标准与检测张钦 :UPLC-MS/MS 分析运动饮料中水溶性维生素 验室的推广可行性较高, 可为运动饮品中多种维生素营养同时定量提供技术支持和参考 加入 4.0 ml 水和 ml 氨水使其完全溶解后用甲酸调节 ph 值至 7.0 后定容至 1 ml 避光保存 准确吸取上述 10 种维生素标准溶液,

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1 年 8 月第 38 卷第 15 期 DOI: /j.issn 食品研究与开发 Food Research And Development 标准与检测 UPLC-MS/MS 分析运动饮料中水溶性维生素 张钦 ( 河南牧业经济学院, 河南郑州 ) 摘要 : 建立一种超高效液相色谱 - 串联质谱分析运动饮料中 V B1 V B2 V B5 V B6 V B7 V B9 烟酸 烟酰胺 V C 10 种水溶性维生素的方法 样品前处理用 10 % 乙醇沉淀提取后, 采用 Waters Atalantis T3 色谱柱 (2.1 mm 150 mm,3 μm) 分离, 以 0.1 % 甲酸 -1 % 甲醇为流动相的梯度洗脱模式下,10 种水溶性维生素在 1 ng /ml~1 00 ng/ml 浓度范围内线性良好, 相关系数 r 2 为 ~ , 检出限范围为 0.10 μg/kg ~11.5 μg/kg, 定量限范围为 0.35μg/kg ~38.0 μg/ kg, 加标回收率为 90.3 %~99.5 %, 相对标准偏差 (RSD) 为 2.0 %~3.6 % 关键词 : 超高效液相色谱 - 串联质谱 ; 运动饮料 ; 水溶性维生素 Determination of Water-soluble Vitamins in Sports Drink by UPLC-MS/MS ZHANG Qin (Henan University of Animal Husbantry and Economy, Zhengzhou , Henan,China) Abstract: The determination of 10 kinds of water-soluble vitamins, including vitamin B 1, vitamin B 2, vitamin B 5, vitamin B 6, vitamin B 7, vitamin B 9, vitamin B 12, niacin, nicotinamide, vitamin C in sports drink,was established by ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry.after the sample was treated with 10 % ethanol to precipitation extraction, the separation of target compound was performed on a Waters Atalantis T 3 chromatographic column (2.1 mm 150 mm, 3 μm) using 0.1 % formic acid-1 % methanol as mobile phase under gradient elution mode. The linear range of 10 kinds of water-soluble vitamins was in the range of 1 ng/ml~1 00 ng/ml with a correlation coefficient of The detection limit was 0.10 μg/kg μg/kg and the quantitative limit was 0.35 μg/kg-38.0 μg/kg. The recovery rate was 90.3 %-99.5 %, and the relative standard deviation(rsd) was 2.0 %-3.6 %. Key words: ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry(uhplc-ms/ms);sports