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1 2012 年 11 月 Vol. 30 No. 11 November 2012 Chinese Journal of Chromatography 1143 ~ 1147 研究论文 DOI: / SP. J 高效液相色谱 - 串联质谱法检测乳制品中 10 种氨基糖苷类抗生素残留龚强, 丁利, 朱绍华, 焦艳娜, 成婧, 付善良, 王利兵 ( 湖南出入境检验检疫局技术中心, 食品安全科学技术湖南省重点实验室, 湖南长沙 ) 摘要 : 建立了乳制品中链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素妥布霉素庆大霉素安普霉素潮霉素 B 巴龙霉素阿米卡星等 10 种氨基糖苷类抗生素 (aminoglycosides, AGs) 残留的高效液相色谱 - 串联质谱 (HPLC-MS / MS) 检测方法乳制品提取液经亲水 - 亲脂平衡 (hydrophilic- lipophilic balance, HLB) 柱净化后, 采用反相离子对高效液相色谱分离, 电喷雾串联四极杆质谱检测对样品前处理条件液相色谱流动相以及质谱条件进行了优化结果表明 :10 种 AGs 在 20 ~ μg / L 范围内定量离子的峰面积和样品的质量浓度之间有很好的线性关系 ; 在乳制品中的加标回收率为 ~ , 相对标准偏差为 3. 4 ~ 该方法简便灵敏准确, 可用于乳制品中多种 AGs 残留的同时检测关键词 : 高效液相色谱 - 串联质谱 ; 亲水 - 亲脂平衡柱 ; 氨基糖苷类抗生素 ; 乳制品中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2012) Determination of ten aminoglycoside residues in milk and dairy products using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry GONG Qiang, DING Li, ZHU Shaohua, JIAO Yanna, CHENG Jing, FU Shanliang, WANG Libing (Technology Center of Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hunan Key Laboratory of Food Safety Science &Technology, Changsha , China) Abstract: A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ( HPLC-MS / MS) analytical method was developed for the simultaneous determination of ten aminoglycoside residues ( streptomycin, dihydrostrepmycin, neomycin, kanamycin, tobramycin, gentamycin, apramycin, hygromycin B, paromomycin, and amkacin) in milk and dairy products. The sample was extracted with 5 trichloroacetic acid aqueous solution, then the extract was purified by a hydrophilic-lipophilic balance ( HLB) cartridge. The ten aminoglycoside residues were separated by ion-pair reversed phase high performance liquid chromatography. Heptafluorobutyric acid was used as ion pair agent due to its volatility. Then the analytes were detected by electrospray ionization tandem mass spectrometry. The pretreatment condition of the sample, the HPLC condition and the MS operation parameters were optimized. The results showed that the linearities of the ten aminoglycoside residues in μg / L had the correlation coefficient between The recoveries ranged from and with the relative standard deviations of The proposed method was successfully applied to the determination of the mass concentrations of the analytes in related samples, which provides a simple, and convenient method for the quality control of milk and dairy products. Furthermore, this method is effective for the safety monitoring of aminoglycoside residues in milk and dairy products. 通讯联系人 : 王利兵, 博士, 研究员, 研究方向为食品安全与检验检疫安全. Tel: (0731) , wanglb1@ 163. com. 基金项目 : 国家十二五科技支撑计划项目 (2011BAK10B05, 2012BAD29B05). 收稿日期 :

