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1 南京农业大学学报 2014ꎬ37(5): http: / / nauxb.njau.edu.cn Journal of Nanjing Agricultural University doi: / j.issn 王延映 ꎬ 彭麟 ꎬ 余祖功 ꎬ 等. 高效液相色谱法测定饲料中甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑 [J]. 南京农业大学学报 ꎬ2014ꎬ37(5): 高效液相色谱法测定饲料中甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑王延映 ꎬ 彭麟 ꎬ 余祖功 ( 南京农业大学动物医学院 ꎬ 江苏南京 ) 摘要 : 为建立能同时检测饲料中甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑的简便准确的高效液相色谱方法 ꎬ 样品用乙酸乙酯提取 MCX 固相萃取柱净化 ZORBAX SB C 18 柱 (4.6 mm 250 mmꎬ5 μm) 分离 ꎬ 以甲醇 - 水为流动相 ꎬ 梯度洗脱 ꎬ320 nm 紫外检测 ꎬ 外标法定量 ꎮ 结果表明 : 此条件下 ꎬ3 种药物分离良好 ꎬ 标准曲线回归系数为 ~ ꎬ 线性范围 0.02 ~ 10 μg ml -1 ꎻ 平均回收率 75.3% ~ 106.3%ꎬ 批内变异系数 1.3% ~ 12.4%ꎬ 批间变异系数 2.4% ~ 9.7%ꎬ 甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑检测限均为 0.01 mg kg -1 ꎬ 定量限为 0.02 mg kg -1 ꎮ 结论 : 该法操作简单结果准确 ꎬ 可用于测定饲料中甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑的含量 ꎮ 关键词 : 甲硝唑 ꎻ 地美硝唑 ꎻ 异丙硝唑 ꎻ 饲料 ꎻ 高效液相色谱法中图分类号 :S859.7 文献标志码 :A 文章编号 : (2014) Determination of metronidazoleꎬdimetridazole and ipronidazole in feeds by HPLC WANG YanyingꎬPENG LinꎬYU Zugong ( College of Veterinary MedicineꎬNanjing Agricultural UniversityꎬNanjing ꎬChina) Abstract:The purpose of this study was to develop a simple and effective method that optimized the high performance liquid chroma tography( HPLC) method for determination of metronidazoleꎬdimetridazole and ipronidazole in feeds by investigating the extraction and clean up conditions. Samples were weighed into 50 ml polypropylene centrifuge tubes and extracted by mechanical shaking for 30 min with 15 ml ethyl acetate. After extractionꎬthe content was centrifuged at r min -1 for 10 min and the extract was trans ferred to a new polypropylene centrifuge tube. The unsolved feed matrix was extracted again by adding 15 ml ethyl acetate and the extract was collected. Both obtained ethyl acetate extractions were combined and evaporated just to dryness with a pressure blowing concentrator(water bath at 35 ). The residue was dissolved in 300 μl ethyl acetate and 4 ml hexane and the solution was trans ferred to a 10 ml polypropylene centrifuge tube first. Then 1.5 ml phosphoric acid solution(0.1 mol