drink; water-soluble vitamins 运动饮料是根据人体运动的生理消耗而配置的, 通过合理补充营养代谢物质使运动员抗疲劳能力提 [1-2] 高, 优化肌肉和肝糖原储备来提高运动能力 运动饮料中主要含有碳水化合物, 电解质, 维生素, 氨基酸等成分, 能补充人体所需的营养成分, 平衡新陈代谢 其中维生素是维持人体正常的物质代谢和某些特殊生理功能不可缺少的一类低分子有机化合物, 在人体 [3-5] 生长 代谢 发育过程中发挥着重要的作用 在我国 [6] 标准 GB 运动饮料 中, 仅针对 V C 硫胺素 核黄素这 3 种维生素作出了限量要求, 其他维生素 作者简介 : 张钦 (1975 ), 男 ( 汉 ), 副教授, 硕士, 主要从事学校体育和社会体育 未作出限量要求, 但是针对特殊人群的饮料, 有必要了解其中的维生素的种类以及含量, 以便保障人们科学 定量地摄入维生素 因此, 急需建立一种方便可行 可同时检测多种维生素的检测方法以满足实际工作需求 目前对水溶性维生素的测定方法有微生物法 分 [6-15] 光光度法以及高效液相色谱法等, 这些方法中一次只能对几种维生素进行测定, 测定时间长, 耗材消耗多 本研究利用质谱的多反应监测模式的选择性和特异性, 结合运动饮品的基质成分相对简单, 可简化提取过程的特点, 建立一种超高效液相色谱 - 串联质谱法可同时对运动饮料中 10 种水溶性维生素进行测定, 灵敏度高, 线性范围宽, 极大地提高了检测效率, 在实

2 标准与检测张钦 :UPLC-MS/MS 分析运动饮料中水溶性维生素 验室的推广可行性较高, 可为运动饮品中多种维生素营养同时定量提供技术支持和参考 加入 4.0 ml 水和 ml 氨水使其完全溶解后用甲酸调节 ph 值至 7.0 后定容至 1 ml 避光保存 准确吸取上述 10 种维生素标准溶液, 配成 1 mg/ml 1 材料与方法 的标准贮备液, 再稀释成浓度为 仪器与试剂 10 ng/ml 的系列混合标准溶液, 现配现用 Agilent 1290 超高效液相色谱仪 : 美国安捷伦公司 ;API4000 四极杆串联质谱仪 : 美国 AB 公司 样品前处理条件的优化运动饮料若直接上样测定水溶性维生素, 样品中 标准品 V B1 ( 叶酸 ) ( 氰钴胺 ) 烟酸 烟酰胺 V C : 美国 Sigma 公司 ; 乙腈 甲醇 ( 均为色谱纯 ): 美国 Fisher Scientific 公司 的干扰成分太多会影响测定, 故要对运动饮料中的一些干扰基质进行沉淀净化 本试验结合 10 种水溶性维生素都是水溶性物质的特性以及样品为运动饮料的特性, 比较了亚铁氰化钾溶液 (106 g/l)+ 乙酸锌溶 1.2 超高效液相色谱条件色谱柱 :Waters Atalantis T(2.1 3 mm 150 mm,3 μm); 液 (219 g/l) 混合液 10 % 甲醇 10 % 乙醇 10 % 乙腈等 4 种提取溶剂对 10 种目标物的提取效果 流速 :0.3 ml/min; 进样量 :10 μl; 柱温 :30 ; 流动相 A 为 0.1 % 甲酸水溶液,B 为 1 % 甲醇 ; 加标回收试验及样品测定以已知目标成分含量的运动饮料为基质, 加入 10 流动相梯度洗脱程序见表 1 种水溶性维生素的标准混合溶液, 选择优化后的前处 理条件和仪器条件, 上机检测, 计算回收率 表 1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program 时间 /min 流动相 A/% 流动相 B/% 试验方法 质谱条件的优化采用针泵连续进样的方式, 在正离子模式 (ESI+) 下, 先对各个目标物进行母离子全扫描, 然后对其子离子进行全扫描, 分别选定定性离子和定量离子, 并对喷雾电压 离子源温度 碰撞气 扫描停滞时间 去簇电压及碰撞电压等参数进行优化 标准曲线的制作 1)V B1 标准溶液 : 称取 10 mg 的 V B1 标准品, 加入 5.0 ml 水使其完全溶解后用甲酸调节 ph 值至 2.0 后定容至 1 ml 避光保存 2)V B2 标准溶液 : 称取 10 mg 的 V B2 标准品, 加入 4.0 ml 水和 ml 氨水使其完全溶解后定容至 1 ml 避光保存 3)V