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基妗邹
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1 ,51(1):52~56/ 郭礼强, 等 HPLC-MS/MS 法测定饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量郭礼强 1, 张金玲 1, 李凯 1, 丁葵英 1 2, 吴翠玲 (1. 潍坊出入境检验检疫局, 山东潍坊 ;2. 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 北京 ) [ 收稿日期 ] [ 文献标识码 ]A [ 文章编号 ] (2017) [ 中图分类号 ]S [ 摘要 ] 建立了高效液相色谱 - 串联质谱法 (HPLC-MS/MS) 快速测定饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑的含量饲料样品用乙酸乙酯提取后, 经 PCX 固相萃取柱净化处理, 过 0.22μm 滤膜, 以乙腈和含 0.1% 的甲酸水溶液为流动相, 经 EclipsePlusC18 色谱柱 (3.0mm 100mm,1.8μm) 分离, 多级反应监测 (MRM) 正离子模式下扫描分析结果表明, 甲硝唑和二甲硝咪唑在 0.2~50μg/L 范围呈良好线性, 线性相关系数均大于 0.997, 检出限均为 0.2μg/kg, 定量下限均为 0.5μg/kg 样品在定量下限 1 倍 2 倍 10 倍 3 个加标水平下的平均回收率为 95.3% ~103.2%, 相对标准偏差 (RSD) 为 4.67% ~8.46% 该方法灵敏简便准确, 可用于饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑的检测分析 [ 关键词 ] 饲料 ; 含量分析 ; 甲硝唑 ; 二甲硝咪唑 ; 液相色谱 - 串联质谱 DeterminationofMetronidazoleandDimetridazoleinFeedbyHigh PerformanceLiquidChromatography-tandem MasSpectrometry GUOLi-qiang 1,ZHANGJing-lin 1,LIKai 1,DINGKui-ying 1,WUCui-ling 2 (1.WeifangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Weifang,Shandong261041,China; 2.AgilenttechnologiesCo.,LtdinChina,Beijing100102,China) Abstract:Amethodforthedeterminationofmetronidazoleanddimetridazoleinfeedbyhighperformanceliquid chromatography-tandemmasspectrometry(hplc-ms/ms)ispresented.thesamplewerepurifiedwithsolid phaseextractioncolumnofpcxafterextractionbyethylacetate.afterfilteredwitha0.22μm membrane,the samplewasseparatedonaeclipseplusc18column(3.0mm 100mm,1.8μm)usinggradientelutionwith mobilephasesofacetonitrileandaqueoussolutioncontaining0.1% formicacid,anddetectedonpositive