细胞单核细胞多形核白细胞和血管内皮细胞, 是 HCMV 活动性感染的一项早期指标. 目前国内诊断常使用 HCMV 全病毒为抗原, 由于成分复杂且本身存在与单纯疱疹病毒的交叉抗原, 使之特异性低, 而以 pp65 蛋白代替全病毒作为抗原则能很好地弥补这一缺陷, 通过 pp65 抗原血症检测病毒活动与否, 是目前被广泛接受的相对金标准 [8]. 据文献报道,pp65 蛋白包含激发 CTL Th 免疫和绝大部分 B 细胞识别的抗原表位, 这些表位大部分均 [9, 10] 位于 pp65 蛋白的第 360 耀 503 位氨基酸. 利用基因工程技术进行重组蛋白的表达应用 [11] 最多的为大肠杆菌表达系统, 主要是因为人们对其遗传背景分子生物学特点等方面已有了较深的认识, 许多目的基因在大肠杆菌中都能迅速有效地表达目的蛋白, 加之其培养条件简单易于控制, 因而该表达系统已被广泛应用. 国内有研 [12] 究人员曾利用毕赤酵母进行 pp65 的重组表达, 但是表达量都不高, 且培养周期比较长, 本实验通过构建 pto 鄄 T 7 鄄 pp65 这一重组质粒, 利用大肠杆菌进行表达, 结果显示此种表达方式周期比较短, 诱导 4h 即可获得高效表达.pp65 重组蛋白以包涵体的形式大量表达于沉淀, 电泳显示, 在包涵体洗涤之后已除掉了一部分杂蛋白, 重组 pp65 蛋白已得到了初步纯化, 本研究采用电洗脱的方式进行再次纯化,SDS 鄄 PAGE 电泳结果表明电洗脱纯化效果比较好. 本研究利用 PCR 技术扩增了 HCMV UL83 第 31~1524 位核苷酸序列, 构建了人巨细胞病毒 (HCMV) pp65 基因片段的表达质粒, 利用 E. coli 原核表达了 pp65 重组蛋白, 既剔除了 5 忆 GC 含量极高的核苷酸序列, 降低了 PCR 扩增的难度, 同时又除去了 pp65 蛋白 C 端的激酶位点和核定位信号, 因此制备的重组蛋白包含了 pp65 蛋白中几乎所有的抗原表位, 具有较强的抗原性.West 原 ern blot 和间接 ELISA 实验结果证明了我们重组表达的 pp65 蛋白具有良好的免疫反应活性. 国 [13 耀 15] 内外曾有研究者做过相关研究, 利用大肠杆菌表达系统制备了截短的 pp65 重组蛋白, 经过鉴定, 虽具备较好的抗原性, 但都只包含了 pp65 蛋白的部分抗原表位, 本研究制备的 pp65 重组蛋白囊括了几乎所有的抗原表位, 经鉴定, 此重组蛋白具备良好的免疫反应性与免疫原性, 为制备 HCMV 特异性单克隆抗体提供了关键性的原料, 相对于只包括优势抗原表位的重组蛋白来说, 本研究制备的 pp65 重组蛋白由于包含了 HCMV 鄄 pp65 中几乎全部的抗原表位, 能刺激 B 细胞分泌多种不同的抗体, 所获得的抗体库相对其它研究者的要丰富得多, 它们分别对应于不同的抗原表位, 这对于后期筛选特异性好亲和力大和灵敏度高的单克隆抗体提供了基础. 本研究制备的 pp65 重组蛋白可作为今后研发特异性的 HCMV 抗体检测试剂, 为制备双抗体夹心法检测 HCMV pp65 抗原的抗 pp65 单克隆抗体提供了重要的原料, 也为今后制备 HCMV 亚单位疫苗的优选材料, 对 HCMV 疫苗的研究亦具有重要的意义. 参考文献 (References): [1] 阮光萍, 王小宁. 巨细胞病毒疾病的研究进展 [J]. 国际检验医学杂志 (RUAN Guang 鄄 ping, WANG Xiao 鄄 ning. Study of CMV disease[j]. International Journal of Laboratory Medicine), 2006, 27(1): 81 鄄 83. [2] 赵杨, 陈敦金, 闻良珍. 人巨细胞病毒基因时序表达对感染结局的影响 [J]. 中华微生物学和免疫学杂志 (ZHAOYang,CHEN Dun 鄄 jin, WEN Liang 鄄 zhen. The experimental study in the ef 鄄 fectsofviralmaingenesactivityonhcmvinfectionoutcomes[j]. Chinese Journal of Microbiology and Immunology), 2004, 24 (10): 834 鄄 838. [3] DOESCH AO, REPP J, HOFMANN N, et al. Effects of oral valganciclovir prophylaxis for cytomegalovirus infection in heart transplant patients[j]. Drug design, Development and Ther 鄄 apy, 2012, 6: 289 鄄 295. [4] LIU T, ZHENG X, CHEN J, et al. Effect of human cyto 鄄 megalovirus on invasive capability of early pregnant extravil 鄄 lous cytotrophoblasts[j]. Journal of Huazhong University of Sci 鄄 ence and Technology. Medical Sciences, 2011, 31(6): 819 鄄 823. [5] 闫淑媛, 陈平洋. 人巨细胞病毒感染的实验室诊断研究进展 [J]. 国外医学儿科学分册 (YAN Shu 鄄 yuan, CHEN Ping 鄄 yang. The development of laboratory diagnosis of human cytomegalovirus infection in neonates[j]. Foreign Medical Sciences Section of Pe 鄄 diatric), 2005, 32(5): 284 鄄 287. [6] XU Y, YU J, ZHANG R, et al. The perinatal infection of cy 鄄 tomegalovirus is an important etiology for biliary atresia in China[J]. Clinical Pediatrics (Phila), 2012, 51(2): 109 鄄 113. [7] RHA B, REDDEN D, BENFIELD M, et al. Correlation and clinical utility of pp65 antigenemia and quantitative poly 鄄 merase chain reaction assays for detection of cytomegalovirus in pediatric renal transplant patients[j]. Pediatric Transplanta 鄄 tion, 2012, 16(6): 627 鄄 637. [8] MOSES S, MALATHI J, SINGHA NR, et al. Determination of human cytomegalovirus pp65 antigenemia among renal trans 鄄 plant patients[j]. The Indian Journal of Nephrology, 2012, 22(5): 347 鄄 352. ( 下转第 309 页 )

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材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