L -1 )was added into the tube. After vortexing(1 min)and centrifuging(10 minꎬ8 000 r min -1 )ꎬthe lower aqueous phase was collected in a 5 ml polypropylene centrifuge tube. The supernatant organic phase was extracted again by adding 1.5 ml phosphoric acid solution(0.1 mol L -1 ) and both the obtained lower aqueous phases were combined. The obtained solution was purified using mixed mode cation exchange (MCX)solid phase extraction(spe)column and filtered using a 0.22 μm filter. 10 μl were injected by the auto sampler and separa ted with UV detector 320 nm pumping at a flow rate of 0.8 ml min -1. The liquid chromatographic separation of the extracts was per formed on a C 18 bonded silica column applying a gradient of elution with water(a)and methanol(b). The total run time was 20 min. Results showed that the limit of detection of metronidazoleꎬdimetridazole and ipronidazole was 0.01 mg kg -1 ꎬand the quantitation limit was 0.02 mg kg -1. The recoveries of the metronidazoleꎬdimetridazole and ipronidazole for feeds samples spiked with 0.02ꎬ 0.05ꎬ0.5ꎬ5 mg kg -1 were in the range of 75.3%-106.3%. The linearity was satisfactory with a correlation coefficient of at concentrations ranging from 0.02 to 10 μg ml -1. The intra day precision( n = 5) for nitroimidazoles in feeds spiked at 0.02ꎬ0.05ꎬ0.5ꎬ5 mg kg -1 were in the range of 1.3%-12.4% and the inter day precision for 3 days(n = 5)was 2.4%-9.7%. Conclu sion:this method was characterised simplicity of operator with accurate resultsꎬand thus could be used to determine the contents of metronidazoleꎬdimetridazole and ipronidazole in feeds. Keywords:metronidazoleꎻdimetridazoleꎻipronidazoleꎻfeedsꎻHPLC 硝基咪唑类药物具有潜在的致癌致畸致突变作用和遗传毒性 [1] ꎬ 欧盟北美和中国等均已禁止作为抑菌促生长剂添加在饲料中 [2] ꎮ 在饲料兽药残留监控实践中 ꎬ 寻求简便快速准确的检测方法十分收稿日期 : 基金项目 : 农业行业标准制定与修订 ( 农产品质量安全 ) 项目 (2013) 作者简介 : 王延映 ꎬ 硕士研究生 ꎮ 通信作者 : 余祖功 ꎬ 副教授 ꎬ 主要从事新兽药药理研究及兽药新制剂的研发 ꎬE mail:yuzugong@ njau.edu.cnꎮ