B5 V B6 烟酸 烟酰胺 V C 标准溶液 : 各称取 10 mg 的标准品, 加入水使其完全溶解后定容至 1 ml 避光保存 4)V B7 V B9 标准溶液 : 各称取 10 mg 的标准品, 结果与讨论 2.1 色谱柱的选择食品中水溶性维生素的检测比较常用的色谱柱 [16-18] 有 C 18 柱和 T 3 柱 因此, 本试验比较了 Waters BEH C 18 (2.1 mm 150 mm,3 μm) 和 Waters Atalantis T(2.1 3 mm 150 mm,3 μm) 这 2 款不同的色谱柱 结果发现水溶性维生素大多以离子形态存在于溶液中, 在 C 18 柱上的保留能力较弱, 目标物的总离子流图的分析效果不理想 ( 如图 1 所示 ); 但是在 T3 柱分析柱上由于其特殊键合力, 能与水溶性维生素形成氢键的结合力强弱不同, 在分离时更具有优势, 目标物的分离效果更好, 所以本试验选择 T 3 柱作为 10 种水溶性维生素的分析色谱柱 ( 如图 2 所示 ) 2.2 流动相体系的影响在选择 T 3 柱作为 10 种水溶性维生素的分析色谱柱的前提下, 参考相关文献 [19-23], 本试验对甲醇 - 水 甲醇 -0.1 % 甲酸以及 10 % 甲醇 -0.1 % 甲酸 3 种流动相进行比较, 分别对 10 种水溶性维生素的分析影响 结果发现 10 % 甲醇 -0.1 % 甲酸作为流动相,10 种水溶性维生素的分离效果最好, 目标峰的分离度高, 峰形尖锐, 基线温定 2.3 质谱条件的优化采用针泵连续进样的方式, 在正离子模式 (ESI+) 下, 分别对浓度为 100 ng/ml 的 V B1 ( 叶酸 )

3 174 张钦 :UPLC-MS/MS 分析运动饮料中水溶性维生素 标准与检测 电流强度 /mau 时间 /min Fig.1 图 1 使用 C 18 色谱柱 10 种维生素总离子流图 The total ion chromatograms of 10 kinds of water-soluble vitamins using the C 18 column 电流强度 /mau 时间 /min Fig.2 图 2 使用 HSS T 3 色谱柱 10 种维生素总离子流图 The total ion chromatograms of 10 kinds of water-soluble vitamins using a HSS T 3 column ( 氰钴胺 ) 烟酸 烟酰胺 V C 的标准溶液进行母离子全扫描, 确定其分子离子, 优化各母离子的锥孔电压 再在上述母离子的基础上, 对其子离子进行全扫描, 选择两组丰度最高的离子, 较高的作为定量离子, 次之的为定性离子, 并对喷雾电压 离子源温度 碰撞气 扫描停滞时间 去簇电压及碰撞电压等参数进行优化 优化后的质谱参数为 : 喷雾电压 V 离子源温度 400 氮气流量 20 L/min 扫描停滞时间 50 ms, 其他质谱参数见表 2 依照表 2 所设定质谱的条件, 以及超高效液相色谱的条件, 选择多反应监测模式 (Multiple reaction monitoring model,mrm) 进行检测,10 种水溶性维生素能在 10 min 内快速分离,10 种目标物的 MRM 图如 表 2 10 种水溶性维生素的多反应监测扫描模式的质谱参数 Table 2 Mass spectrometric parameters for 10 kinds of watersoluble vitamins 目标化合物 母离子 子离子 去簇电压 /V 碰撞电压 /V V B1 ( 硫胺素 ) * V B2 ( 核黄素 ) * V B5 ( 泛酸 ) 22 9* V B6 ( 吡哆醇 ) * V B7 ( 生物素 ) *

