人类疱疹病毒6、7型体外感染淋巴细胞对四种细胞因子分泌的影响

Size: px

Start display at page:

Download "人类疱疹病毒6、7型体外感染淋巴细胞对四种细胞因子分泌的影响"

钲壑郗
7 years ago
Views:

1 人类疱疹病毒 6 7 型体外感染淋巴细胞对四种细胞因子分泌的影响摘要目的研究人类疱疹病毒 6 7 型 (human herpesvirus 6 and 7, HHV-6 HHV-7) 体外感染对免疫功能的影响方法采用生物活性法或 ELISA 法分别检测了 HHV-7 Glasgow YY5 2 株病毒及 HHV-6 GS 株感染脐血单个核细胞 (CBMCs), 培养上清中细胞因子 TNF-α IFN-γ IL-10 IL-12 P70 水平的动态变化结果 3 株病毒感染 CBMCs 后前 2 天均轻度抑制 IFN-γ 产生, 然后此抑制作用逐渐消失 ;3 株病毒均能平稳诱导 IL-12 P70 产生, 但 GS 组诱生水平低于 Glasgow 及 YY5 组 ;3 株病毒在接种后早期都能诱生 IL-10,GS 诱生 IL-10 水平高于 Glasgow YY5 株 ;3 株病毒均能较强地诱导 CBMCs 产生 TNF-α, 但到达峰值时间 Glasgow YY5 迟于 GS 株结论 HHV-6 HHV-7 感染早期都可以通过影响细胞因子的分泌影响免疫功能, 但 HHV-6 影响程度强于 HHV-7 Effects on production of TNF-α, IFN-γ, IL-10 and IL-12 in lymphocytes infected by human herpesvirus 6 and 7 in vitro PENG Guangyong, YAO Kun, REN Qiang, et al. (Department of Microbiology and Immunology, Nanjing Medical University, Nanjing , P. R. China) Abstract Objective To study the effects on lymphocytes immune function as infected by human herpesvirus 6 and 7 (HHV-6, HHV-7) in vitro.methods Production of TNF-α, IFN-γ, IL-10 and IL-12 P70 induced by HHV-6 GS strain and HHV-7 Glasgow, YY5 strains in the supernatants of cord blood mononuclear cells (CBMCs) were evaluated by biological activity assay and ELISA.Results (1) The secretions of IFN-γ were slightly inhibited in CBMCs supernatants with HHV-7 Glasgow, YY5 and HHV-6 GS strains during 2 days after infection, then the inhibited effects disappeared. (2) Glasgow, YY5 and GS strains could strongly induce IL-10 secretion in cultural supernatants at early phase of infection, the amount of IL-10 induced by GS was higher than that of Glasgow and YY5 strains. (3) Glasgow, YY5 and GS strains could all induce IL-12 P70, but the production of IL-12 P70 induced by GS was lower than that by Glasgow and YY5 strains. (4) Glasgow, YY5 and GS strains could all strongly induce TNF-α secretion, but HHV-7 infected cultures reached the maximal level at day 3 and day 4 of infection, later than that of HHV-6 GS (at day 2 of infection).conclusion These in vitro findings demonstrate that HHV-6 and HHV-7 could all perturb immune function by inducing the cytokines secretion at early phase of infection, but the effects of HHV-6 were much stronger than that of HHV-7.