2 124 南京农业大学学报第 37 卷必要 ꎮ 国内外有关硝基咪唑类药物检测方法 ꎬ 有气相色谱法 [3] 气相色谱- 质谱法液相色谱法 [4] 液相色谱 - 质谱或串联质谱法 [5-6] 免疫检测法和薄层色谱法等 ꎬ 仍以高效液相色谱 (HPLC) 法普及实用简便 ꎮ 文献报道该类药物的 HPLC 检测方法中 [7-9] ꎬ 存在诸如针对单一药物测定采用毒性大的含氯有机提取溶剂检测限过高 ( 0.4 mg kg -1 ) 等不足 ꎮ 本文拟在前人研究基础上 ꎬ 优化并确定一种简单快捷重现性好 ꎬ 能同时测定饲料中甲硝唑 ( metronidazoleꎬ MNZ ) 地美硝唑 ( dimetridazoleꎬ DMZ ) 和异丙硝唑 (ipronidazoleꎬipz) 的高效液相色谱检测方法 ꎬ 为监控饲料中该类药物提供参考 ꎮ 1 材料与方法 1.1 仪器和设备 Waters e2695 高效液相色谱仪 Waters 2489 紫外检测器 ( 美国 Waters 公司 )ꎻ 冷冻离心机 (3K15ꎬSigma 公司 )ꎻMCX 固相萃取柱 (60 mg / 3 mlꎬwaters 公司 )ꎮ 1.2 试剂和材料甲硝唑对照品地美硝唑对照品 ( 中国兽医药品监察所 ꎬ 纯度均为 99.9%) 异丙硝唑标准品( 德国 Drꎬ 纯度 99.0%)ꎻ 乙腈甲醇甲酸均为色谱纯 ( TEDIA 公司 )ꎻ 磷酸乙酸乙酯正己烷均为分析纯 ( 南京化学试剂有限公司 )ꎻ 鸡配合饲料猪配合饲料均购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场 ꎮ 混合标准储备液配制 : 分别准确称取 MNZ DMZ 和 IPZ 标准品各 mgꎬ 用甲醇溶解并定容于 100 ml 棕色容量瓶中 ꎬ 配成 100 μg ml -1 标准溶液 ꎮ 混合标准工作液配制 : 分别准确移取一定体积的混合标准储备液 ꎬ 用甲醇稀释成和 10 μg ml -1 的标准工作液 ꎬ 均 4 保存 ꎮ 洗脱液为 : 水 - 氨水 - 甲醇溶液 ( 体积比为 )ꎮ 1.3 样品前处理提取称取饲料样品 2.00 g 于 50 ml 离心管中 ꎬ 加 15 ml 乙酸乙酯 ꎬ 涡动 1 minꎬ300 r min -1 振荡 30 minꎬ6 000 r min -1 离心 10 minꎮ 取上清液于另一 50 ml 离心管中 ꎬ 下层残渣用 15 ml 乙酸乙酯重复提取一次 ꎮ 合并 2 次上清液于同一 50 ml 离心管 ꎬ 为样品提取液 ꎮ 净化将样品提取液于 35 用氮气吹至近干 ꎮ 加 300 μl 乙酸乙酯 ꎬ 涡动 10 sꎬ 加 4 ml 正己烷 ꎬ 涡动 30 sꎬ 全部转移至 10 ml 离心管中 ꎮ 往样品提取液离心管中加 1.5 ml 磷酸溶液 (0.1 mol L -1 )ꎬ 涡动 1 minꎬ 全部转移至同一离心管中 ꎮ 加盖密闭 ꎬ 涡动 30 sꎬ8 000 r min -1 离心 10 minꎬ 取下层水相于 5 ml 离心管 ꎮ 上层有机相用 1.5 ml 磷酸溶液 (0.1 mol L -1 ) 重复萃取一次 ꎬ 合并 2 次水相作为固相萃取上样液 ꎮ 将 MCX 固相萃取柱安装于固相萃取装置上 ꎬ 依次用 2 ml 乙腈 2 ml 磷酸溶液活化 ꎮ 将固相萃取上样液加载到固相萃取柱上 ꎬ 依次用 1 ml 磷酸溶液 2 ml 甲醇淋洗 ꎬ 抽真空 ꎮ 用 2 ml 固相萃取柱洗脱液洗脱 ꎬ 往洗脱液中加 20 μl 甲酸 ꎬ 混匀 ꎬ 过 0.22 μm 滤膜 ꎬ 滤液供高效液相色谱仪测定 ꎮ 1.4 色谱条件色谱柱 ZORBAX SB C 18 (4.6 mm 250 mmꎬ5 μm)ꎻ 波长 320 nmꎻ 流动相为水 (A) 和甲醇 (B)ꎬ 梯度洗脱程序见表 1ꎻ 流速 0.8 ml min -1 ꎻ 柱温 30 ꎻ 进样体积 10.0 μlꎮ 表 1 梯度洗脱程序 Table 1 The gradient conditions t / min 流速 / (ml min -1 ) Flow 流动相 B / % Mobile phase B 流动相 A / % Mobile phase A t / min 流速 / (ml min -1 ) Flow 流动相 B / % Mobile phase B 流动相 A / % Mobile phase A 注 : 流动相 A Mobile phase A: 水 Waterꎻ 流动相 B Mobile phase B: 甲醇 Methanol 1.5 方法学验证线性响应试验将混合标准工作液依次从低浓度到高浓度进样分析 ꎬ 每个浓度 3 个平行 ꎬ 按其所得峰面积的平均值与对应的标准工作液浓度 (μg ml -1 ) 作标准曲线 ꎬ 计算回归方程和相关系数 ꎮ 药物添加回收率与检测方法精密度试验将适量质量浓度的标准工作液分别添加到两种空白样