electrosprayionizationwithamultiplereactionmonitoring(mrm)assurveyscan.theresultsshowedthatthe calibrationcurveswerelinearintherangeof0.2~50μg/lformetronidazoleanddimetridazolewithcorelation coeficient(r)morethan0.997.thelodsformetronidazoleanddimetridazolewas0.2μg/kgandtheloqs was0.5μg/kg.theaveragerecoveries(n=6)infeedsamplesatthreespikedlevels(1tismes,2times, 10times)rangedfrom95.3% to103.2% withrelativestandarddeviations(rsds)of %.The 基金项目 : 潍坊市 2015 年科学技术发展计划 (2015ZJ1101); 山东出入境检验检疫局科研基金项目 (SK201349) 作者简介 : 郭礼强, 硕士, 工程师, 从事农兽药残留检测研究 glq1980@sina.com

2 2017,51(1):52~56/ 郭礼强, 等 53 methodwassensitive,convenientandaccurate,andcouldsatisfythedemandofdetectionandanalysisof metronidazoleanddimetridazoleinfeed. Keywords:feed;contentanalysis;metronidazole;dimetridazole;highperformanceliquidchromatography- tandemmasspectrometry 硝基咪唑类药物 (nitromidazoles) 是一类广泛应用的人工合成的具有 5- 硝基咪唑基本结构的抗菌抗原虫药物, 甲硝唑 (metronidazole) 和二甲硝咪唑 (dimetridazole) 为硝基咪唑类药物的两种, 对原虫及各种厌氧细菌具有显著抑制作用, 也用作生长促进剂, 以促进牛猪禽的生长及改善饲料转化率然而, 甲硝唑和二甲硝咪唑对人体有多种毒副作用, 尤其是具有致突变和致癌性欧盟在 96/23/EC 欧盟理事会指令及 EC2377/90 [1] 中将其列入 A 类禁用药, 日本也将二甲硝咪唑列入肯定列表制度, 属于 15 种农业化学品中的一种, 不得在任何食品中检出为防止二甲硝咪唑等致癌药物在食源性动物残留对人体健康产生危害, 我国也于 2002 年禁用了该类药物 [2] 甲硝唑和二甲硝咪唑的检测方法有气相色谱法 [3-4] 气相色谱 - 质谱法 [5-6] [7-11] 液相色谱法以及液相色谱 - 串联质谱法 [12-17], 气相色谱和气相色谱 - 质谱法的缺点是需要衍生化, 液相色谱法的选择性和灵敏度较差, 具有高特异性和灵敏度的液相色谱 - 质谱法是目前检测硝基咪唑类药物含量的首选方法由于监管的滞后和经济利益的驱使, 硝基咪唑类药物经常被用于动物饲料和动物疫病防治过程, 因此建立饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量的分析方法, 增加了检验检疫行政执法的手段饲料成分复杂, 尤其是预混料, 粉尘颗粒较多, 若净化效果不好将严重影响结果的判断, 本文应用液相色谱 - 串联质谱法同时检测饲料中的甲硝唑和二甲硝咪唑药物, 该方法具有快速高效高通量高灵敏度等特点, 为从源头上对动物饲料的监控提供了技术支持 1 材料与方法 1.1 仪器和试剂高效液相色谱 - 高分辨质谱联用仪 :Agilent ( 美国 Agilent 公司 ), 配电喷雾离子源 (ESI); 离心机 :5810R 型 (Eppendorf 公司 ); 氮吹仪 :N-EVAP(OrganomationAsociates 公司 ); 纯水机 :Mili-Q( 美国 Milipore 