2 1144 色谱第 30 卷 Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ( HPLC-MS / MS); hydrophilic-lipophilic balance (HLB) cartridge; aminoglycosides; milk and dairy products 氨基糖苷类抗生素 (aminoglycosides, AGs) 是一种由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素药物 AGs 对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果, 可以有效抑制细菌的生长和繁殖, 是目前我国畜牧业农业和水产业中常用的兽药之一, 也常添加到饲料中促进动物生长发育 [1] AGs 药物具有耳毒性和肾毒性等毒副作用, 人类长期食用残留超标的畜产品将直接造成伤害为了保障食品安全, 欧盟明确规定禁止将 AGs 药物作为畜禽促生长添加剂使用, 美国食品药品监督管理局 ( FDA) 及许多国家和机构针对该类药物在食品中的残留都规定了明确的最大残留限量 [2], 如日本肯定列表中规定大观霉素在食品中的残留限量为 300 μg / kg, 牛奶和羊奶中的残留限量是 200 μg / kg 近年来, 我国也加强了对动物源食品中该类药物的残留监控目前, 兽药残留的痕量检测, 尤其是多种抗生素的同时检测通常采用高效液相色谱 - 串联质谱法 (HPLC-MS / MS) [3] HPLC-MS / MS 对于前处理的要求比较高, 乳制品样品基质复杂, 有大量的内源性化合物干扰分析物的测定, 对于质谱的电离源也会造成一定的污染检测 AGs 药物时, 前处理通常采用离子交换反相吸附小柱, 但是效果往往不尽如人意亲水 - 亲脂平衡 ( hydrophilic-lipophilic balance, HLB) 介质以多孔二乙烯基苯 -N- 乙烯基吡咯烷酮为框架结构, 具有良好的亲水亲脂特性及更好的稳定性和广泛的 ph 适用性, 优于其他的反相固相萃取柱, 可用于极性或非极性化合物的提取富集 [4 - 和净化 6] 本文以链霉素双氢链霉素庆大霉素潮霉素 B 卡那霉素阿米卡星新霉素巴龙霉素妥布霉素安普霉素等 10 种 AGs 药物作为研究对象, 建立了简便快速特异性强灵敏度高的 HPLC-MS / MS 检测方法, 为乳制品中 AGs 药物残留监控提供了良好的定性和定量技术手段 1 实验部分 1. 1 仪器试剂与材料岛津 20 A 高效液相色谱仪, 配自动进样器和柱温箱 ( 日本岛津公司 ); API 4000 电喷雾三重四极杆质谱检测器 ( 美国 AB 公司 ) SK-1 快速混匀器 ( 金坛市富华仪器有限公司 ) BRANSON 型超声波清洗器 ( 必能信超声有限公司 ) 链霉素双氢链霉素庆大霉素安普霉素巴龙霉素新霉素妥布霉素卡那霉素阿米卡星潮霉素 B 标准品 ( 纯度高于 90. 0, 德国 Dr. Ehrenstorfer 公司 ) 七氟丁酸 ( heptafluorobutyric acid, HFBA)( 纯度高于 99, 美国 Sigma 公司 ) 氯仿为分析纯乙腈 ( 色谱纯, 德国 Merck 公司 ) 实验用水由 Millipore 超纯水仪 ( 美国 Millipore 公司 ) 制备 1. 2 标准溶液的配制分别准确称取 10 mg 链霉素双氢链霉素庆大霉素安普霉素巴龙霉素新霉素妥布霉素卡那霉素阿米卡星潮霉素 B 标准品于 10 ml 容量瓶中, 用水溶解, 分别配制成 1 g / L 的单标储备溶液准确移取 10 种单标储备液各 100 μl 混合于 10 ml 容量瓶中, 用甲醇 - 水 (1 1, v / v) 溶液稀释配制成 10 mg / L 的中间标准工作液精密量取适量的中间标准工作液, 分别用处理过的空白基质样品配制成不同质量浓度的系列标准工作溶液, 现用现配所有溶液于 - 4 下冷藏避光储存 ( AGs 易与玻璃制品发生吸附 [7], 实验过程中尽量都使用塑料制品 ) 1. 3 样品前处理提取奶粉 : 称取奶粉 1 g( 精确至 g) 样品于 50 ml 离心管中, 加入 5 三氯乙酸 10 ml, 混匀 3 min, 放入超声仪中超声 10 min, 加入三氯甲烷 2 ml, 混匀后于 r / min 下离心 5 min, 将上层清液转移至另一支离心管再用 5 ml 提取液重复以上提取过程合并提取液, 待净化液态奶 : 称取液态奶 2 g( 精确至 g) 样品于 50 ml 离心管中, 加入 5 三氯乙酸 10 ml, 混匀 3 min, 放入超声仪中超声 10 min, 然后于 r / min 下离心 5 min, 将上层清液转移至另一支离心管再用 5 ml 提取液重复以上提取过程合并提取液, 待净化净化依次用 5 ml 水 5 ml 甲醇 5 ml 2 mmol / L HFBA 活化 HLB 小柱, 弃去淋洗液 ; 将上述所得的提取液过柱, 用 5 ml 水淋洗, 弃去淋洗液 ; 然后用 6 ml 甲醇洗脱, 控制流速为 0. 5 ml / min, 收集所有流出液, 在 40 下空气吹浓缩至 0. 5 ml 用甲醇 - 水 (1 1, v / v) 溶液定容至 1 ml, 过 μm 有机