3 第 5 期王延映 ꎬ 等 : 高效液相色谱法测定饲料中甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑 125 饲料品中 ꎬ 采用标准添加法进行方法回收率测定 ꎮ 取已知空白的鸡配合饲料猪配合饲料 ꎬ 设和 5 mg kg -1 4 个添加水平 ꎬ 并分别设空白对照 ꎬ 按 1.3 节方法处理 ꎬ 并按 1.4 节的 HPLC 检测方法测定 ꎬ 每个浓度 5 个平行 ꎬ 连续测定 3 dꎬ 计算回收率与变异系数 ꎮ 方法最低检测限与定量限试验分别取标准储备液 ꎬ 采用倍比稀释 ꎬ 分别加入到两种饲料当中 ꎬ 按 1.3 节的方法进行处理 ꎬ 并按照 1.4 节的 HPLC 检测方法测定 ꎮ 将色谱峰 3 倍信噪比 (S / N) 时的添加浓度定义为检测限 ꎬ10 倍信噪比 (S / N) 时的浓度定义为定量限 ꎮ 色谱图分析将标准溶液色谱图空白饲料样品色谱图以及饲料添加样品色谱图进行比较 ꎬ 考察杂质对药物的干扰情况 ꎮ 2 结果与分析 2.1 线性响应试验结果 3 种硝基咪唑类药物的回归方程及相关系数如表 2 所示 ꎮ 结果显示 ꎬ 标准曲线的相关系数为 ~ ꎬ 在 0.02 ~ 10 μg ml -1 范围内线性良好 ꎮ 2.2 药物添加回收率与检测方法精密度试验由表 3 可知 : 在 4 个药物添加水平上 ꎬ3 种硝基咪唑类药物平均回收率为 75.3% ~ 106.3%ꎬ 符合饲料中药物添加剂分析标准要求 ꎻ 变异系数 1.3% ~ 12.4%ꎬ 表明该方法符合残留分析精密度要求 ꎮ 药物名称 Drug 表 2 Table 2 药物 Drug 甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑的回归方程 Regression equations of metronidazoleꎬ dimetridazole and ipronidazole 回归方程 Regression equations 相关系数 Correlation coefficient 甲硝唑 Metronidazole y = x 地美硝唑 Dimetridazole y = x 异丙硝唑 Ipronidazole y = x 表 3 甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑的回收率试验结果 (n = 5) Table 3 The components recovery test of metronidazoleꎬdimetridazole and ipronidazole( n = 5) 添加量 / (mg kg -1 ) Added amount 回收率 / % Recovery 鸡配合饲料 Poultry formula feed 批内变异系数 / % Intra assay RSD 批间变异系数 / % Inter assay RSD 回收率 / % Recovery 猪配合饲料 Swine formula feed 批内变异系数 / % Intra assay RSD 批间变异系数 / % Inter assay RSD 甲硝唑 Metronidazole 地美硝唑 Dimetridazole 异丙硝唑 Ipronidazole 方法最低检测限与定量限试验采用标准添加法 ꎬ 在空白饲料中加入不同浓度的标准溶液 ꎬ 处理后上机检测 ꎬ 以色谱峰信噪比 (S / N) 不小于 3 确定甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑在饲料中的检测限均为 0.01 mg kg -1 ꎬS / N 不小于 10 确定定量限均为 0.02 mg kg -1 ꎮ 2.4 色谱图分析由图 1 可知 : 甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑的保留时间分别为和 minꎬ 三者峰形尖锐对称性好 ꎻ 空白饲料与标准溶液饲料添加药物的检测图谱比较 ꎬ 在 3 个目标峰处均无杂质峰干扰 ꎬ 分离度高 ꎬ 方法专属性良好 ꎮ

4 126 南京农业大学学报第 37 卷 Fig. 1 图 1 不同饲料中添加硝基咪唑类药物的 HPLC 色谱图 HPLC chromatograms of the determination nitroimidazoles in feeds 3 讨论 3.1 流动相的选择和优化 [7-8] 液相色谱测定硝基咪唑类药物方法 ꎬ 流动相可选用乙腈 + 缓冲溶液或甲醇水作流动相进行药物分离 ꎬ 由于乙腈盐溶液的流动相易对液相色谱仪产生不良影响 ꎬ 笔者选择用甲醇和水 [10] ꎮ 在本试验中 ꎬ 笔者重点对流动相的比例进行了研究 ꎬ 发现甲醇水不同比例对药物与杂质的分离效果影响很大 ꎬ 当含甲醇 33% 时 ꎬMNZ 和 DMZ 与杂质完全分离 ꎬIPZ 处有杂质干扰 ꎻ 而将甲醇调为 40% 时 ꎬIPZ 与杂质分离 ꎬ 故最终选择梯度洗脱来分离药物 ꎬ 以达到最佳分离效果 ꎬ MNZ DMZ IPZ 的保留时间分别为和 minꎮ 3.2 固相萃取净化条件的优化选择合适的固相萃取柱是实现净化的关键 ꎮ 目前针对硝基咪唑类净化而使用的固相萃取柱包括 C 18 柱 HLB 柱和混合阳离子交换柱 (MCX)ꎮ 本试验比较了以上 3 种固相萃取柱的净化效果和回收率 ꎬ 发现 C 18 柱和 HLB 柱对 IPZ 的保留较好 ꎬ 高于 90%ꎬ 但对 MNZ 和 DMZ 的保留不足 40%ꎬ 且两种柱对 3 种药物的回收率均低于 60%ꎮ 而 MCX 柱对 3 种硝基咪唑类药物均有良好保留 ꎬ 回收率高于 90%ꎬ 且净化效果好 ꎬ 