4 标准与检测 续表 2 Continue table 2 10 种水溶性维生素的多反应监测扫描模式的质谱参数 Mass spectrometric parameters for 10 kinds of water-soluble vitamins 目标化合物 母离子 子离子 去簇电压 /V 碰撞电压 /V V B9 ( 叶酸 ) * ( 氰钴胺 ) * 烟酸 * 烟酰胺 * V C * 注 : * 为定量离子 > >144.0 Ratio=27.6(10 %) (a) > >97.0 Ratio=11.6(10 %) (d) > >359.0 Ratio=19.3(96.5 %) (g) 张钦 :UPLC-MS/MS 分析运动饮料中水溶性维生素 (h) 图 3 所示 > >172.0 Ratio=46.3(99.2 %) (b) 17-> >134.0 Ratio=81.7(99.6 %) (e) > >14 Ratio=93.1(102.2 %) 2.4 标准曲线的制作为了验证 10 种水溶性维生素在优化好的仪器条件中的线性关系, 配制了浓度为 ng/ml 的系列混合标准溶液上机进行检测 试验结果表明,10 种水溶性维生素在 1 ng/ml~ 1 00 ng/ml 内均具有良好的线性关系 (r 2 >0.999), 并得到 10 种目标组分的检出限范围为 0.10 μg/kg~ 11.5 μg/kg, 定量限范围为 0.35 μg/kg ~38.0 μg/kg, 结果见表 提取溶剂的选择在对 V B1 ( 叶酸 ) ( 氰钴胺 ) 烟酸 烟酰胺 V C 等 10 种目标物提取的过程中, 目标成 > >78.0 Ratio=74.3(99.9 %) (j) a.v B1 ( 硫胺素 );b.v B2 ( 核黄素 );c. V B5 ( 泛酸 );d. V B6 ( 吡哆醇 );e.v B7 ( 生物素 );f.v B9 ( 叶酸 );g. ( 氰钴胺 );h. 烟酸 ;i. 烟酰胺 ;j.v C 22->9. 22->184.0 Ratio=2.5(102.2 %) (c) > >176.0 Ratio=34.6(99.5 %) (f) > >53.0 Ratio=61.4(99.9 %) (i) Fig.3 图 3 10 种水溶性维生素的 MRM 图 MRM chromatogram of 10 kinds of water-soluble vitamins

5 176 张钦 :UPLC-MS/MS 分析运动饮料中水溶性维生素标准与检测 表 3 10 种水溶性维生素的保留时间 标准曲线 相关系数 检出限与定量限 Table 3 Retention time, standard curve, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit of 10 kinds of water-soluble vitamins 目标化合物 保留时间 /min 线性回归方程 r 2 检出限 /(μg/kg) 定量限 /(μg/kg) V B1 ( 硫胺素 ) 65 Y= X V B2 ( 核黄素 ) Y=16 004X V B5 ( 泛酸 ) Y=12 036X V B6 ( 吡哆醇 ) Y= X V B7 ( 生物素 ) Y=16 850X V B9 ( 叶酸 ) Y=40 556X ( 氰钴胺 ) Y=2 642X 烟酸 Y=70 029X 烟酰胺 Y=81 345X V C Y=3 955X 分易被破坏以及样品中沉淀所吸附, 所以在前处理过程中既要考虑要保护好目标成分也要避免目标物被 [24-28] 沉淀所吸附 本试验参考相关文献, 结合 10 种水溶性维生素都是水溶性物质的特性以及样品为运动饮料的特性, 比较了亚铁氰化钾溶液 (106 g/l)+ 乙酸锌溶液 (219 g/l) 混合液 10 % 甲醇 10 % 乙醇 10 % 乙腈等 4 种提取溶剂对 10 种目标物的提取效果, 见图 混合沉淀粉 10 % 甲醇 10 % 乙醇 10 % 乙腈图 4 提取液对 10 种水溶性维生素平均回收率的影响 平均回收率 /% Fig.4 The effect of extract solution on the average recovery rate for 10 kinds of water-soluble vitamins 结果如图 4 所示,4 种提取溶剂中,10 % 乙腈为提取溶剂时, 运动饮料中的维生素回收率最高, 其次为 10 % 乙醇 10 % 甲醇 ; 亚铁氰化钾溶液 (106 g/l)+ 乙酸锌溶液 (219 g/l) 混合液为提取溶剂时, 样品中的基质沉淀效果明显, 但是维生素的回收率不高, 可能是混合液对运动饮料中的水溶性的维生素有破坏作用 ; 其中 10 % 乙醇提取率虽不及 