公司 ); 万分之一天平 (MetlerAE163); 振荡器 (IKA MS1); 5mL 一次性注射器 ;0.22μm 针头过滤器 ; 混合型阳离子交换柱 :60mg/3mL(Agela 公司 ) 甲硝唑二甲硝咪唑和氘代二甲硝咪唑标准品均购于德国 Dr.Ehrenstorfer 公司甲醇乙酸乙酯乙腈和甲酸均为色谱纯, 美国 Biopure 公司 ; 盐酸和氨水为分析纯, 天津科密欧公司标准溶液 : 分别配制甲硝唑二甲硝咪唑和氘代二甲硝咪唑终浓度浓度均为 100ng/mL 的标准溶液, 于 0~4 冰箱中保存定容液 : 取 80mL 0.1% 的甲酸水 (V/V), 与 20mL 乙腈混匀 1.2 样品处理称取 5.0g( 预混合饲料 2.0g) 样品, 置于 50mL 聚丙烯离心管中, 加入内标工作溶液 100μL( 预混合饲料加 40μL), 加入 15mL 乙酸乙酯均质提取 1min,10000r/min 离心 10min, 将上清液转入 50mL 聚丙烯离心管, 残渣再次用 15mL 乙酸乙酯涡混重复提取, 合并提取液, 氮气吹干, 用 0.1mol/L 盐酸 25mL 溶解, 滤纸过滤依次用 3mL 甲醇 3mL0.1mol/L 盐酸活化阳离子交换柱, 将上述溶解液全部过柱, 依次用 5mL0.1mol/L 盐酸,5mL 甲醇淋洗,6mL 洗脱溶液洗脱并收集, 在 40 水浴上氮气吹干, 用 1mL 初始流动相溶液涡旋溶解, 过 0.22μm 滤膜, 供质谱测定 1.3 液相色谱串联质谱条件液相色谱条件色谱柱 :EclipsePlusC18 (3.0mm 100mm,1.8μm); 流动相 A: 甲酸水 (1:999,V/V) 溶液 ; 流动相 B: 乙腈 ; 梯度洗脱程序 :0min20% 流动相 B;3.0min40% 流动相 B; 4.0min90% 流动相 B;4.1min20% 流动相 B; 6.0min20% 流动相 B 进样体积 20μL 柱温 40 ; 流速 0.4mL/min

3 质谱条件６郭礼强等细管电压Ｖ雾化气压力８ｋｐａ大气压电喷雾电离源ＥＳＩ正Ｌｍｉｎ干燥温度离子电离模式干燥气ｐｓｉ多反应监测模式ＭＲＭ甲硝唑和二甲喷雾气ｐｓｉ电子倍增器电压Ｖ毛硝咪唑的部分质谱参数见表表甲硝唑和二甲硝咪唑的部分质谱参数序号母离子ｍｚ二甲硝咪唑子离子ｍｚ保留时间ｍｉｎ毛细管电压Ｖ碰撞能量Ｖ８９６８８甲硝唑８氘代二甲硝咪唑９９定量离子结果与分析Ｎ为作为方法的检出限ＬＯＤ以信信噪比Ｓ对两种目标噪比ＳＮ为作为方法的定量下限ＬＯＱ甲分析物质量浓度在 μｇＬ之间的系列混硝唑和二甲硝咪唑的ＬＯＤ为 μｇｋｇＬＯＱ分合标准溶液进行测定以各定量离子与内标别为 μｇｋｇ两种目标分析物的提取离子流校正离子峰面积之比的平均值Ｙ对其质量浓度图见图回归方程相关系数线性范围检出限和Ｘ μｇＬ绘制标准曲线其相关系数ｒ均大于９９在饲料中添加系列浓度的混合标准物质以定量下限见表线性关系检出限与定量下限图混合标准溶液 μｇＬ中甲硝唑和二甲硝咪唑的多反应监测色谱图表甲硝唑和二甲硝咪唑的线性方程相关系数线性范围检出限与定量下限ｎ６回归方程相关系数ｒ线性范围Ｌ检出限ｋｇ定量下限ｋｇ甲硝唑Ｙ６Ｘ９９９二甲硝咪唑Ｙ８６Ｘ８９９８

4 2017,51(1):52~56/ 郭礼强, 等准确度与精密度在牛预混料空白样品中添加甲硝唑和二甲硝咪唑定量下限 1 倍 2 倍 10 倍 3 个水平的混合标准物质进行加标回收实验以回收率结果表示方法准确度, 回收率的相对标准偏差 (RSD) 表示方法的精密度, 每个水平平行测定 6 个样品, 测定结果见表 3 结果显示, 甲硝唑和二甲硝咪唑在 3 个加标水平下的平均回收率分别为 95.3% ~103.2%, 相对标准偏差 (RSD) 分别为 4.67% ~8.46% 表 3 检测方法的添加精密度和平均回收率 (n=6) 一倍添加 /(μg kg -1 ) 二倍添加 /(μg kg -1 ) 十倍添加 /(μg kg -1 ) 回收率 R/% RSDsr/% 回收率 