故本试验选用 MCX 柱净化样品 ꎮ 使用 MCX 柱进行样品基质中硝基咪唑类药物的净化时 ꎬ 淋洗液 1 采用 0.1 mol L -1 磷酸溶液 ꎬ 淋洗液 2 和洗脱液均为水 - 氨水 - 甲醇溶液 ꎮ 当采用文献报道的 0.1 mol L -1 磷酸溶液 -[ 水 + 氨水 + 甲醇 ( 体积比 )] -[ 水 + 氨水 + 甲醇 ( 体积比 )] 组合时 [10] ꎬ 甲硝唑的回收率不足 50%ꎮ 因此我们对此固相萃取条件进行了优化 ꎬ 采用 0.1 mol L -1 磷酸溶液 - 甲醇 -[ 水 + 氨水 + 甲醇 ( 体积比 )] 组合 ꎬ 即将淋洗液 2[ 水 + 氨水 + 甲醇 ( 体积比 )] 更换为甲醇 ꎮ 使用优化后的固相萃取条件净化时 ꎬ3 种药物的回收率均在 90% 以上 ꎮ 3.3 提取剂的选择文献报道的硝基咪唑类药物的提取剂有甲苯 [11] 乙腈 [12] 磷酸缓冲液(1 mol L -1 ꎬpH 2) [13] 和乙酸乙酯 ꎮ 本试验考察了 1 mol L -1 的磷酸缓冲液 (ph 2) 和乙酸乙酯 2 种提取剂的提取效率 ꎮ 发现用 1 mol L -1 磷酸缓冲液 (ph 2) 提取时回收率较低 ꎬ 不足 70%ꎻ 而乙酸乙酯提取效率高杂质少 ꎬ 且因硝基咪唑类药物对温度有一定敏感性 ꎬ 在氮气吹干步骤中过高的水浴温度 ( 应低于 40 ) 会影响药物回收 [14] ꎬ 试验中应采

5 第 5 期王延映 ꎬ 等 : 高效液相色谱法测定饲料中甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑 127 用低沸点的有机溶剂以尽可能多地回收目标化合物 ꎬ 所以本文选择乙酸乙酯作为提取剂 ꎮ 本试验建立了饲料中甲硝唑地美硝唑和异丙硝唑的高效液相色谱检测方法 ꎬ 该方法线性范围广样品处理方法简便灵敏度高 ꎬ 适合推广 ꎮ 参考文献 Reference: [1] Gentili AꎬPerret DꎬMarchese S. Liquid chromatography tandem mass spectrometry for performing confirmatory analysis of veterinary drugs in animal food products[ J]. TrAC Trends in Analytical Chemistryꎬ2005ꎬ24(7): [2] 吴永宁 ꎬ 邵兵 ꎬ 沈建忠. 兽药残留检测与监控技术 [M]. 北京 : 化学工业出版社 ꎬ2007 [ Wu Y NꎬShao BꎬShen J Z. The Detection and Monitoring Technologies in Residue of Veterinary Drug[ M]. Beijing:Chemical Industry Pressꎬ 2007( in Chinese)] [3] 刘波 ꎬ 黄为红 ꎬ 王金中. 气相色谱 - 电子捕获检测器同时测定硝基咪唑类药物 [J]. 分析科学学报 ꎬ2008ꎬ24(5): [ Liu BꎬHuang W HꎬWang J Z. Simultaneous determination of nitroimidazole by gas chromatography electron capture detector[ J]. Journal of Analytical Scienceꎬ2008ꎬ24(5): ( in Chinese with English abstract)] [ 4] Sun H WꎬWang F CꎬAi L F. Simultaneous determination of seven nitroimidazole residues in meat by using HPLC UV detection with solid phase extraction[ J]. Journal of Chromatography Bꎬ2007ꎬ857(2): [5] 尚彬如 ꎬ 陈义强 ꎬ 张丽英 ꎬ 等. 液相色谱 - 串联质谱测定饲料中 7 种硝基咪唑类药物 [J]. 中国畜牧杂志 ꎬ2011ꎬ47(13):66-70 [ Shang B RꎬChen Y QꎬZhang L Yꎬet al. Determination of 7 nitroimidazoles in feed by liquid chromatography tandem mass spectrometry[ J]. Chinese Journal of Animal Scienceꎬ2011ꎬ47(13):66-70( in Chinese with English abstract)] [6] Cronly MꎬBehan PꎬFoley Bꎬet al. Rapid confirmatory method for the determination of 11 nitroimidazoles in egg using liquid chromatography tandem mass spectrometry[ J]. Journal of Chromatography Aꎬ2009ꎬ1216(46): [7] Dousa M. Determination of dimetridazole in animal feeding stuffs and additive premixes by HPLC with UV detection. Interlaboratory comparison test of the method[ J]. Chemistry Listyꎬ2002ꎬ94(5): [8] 戴华 ꎬ 李拥军 ꎬ 袁智能 ꎬ 等. 