2 Subject words Human herpesvirus 6; Human herpesvirus 7; Cytokines; Lymphocytes 人类疱疹病毒 6 型 (human herpesvirus 6, HHV-6) 是 1986 年由 Salahudd 等首次从淋巴细胞增生及 AIDS 病人的外周血单个核细胞 (PBMCs) 中分离,HHV-7 是 1990 年由 Frenkel 等首次从健康人 PBMCs 中分离, 两者同属于人类 β- 疱疹病毒, 都能感染淋巴细胞, 以潜伏状态存在于人体中近来研究表明, 细胞因子网络的失衡所导致细胞免疫功能障碍, 是胞内病原体长期感染的主要原因 1 HHV-6 HHV-7 在体内长期潜伏感染是否与细胞因子网络平衡失调有关? 我们研究了 HHV-6 标准株 GS,HHV-7 标准株 Glasgow 及我室最近分离的 YY5 株体外感染脐血单个核细胞 (CBMCs) 对 TNF-α IFN-γ IL-10 IL-12 P70 诱生的影响, 并对其在病毒感染早期的作用作了初步探讨材料与方法病毒株 :HHV-6 GS 标准株,HHV-7 Glasgow 标准株, 前者在 HSB2 细胞上后者在 SUPT1 细胞上传代培养, 由香港大学微生物学系惠赠 YY5 株为我室从一肾病患儿唾液中分离的 HHV-7 中国南京株 2, 在 CBMCs 中传代培养细胞 :(1) 人脐血单个核细胞 (CBMCs), 南京妇幼表 1 病毒感染后不同时间培养上清中 IFN-γ 含量 Table 1. The production of IFN-γ in infected culture supernatants at different days post infection (each group n=12, ±s, pg/ml) Groups GS+CBMCs 128.3±1.9 * 132.5±5.6 * 136.4± ± 8.1 * 120.4±5.1 Glasgow+CBMCs 136.5± ± ± ± ±5.7 YY5+CBMCs 139.7± ± ± ± ±7.5 CBMCs 149.3± ± ± ± ±7.8 *P<0.05 vs group CBMCs 表 2 病毒感染后不同时间培养上清中 IL-12 P70 含量 Table 2. The production of IL-12 P70 in infected culture supernatants at different days post infection(each group n=12, ±s, pg/ml)

3 Groups GS+CBMCs 64.3± 7.6 # 69.3± ± ± ±14.3 # Glasgow+CBMCs 94.2± 2.9 * 89.2± 5.9 * 87.6± 4.7 # 85.9± 5.0 * 74.2±10.4 * YY5+CBMCs 89.2±14.3 * 84.2± 5.8 * 81.7± ± ± 8.6 * CBMCs 39.4± ± ± ± ± 7.6 *P<0.01, #P<0.05 vs group CBMCs; P<0.05 vs group GS+CBMCs 保健院提供肝素抗凝脐血,Ficoll 分离, 在淋巴细胞生长液中培养培养条件 :20% 新生牛血清的 RPMI 1640, 含 PHA 40μg/ml,IL-2 10U/ml, 谷氨酰胺 2mmol/L, 青链霉素各 100U/ml (2)SUPT1 HSB2 细胞系, 来自香港大学微生物学系 ;L929 细胞由南京军区军事医学研究所提供, 用含 10% 新生牛血清的 RPMI 1640 传代培养试剂 :(1)TNF 标准品, 为重组人 TNF-α,Sigma 公司产品 TNF-α 单克隆抗体, 第四军医大学金伯泉教授惠赠放射菌素 D,Sigma 公司产品 (2)IFN-γ ELISA 检测试剂盒, Sigma 公司产品 ;IL-10 IL-12 P70 ELISA 检测试剂盒,Genzyme 公司产品细胞因子检测标本的处理 : 用淋巴细胞生长液调分离的 CBMCs 为细胞 /ml, 加于 24 孔培养板中, 每孔 1ml, 分别接种 GS Glasgow YY5 病毒株 100 TCID 50/ml, 并以同一批未接种病毒的 CBMCs 作为未感染细胞对照, 共用 3 批不同 CBMCs, 每批 4 个平行样本, 共 12 个样本感染病毒, 于 5% CO 2,37 培养收集感染后的 h 培养上清液,-70 冻存待测 TNF-α 的检测 TNF 生物活性法检测 : 参考文献 3, 用 TNF 敏感细胞株 L929 微量细胞毒试验进行检测 TNF 活性单位, 即 50% 细胞存活时的最高稀释孔吸光度 (A) 值在标准曲线上的对应数值, 再乘以稀释倍数 TNF-α 中和试验 : 取感染上清液与 TNF-α 单抗按 50 1 混合,37 1 h, 再用上法检测 TNF 活性 IL-10 IL-12 P70 IFN-γ ELISA 检测 : 取上述冻存上清液按试剂盒说明书要求检测最小检测浓度,IL-12 P70 为 20pg/ml,IL-10 为 15pg/ml,IFN-γ 为 5pg/ml 统计分析 : 结果为 12 个样本平均值, 用 ±s 表示采用 Sigmastat 统计软件, 用单因素方差分析 F 检验, 组间差异的显著性用 q 检验 P<0.05 有统计学意义