R/% RSDsr/% 回收率 R/% RSDsr/% 甲硝唑二甲硝咪唑实际样品的测定对市场上购买的 20 份饲料中的甲硝唑和二甲硝咪唑进行测定, 在 1 份鸡预混饲料样品中检出了二甲硝咪唑 (3.1μg/kg), 说明仍存在企业违法添加禁用硝基咪唑类抗菌药物 3 讨论与小结 3.1 样品提取条件的优化饲料基质复杂, 不同的提取溶剂对回收率的影响很大本文考察了甲醇 [10,17] 乙腈 [12,14] [4,15,18] 乙酸乙酯作为提取剂对甲硝唑和二甲硝咪唑回收率的影响, 试验发现采用甲醇乙醇乙腈作为提取剂用于饲料样品的提取, 会产生非常多的干扰杂质, 即使采用阳离子固相萃取柱净化也非常困难, 抑制了目标分析物的灵敏度和回收率, 而使用乙酸乙酯作为提取溶剂, 可以显著降低饲料中的基质干扰试验进一步比较了饲料加水浸润后添加标准品经乙酸乙酯提取和饲料直接添加标准品后经乙酸乙酯提取对回收率的影响, 结果发现, 饲料经水浸泡后经乙酸乙酯提取, 提取回收率反而降低, 说明饲料浸润提取的杂质更多, 不利于目标分析物的检测试验同时考察了酸性乙酸乙酯溶液对目标物回收率的影响, 在饲料基质中添加 15mL 乙酸乙酯后, 再加入 0.1mol/L 盐酸 1mL, 结果发现回收率非常低, 分析后认为在震荡提取的过程中盐酸和目标分析物结合, 造成大部分目标物保留在水相中饲料浸润和提取酸化反而抑制了目标分析物的回收率, 最终确定只用乙酸乙酯作为提取溶剂 3.2 样品净化条件的优化乙酸乙酯提取液中依然含有一定量极性的杂质, 如蛋白质脂肪和色素等脂溶性物质, 尤其是牛预混料, 提取液颜色为棕红色, 对甲硝唑和二甲硝咪唑有一定的干扰为提高方法的灵敏度和通用性, 采用固相萃取进一步净化样品考察了 MCX PCX WCX 三种净化柱对目标物回收率和稳定性的影响, 发现 MCX 和 PCX 净化柱回收率分别为 85.2% 和 84.1%, 要好于 WCX 净化柱, 因 MCX 和 PCX 净化柱回收率差异不明显, 从性价比考虑最终选用 PCX 净化柱乙酸乙酯属于中等极性, 若直接将乙酸乙酯提取液过 PCX 净化柱, 降低了 PCX 净化柱吸附目标物, 影响回收率 ; 净化效果差, 依然有一些色素残留, 干扰目标物分析为提高方法的回收率和灵敏度, 实验进一步考察了甲酸乙酸和盐酸溶解目标物经 PCX 柱净化对回收率的影响提取液经氮气吹干, 分别用 0.1mol/L 的甲酸乙酸和盐酸溶解, 经 PCX 柱净化后经质谱检测, 试验发现三种酸性溶液均能将目标物回收率提高到 80% 以上, 但盐酸质谱噪音低, 灵敏度比甲酸和乙酸高 20% 以上, 最终选用盐酸溶液溶解预混料粉尘多, 乙酸乙酯残渣用盐酸溶液溶解后上柱, 粉尘会堵塞固相萃取柱, 过滤速度慢, 通过试验尝试, 上柱前先将溶解液滤纸过滤, 能够很好解决上柱慢的问题 3.3 定量方法的选择研究发现, 不同饲料样品对甲硝唑和二甲硝咪唑的吸附有一定的差异, 如鸡预混料粉尘颗粒较多, 对目标分析物吸附要比鸡浓缩料和鸡全价料高, 造成提取回收率偏低, 因此在定量方法选择时采用内标法定量, 可以有效的消除不同饲料基质带来的干扰, 本方法采用氘代二甲硝咪唑作为甲硝唑和二甲硝咪唑的内标, 提高了定量方法的准确度 3.4 色谱质谱条件的优化分别配制 500μg/L 的甲硝唑和二甲硝咪唑标准品, 选用正离子模式扫描, 优化各的毛细管电压和碰撞能量, 以响应值最高的两个碎片离子和母离子组成定量离子