3 第 11 期龚强, 等 : 高效液相色谱 - 串联质谱法检测乳制品中 10 种氨基糖苷类抗生素残留 1145 滤膜, 滤液供 HPLC-MS / MS 测定 1. 4 HPLC-MS / MS 条件 HPLC 条件色谱柱 :Phenomenex C18 柱 (150 mm 3. 0 mm, 5 μm); 流动相 : 溶剂 A 为 2 mmol / L HFBA 溶液, 溶剂 B 为乙腈梯度洗脱程序 :0 ~ min, 85 A ~ 55 A; min, 85 A; ~ min, 85 A 流速 :0. 3 ml / min; 柱温 :35 ; 进样量 :20 μl MS / MS 条件离子源 : 电喷雾电离离子源 ( ESI); 扫描方式 : 正离子扫描 ; 雾化气 (Gas1) 压力 : kpa( psi); 辅助气 ( Gas2) 压力 : kpa( psi); 离子喷雾电压 ( IS): V; 气帘气 ( CUR) 压力 : kpa ( psi); 离子化温度 ( TEM): 550 ; 检测方式 : 多反应监测 ( MRM) 扫描模式优化得到的 10 种 AGs 在正离子模式下的质谱分析参数见表 1 Precursor ion (m / z) 表 1 10 种氨基糖苷类抗生素质谱分析参数 Table 1 MS / MS parameters of the ten aminoglycosides Product ions (m / z) Declustering Collision energy / ev Entrance Collision cell exit Streptomycin Dihydrostrepmycin Apramycin Paromomycin Kanamycin Gentamycin Amkacin Hygromycin B Neomycin Tobramycin Quantitative ion. 2 结果与讨论 2. 1 样品前处理条件的优化由于乳制品样品基质复杂, 含有较高浓度的蛋白质及大量的内源性化合物, 干扰分析物的测定, 因此必须使蛋白质变性沉淀, 同时释放出药物, 减少基质影响依据氨基糖甙类药物易溶于水的性质, 三氯乙酸水溶液可对目标物进行有效的提取 [8], 我们对三氯乙酸的浓度进行了优化实验结果表明 :5 三氯乙酸可以对目标物进行充分提取, 也可以较好地沉淀蛋白质提取液经固相萃取 ( SPE) 柱净化比较了 Oasis HLB Supelco SCX PCX Oasis WCX 等 4 种固相萃取小柱的净化效果 4 种净化小柱对牛奶中 10 种 AGs(50 μg / kg) 的添加回收率的影响见图 1 由图 1 可以看出,Oasis HLB 小柱对 10 种 AGs 药物 ( 除潮霉素 B 外 ) 的回收率均大于 70, Oasis WCX 对于新霉素的回收率在 40 以下,PCX 以及 Supelco SCX 对于绝大部分 AGs 药物的回收率低于 HLB 小柱因此我们采用 Oasis HLB 对提取液进行净化 2. 2 HPLC 条件优化由于 AGs 药物易溶于水, 极性强, 在 C18 柱上保留很弱, 因此我们选择在流动相中添加改性剂 ( 酸盐离子对试剂 ) 的方法来增加目标物在柱上的保留时间我们分别试验了甲醇乙酸甲醇 -5 mmol / L 甲酸铵 ( 含 0. 1 甲酸 ) 和甲醇 - 离子对试剂 3 种不同类型的流动相以甲醇乙酸为流动相时各目标物都出峰, 但响应很低, 而且各目标物的出峰时间很快, 分离效果不佳 ; 以甲醇 -5 mmol / L 甲酸铵 ( 含 0. 1 甲酸 ) 为流动相时只有链霉素双氢链霉素响应较好, 其余目标物响应较低, 而且增加盐离子后对目标物在 C18 柱上的保留没

4 1146 色谱第 30 卷 Fig. 1 图 1 4 种净化小柱对牛奶中 10 种 AGs 药物加标回收率的影响 Effects of four different SPE cartridge on recoveries of the ten aminoglycosides spiked in milk 有明显改善以甲醇 - 离子对试剂流动相时, 我们尝试了三氟乙酸五氟丙酸七氟丁酸 3 种不同的离子对试剂随着全氟羧酸的碳链增长,AGs 药物的保留显著增加这种现象可以用离子对试剂本身的疏水性影响离子性样品保留值来解释 : 烷基碳链较大的离子对试剂使得形成的离子对与固定相亲和力较大, 因此被分离的溶质离子的保留值也较大, 因此我们选用了七氟丁酸作为流动相添加剂由于七氟丁酸有离子化抑制效应, 我们从分离效果和离子抑制效应综合考虑, 优化了七氟丁酸在流动相中的浓度, 比较了以不同浓度 (1 2 5 mmol / L) 的七氟丁酸作流动相的分离情况, 结果表明 2 mmol / L 七氟丁酸作流动相时目标物的响应最高, 也可以使各目标物得到很好的保留我们还进一步比较了甲醇乙腈作流动相的有机相时的分离效果以乙腈作流动相时各目标物的响应和峰形都优于甲醇 [7,9,10], 故选择乙腈作为流动相的有机相因此, 最终确定流动相为乙腈 -2 mmol / L HFBA 为了得到目标物合适的保留时间和峰形, 进一步优化了流动相梯度 2. 