猪饲料中甲硝唑二甲硝咪唑药物含量的 HPLC 法测定 [J]. 光谱实验室 ꎬ2004ꎬ21(2): [ Dai HꎬLi Y JꎬYuan Z Nꎬet al. Determination of metronidazole and dimetridazole in swine feed by HPLC method[j]. Chinese Journal of Spec troscopy Laboratoryꎬ2004ꎬ21(2): ( in Chinese with English abstract)] [9] 程林丽 ꎬ 张素霞 ꎬ 沈建忠 ꎬ 等.HPLC 法快速测定饲料中硝基咪唑类药物的研究 [J]. 安徽农业科学 ꎬ2008ꎬ36(5): [Cheng L LꎬZhang S XꎬShen J Zꎬet al.rapid determination of Nitroimidazole drugs in feeds by HPLC method[j]. Journal of Anhui Agricultural Sciencesꎬ2008ꎬ36(5): (in Chinese with English abstract)] [10] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. GB / T 饲料中硝基咪唑类药物的测定 : 液相色谱 - 串联质谱法 [ S]. 北京 : 中国标准出版社 ꎬ2008 [General Administration of Quality SupervisionꎬInspection and Quarantine of the People s Republic of China. GB / T LC MS / MS determination of nitroimidazoles in feeds[ S]. Beijing:China Standard Publishing Houseꎬ2008( in Chinese)] [11] Ho CꎬSin D WꎬWong Kꎬet al. Determination of dimetridazole and metronidazole in poultry and porcine tissues by gas chromatography electron capture negative ionization mass spectrometry[ J]. Analytica Chimica Actaꎬ2005ꎬ530(1):23-31 [12] Tölgyesi ꎬSharma V KꎬFekete Sꎬet al. Development of a rapid method for the determination and confirmation of nitroimidazoles in six matrices by fast liquid chromatography tandem mass spectrometry[ J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysisꎬ2012ꎬ64:40-48 [13] Capitan Vallvey LꎬAriza AꎬCheca Rꎬet al. Liquid chromatography mass spectrometry determination of six 5 nitroimidazoles in animal feedstuff[j]. Chromatographiaꎬ2007ꎬ65(5 / 6): [14] Hurtaud Pessel DꎬDelépine BꎬLaurentie M. Determination of four nitroimidazole residues in poultry meat by liquid chromatography mass spec trometry[ J]. Journal of Chromatography Aꎬ2000ꎬ882(1):89-98 责任编辑 : 周广礼

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.