5 ,51(1):52~56/ 郭礼强, 等对和定性离子对, 并进行 MRM 参数的优化比较了甲醇和乙腈作为流动相对甲硝唑和二甲硝咪唑的影响, 发现使用乙腈为流动相两种目标物的 MRM 的提取离子流图峰型较好, 保留时间稳定本文建立了饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑的高效液相色谱 - 串联质谱联用的检测方法该方法具有简便快速灵敏准确实用性强等优点, 可以满足复杂饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量的检测要求参考文献 : [1] EEC2377/90 关于确定动物源性食品中兽药制品最高残留限量程序的规定, 国家质量监督检验检疫总局. 欧盟食品卫生法规汇编 [M]. 青岛 : 中国海洋大学出版社,2003:819. [2] 农业部. 中华人民共和国农业部公告第 193 号 [S]. [3] 贾斌, 冯书惠, 王铁良, 等. 气相色谱法测定饲料中二甲硝咪唑方法的研究 [J]. 饲料博览,2007,7: [4] 刘波, 黄为红, 王金中. 气相色谱 - 电子捕获检测器同时测定硝基咪唑类药物 [J]. 分析科学学报,2008,24(5): [5] 傅哲, 彭智, 肖志勇. 气相色谱法测定动物血中甲硝唑浓度及药动学研究 [J]. 长沙医学院,2010,12:5-9. [6] 汪纪仓, 马素英, 王大菊, 等. 气相色谱 - 离子阱串联质谱法同时测定猪肌肉中硝基咪唑类药物残留量 [J]. 畜牧兽医学报,2008,39(12): [7] 李玉文, 田颖, 孙晓伟. 高效液相色谱法测定饲料中二甲硝咪唑 [J]. 饲料工业,2001,22(6):37. [8] 戴华, 李拥军, 袁智能, 等. 猪饲料中甲硝唑二甲硝咪唑药物含量的 HPLC 法测定 [J]. 光谱实验室,2004,21(2): [9] 胡海燕, 徐倩, 孙雷. 鸡肉组织中硝基咪唑类药物及代谢物多残留检测高效液相色谱法研究 [J]., 2008,42(8):9-12. [10] 冯学忠, 黎华鹏, 盘苑芷, 等.HPLC 同时测定复方二甲硝咪唑可溶性粉中地美硝唑甲氧苄啶磺胺对甲氧嘧啶的含量 [J]. 动物医学进展,2011,32(7): [11] 秦松, 张蓓.RP-HPLC 法测定人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑的溶出度 [J]. 中国医药科学,2015,5(21): [12] 郭少飞, 王鹏, 荆涛林, 等. 高效液相色谱 - 串联质谱法同时测定蜂蜜中甲硝唑二甲硝咪唑和洛硝哒唑残留 [J]. 华中科技大学学报 ( 医学版 ),2008,37(6): [13] 刘永明, 曹彦忠, 李金, 等. 液相色谱 - 串联质谱法快速测定蜂蜜中 3 种硝基咪唑类药物残留 [J]. 色谱,2010,28(6): [14] 徐娟, 陈捷, 邵琳智, 等. 超高效液相色谱 - 串联质谱法同时检测口腔卫生用品中的硝基咪唑类药物 [J]. 色谱, 2011,29(5): [15] 张鸿伟, 简慧敏, 林黎明, 等. 液相色谱 - 四极杆 / 离子阱质谱快速测定蜂蜜中痕量硝基咪唑类药物及其代谢物残留 [J]. 分析测试学报,2012,31(7): [16] 班付国, 胡兴娟, 吴宁鹏, 等. 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定猪肉中 66 种兽药残留的研究 [J]., 2014,48(6): [17] 郭菁, 丁立平, 吴文凡, 等. 高效液相色谱 - 电喷雾串联质谱法同时测定水产品中硝基咪唑类及其代谢物残留 [J]. 分析测试学报,2015,34(1): [18]GB/T 中华人民共和国国家标准. 饲料中硝基咪唑类药物的测定液相色谱 - 串联质谱法 [S]. ( 编辑 : 侯向辉 )

Captiva EMR-Lipid 结合 LC-QQQ 测定动物源性食品中硝基咪唑类药物

应用简报食品检测与农业 Captiva EMR-Lipid 结合 LC-QQQ 测定动物源性食品中硝基咪唑类药物作者安娟吴翠玲黄悯嘉安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司摘要本应用简报采用 Captiva EMR-Lipid 对鸡肉猪肉和猪肝样品中的 7 种硝基咪唑类药物进行萃取净化后, 在 Agilent 647 LC-QQQ 上进样分析前处理过程简单快速并且分析结果符合国家标准要求的检测限与定量限,