3 质谱条件优化 AGs 是由氨基环醇氨基糖和糖组成的抗生素的总称, 其化学结构都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷该类化合物结构中含有一个或多个羟基伯胺或仲胺基团, 呈弱碱性, 在质谱上有很强的正离子响应, 因此选用正离子模式进行扫描首先采用 1 mg / L 的单标准溶液进行流动注射分析, 在正离子模式下进行母离子全扫描, 在 10 种 AGs 的一级质谱图中均出现准分子离子峰 [ M + 2H] 2 + 或 [M + H] +, 而且丰度较大, 因此选择准分子离子峰作为母离子分别对 10 种 AGs 的母离子进行二次碎裂, 得到碎片离子峰的信息, 在确定各目标物的特征离子对后, 在 MRM 模式下优化去簇电压碰撞能量碰撞室出口电压, 然后联机液相色谱仪, 在流动注射分析下优化碰撞气压力雾化气压力辅助气压力气帘气压力喷雾电压离子化温度等质谱参数在优化的色谱及质谱条件下, 代表性的 4 种 AGs 的 MRM 色谱图见图 2 图 2 4 种 AGs(100 μg / L) 的多反应监测 (MRM) 色谱图 Fig. 2 Chromatograms of four aminoglycosides (100 μg / L) in MRM mode 2. 4 方法的线性关系与定量限用空白基质溶液配制一系列 AGs 质量浓度分别为 μg / L 的混合标准

5 第 11 期龚强, 等 : 高效液相色谱 - 串联质谱法检测乳制品中 10 种氨基糖苷类抗生素残留 1147 工作溶液, 在 20 ~ μg / L 范围内,10 种分析物的质量浓度 x( μg / L) 与其定量离子的峰面积 y 之间均有良好的线性关系, 相关系数在 ~ 之间分析物的定量限 ( LOQ) 根据其响应值大于或等于基线响应值的 10 倍 (S / N 10) 且准确度和精密度 ( 以相对标准偏差 ( RSD) 计 ) < 20 来确定采用添加法进行实际样品检测, 奶粉中 AGs 的 LOQ 为 20 μg / kg, 牛奶中 AGs 的 LOQ 为 10 μg / kg 2. 5 方法的回收率和精密度采用在空白牛奶和奶粉样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率测定分别添加低 ( μg / kg) 中(50. 0 μg / kg) 高( μg / kg)3 个水平, 按所建立的方法进行样品处理及测定, 每个浓度水平进行 5 次重复测定, 平均加标回收率和精密度见表 2 表 2 空白奶粉和牛奶样品中 10 种 AGs 的加标回收率及相对标准偏差 (n = 5) Table 2 Recoveries and relative standard deviations ( RSDs) of the ten aminoglycosides spiked in milk and milk powder blank samples (n = 5) Spiked / (μg / kg) Milk powder Milk Spiked / (μg / kg) Milk powder Milk Streptomycin Tobramycin Dihydrostrepmycin Amkacin Apramycin Hygromycin B Paromomycin Neomycin Kanamycin Gentamycin 实际样品检测采用所建立的方法对本实验室 2012 年 1-5 月期间的 100 个乳制品样品进行 AGs 药物的检测, 未检出 AGs 3 结论采用高效液相色谱 - 串联质谱方法对乳制品中链霉素双氢链霉素安普霉素巴龙霉素卡那霉素庆大霉素妥布霉素阿米卡星潮霉素 B 和新霉素等 10 种 AGs 残留进行了快速准确的定量与定性分析该方法准确度高, 假阴性率低, 方法学完善, 适用于实际样品的检测, 同时为相关部门进行 AGs 残留检测提供了科学依据参考文献 : [1] Tanaka N, Hooper I R. Aminoglycoside Antibiotics. Berlin: Springer-Verlag, 1982: 221 [2] Zhou Z Y, Wang S X. Re-edited Frequently-used Drugs Manual. 2nd ed. Beijing: Jindun Press ( 周自永, 王世祥. 新编常用药物手册. 2 版. 北京 : 金盾出版社 ), 1994: 446 [3] Zhu W X, Yang J Z, Wei W, et al. J Chromatogr A, 2008, 1207: 29 [4] He J, Giusti M M. J Chromatogr A, 2011, 1218: 7914 [5] Zheng Y, Liu Y, Guo H, et al. Anal Chim Acta, 2011, 690 (2): 269 [6] Tan L, Wlasichuk K B, Schmidt D E Jr, et al. J Pharm Biomed Anal, 2012, 66: 75 [7] Liu X X, Ding L, Zhang Y, et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory ( 刘晓霞, 丁利, 张莹, 等. 分析试验室 ), 2010, 29 (8): 48 [8] LeBrun M, Huang H, He R, et al. Can J Microbiol, 2008, 54 (6): 467 [9] Liu X X, Ding L, Liu J X, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 刘晓霞, 丁利, 刘锦霞, 等. 色谱 ), 2010, 28(11): 1020 [10] Wu X H, Ding L, Li Z H, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 吴新华, 丁利, 李忠海, 等. 色谱 ), 2010, 28(11): 1094

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.