4 结果 1.HHV-6 GS HHV-7 Glasgow YY5 株体外感染 CBMCs 产生 IFN-γ 动力学特征 : 由表 1 可见 GS Glasgow 及 YY5 株感染 CBMCs 后 h 和对照组相比均轻度抑制 IFN-γ 产生,72 96 h 各病毒组的 IFN-γ 诱生水平接近于正常对照组, 到感染第 5 天各组产生 IFN-γ 量均显著下降, 其中正常对照组的下降幅度最明显但除感染 h 上清中,GS 组与对照组差异有显著性外, 其余各组间差异均无统计学意义 2.HHV-6 GS HHV-7 Glasgow YY5 株体外感染 CBMCs 产生 IL-12 P70 动力学特征 : 由表 2 可见,HHV-6 GS HHV-7 Glasgow YY5 感染 CBMCs 后均能诱导 IL-12 P70 的产生, 且随时间的推移,IL-12 P70 量的变化较平缓感染 5 d 中,3 株病毒产生 IL-12 P70 量都高于 CBMCs 对照组 ; 而 GS 株产生 IL-12 表 3 病毒感染后不同时间培养上清中 IL-10 含量 Table 3. The production of IL-10 in infected culture supernatants at different days post infection( each group n=12, ±s, pg/ml) Groups GS+CBMCs 202.7±24.1 * 189.2± ± 9.1 * 79.5± 3.4 # 50.7± 9.6 # Glasgow+CBMCs 139.7± ± ±17.4 # 94.5± 8.0 # 45.1± 6.8 # YY5+CBMCs 129.7± ± ±14.3 * 77.8±15.3 # 56.3±10.2 * CBMCs 110.1± ± ± ± ± 5.7 *P<0.01, #P<0.05 vs group CBMCs; P<0.05 vs group GS+CBMCs 表 4 病毒感染后不同时间培养上清中 TNF-α 含量 Table 4. The production of TNF-α in infected culture supernatants at different days post infection(each group n=12, ±s, U/ml) Groups GS+CBMCs 178.1±50.3 * ±150.2 * 354.2± 83.1 # 160.6± 43.0 # 119.8± 23.0 Glasgow+CBMCs 45.3±19.9 # 333.3± 30.2 * 666.7± 86.7 * 324.4± 42.8 # 238.8± 39.0 # YY5+CBMCs 58.2±23.9 # 259.9± 58.0 # 784.1±126.3 * ±109.9 # 684.8±128.0 # CBMCs 12.5± ± ± ± ± 26.4

5 *P<0.01, #P<0.05 vs group CBMCs; P<0.05, P<0.01 vs group GS+CBMCsP70 的量始终低于 HHV-7 Glasgow YY5 组 3.HHV-6 GS HHV-7 Glasgow YY5 株体外感染 CBMCs 产生 IL-10 动力学特征 : 由表 3 可见,HHV-6 HHV-7 均诱导 CBMCs 产生 IL-10 病毒接种后 24 h,gs 株诱导 IL-10 产生量明显多于 YY5 及 CBMCs 对照组 ; 在接种后 3~5 d, 各病毒组产生 IL-10 量均显著高于 CBMCs 对照组, 但各病毒组间十分相近 4.HHV-6 GS 株 HHV-7 Glasgow YY5 株诱导 CBMCs 产生 TNF-α 动力学特征 : 由表 4 可见, 在病毒感染 CBMCs 24 h 后,HHV-6 GS 株即能明显诱导 TNF 产生,48 h 左右达高峰, 以后逐渐下降 ; 在接种后 1~4 d,tnf 的活性均明显高于正常对照组而 HHV-7 YY5 及 Glasgow 株产生 TNF 的峰值间迟于 GS 株,Glasgow 在第 3 天出现峰值,YY5 在第 4 天才出现峰值 ; 且接种后 1~5 d,tnf 活性也明显高于正常对照组中和试验表明, 抗人 TNF-α 的单抗能显著中和 L929 细胞微量细胞毒试验所测的 TNF 活性讨论 HHV-6 7 是近年发现的人类 β- 疱疹病毒, 我室已先后在中国南京分离鉴定了 HHV-6 和 HHV-7 的地方株 CN 和 YY 2, 4 本文结果证实,GS Glasgow YY5 株感染 CBMCs 早期均轻度抑制 IFN-γ 分泌 ;3 株病毒都能诱生有生物活性的 IL-12 P70, 都能诱生 IL-10 及 TNF-α, 但各病毒株诱生细胞因子特点各不相同在抗病原微生物感染中,IFN-γ 属于 T H1 类细胞因子, 主要由活化的 CD4 + (T H1),CD8 + T 细胞及 NK 细胞产生, 是单核巨噬细胞激活因子, 通过加强单核细胞各种功能, 在病毒感染过程中, 介导细胞免疫, 发挥重要抗病毒作用 5 IL-10 属于 T H2 类细胞因子, 在小鼠主要由 T H2 细胞产生, 在人主要由 B 细胞和巨噬细胞产生, 是重要的负调节因子, 能抑制 TH1 类细胞因子的分泌, 下调 T 细胞和单核巨噬细胞功能, 抑制细胞免疫 6, 7 我们观察 GS Glasgow YY5 3 株病毒感染的 CBMCs, 发现两类病毒感染早期都轻度抑制 IFN-γ 分泌, 诱生 IL-10, 从而削弱了 TH1 类反应, 优势激活了 TH2 类反应这一结果提示,HHV-6 HHV-7 在体内感染是否也有同样的效应, 使病毒难以被清除, 而导致长期潜伏感染细胞免疫功能降低及其所分泌的细胞因子失调 IL-12 是诱导 T H1 类细胞分化的重要因子,TNF-α 是一个重要的炎症因子, 在病毒感染急性期, 通过各种机制发挥重要的抗病毒作用 3, 8, 9 本实验研究发现,GS Glasgow YY5 株感染 CBMCs 早期都能诱生有生物活性的 IL-12 P70 及 TNF-α, 可能与病毒感染早期激活单核巨噬系统密切相关另外,IL-10 能明显地抑制 IL-12 IFN-γ 分泌,IL-12 也能刺激 IFN-γ 分泌 6,9, 我们研究发现,HHV-6 GS 对 IFN-γ 诱生的抑制作用较明显, 且发生较早, 这与 GS 和 HHV-7 Glasgow YY5 诱生 IL-10 IL-12 的特点不同有关 GS 诱生 IL-10 的能力在

6 感染后 24 h 显著高于 Glasgow 和 YY5, 而诱生 IL-12 的能力则基本上低于 Glasgow 和 YY5, 因而出现 GS 对 IFN-γ 诱生的抑制作用较明显, 尤其是在感染早期同时,GS 感染产生炎症因子 TNF-α 也显著早于 HHV-7 两毒株, 显示 HHV-6 GS 株感染时造成细胞因子网络失调更为显著提示 HHV-6 导致免疫功能紊乱的可能性明显高于 HHV-7, 与临床观察到的 HHV-6 的致病性较强与某些疾病的相关性高于 HHV-7 的现象是一致的

600 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 were significantly decreased, but the levels of IL-12 in two groups were significantly increa

600 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 were significantly decreased, but the levels of IL-12 in two groups were significantly increa 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 599 喘可治注射液联合细辛脑注射液治疗小儿毛细支气管炎的临床研究唐辉英, 佘定平, 马颐娇深圳市儿童医院呼吸科, 广东深圳 518026 摘要 : 目的探讨喘可治注射液联合