10 % 乙腈的提取效果好, 但是考虑到乙腈的毒性比乙醇大, 以及成本问题, 所以本试验还是选择 10 % 乙醇作为运动饮料的提取溶剂 2.6 加标回收与相对偏差在前处理条件与仪器条件下, 利用已测定 10 种维生素含量的运动饮料进行加标回收率试验, 在分别添 加 mg/kg 3 个梯度浓度的标准混合溶液, 每个浓度平行测定 5 次, 测定结果见表 4 由表 4 可见,10 种水溶性维生素的加标回收率为 90.3 %~99.5 %, 相对标准偏差 (RSD) 为 2.0 %~3.6 %, 表明本试验所建立的方法具有可靠的准确度和精密度 3 结论 表 4 方法的回收率及相对标准偏差 (n=5) Table 4 Recoveries and relative standard deviations(rsd)of the method(n=5) 维生素 5 mg/kg 0.1 mg/kg mg/kg 回收率 /% RSD/% 回收率 /% RSD/% 回收率 /% RSD/% V B1 ( 硫胺素 ) V B2 ( 核黄素 ) V B5 ( 泛酸 ) V B6 ( 吡哆醇 ) V B7 ( 生物素 ) V B9 ( 叶酸 ) ( 氰钴胺 ) 烟酸 烟酰胺 V C 建立一种超高效液相色谱 - 串联质谱检测运动饮料中 V B1 ( 叶酸 ) ( 氰钴胺 ) 烟酸 烟酰胺 V C 10 种水溶性维生素分析的方法 结果表明, 通过优化后的质谱条件, 在 MRM 扫描模式下,10 种水溶性

6 标准与检测张钦 :UPLC-MS/MS 分析运动饮料中水溶性维生素 维生素组分能在 10 min 实现快速分离检测 样品经过 10 % 乙醇提取后, 可有效去除运动饮料中的复杂基质, 可实现对目标物质的净化, 能准确快速有效地检测运动饮料中 V B1 ( 叶酸 ) ( 氰钴胺 ) 烟酸 烟酰胺 VC 10 种水溶性维生素 本方法具有快速 简单 准确 灵敏等特点, 可对较宽浓度范围内的多种维生素进行同步分析, 有助于提高食品检测实验室的分析效率, 降低成本, 为运动饮料中水溶性维生素的测定提供营养价值参考 参考文献 : [1] 蒋俊树, 赵彬. 高效液相色谱法测定能量饮料中多种水溶性维生素 [J]. 食品科学,2008, 29(12): [2] 王荣艳, 贾丽, 钱春燕.HPLC-PDA 法同时测定功能性饮料中 9 种水溶性维生素 [J]. 现代科学仪器,2010, 8(4): [3] 蒲明清, 戴舒春, 张连龙, 等. 超高效液相色谱法测定保健食品中的多种水溶性维生素 [J]. 现代食品科技,2012,28(7): [4] ASLAM J, KHAN S H, KHAN S A. Quantification of water soluble vitamins in six date palm (Phoenix dactylifera L.) cultivar s fruits growing in Dubai, United Arab Emirates, through high performance liquid chromatography[j]. Journal of Saudi Chemical Society, 2013, 17(1): 9-16 [5] BEITANE I, CIPROVICA I. The study of added prebiotics on B group vitamins concentration during milk fermentation[j]. AC Romanian Biotechnology Letters, 2011, 16(6): [6] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会.GB/T 运动饮料 [S]. 北京 : 中国标准出版社,2008 [7] 储小军, 陶保华, 赖世云, 等. 固相萃取 - 二维液相色谱法测定婴幼儿配方食品中的维生素 B 12 [J]. 浙江大学学报 ( 农业与生命科学版 ),2013(2): [8] 张鹏, 朱姜, 周元元, 等. 高效液相色谱 - 串联质谱法测定保健食品中的维生素 A D E[J]. 中国食品卫生杂志,2016,28(3): [9] 聂启兴, 冯蕾, 张媛媛, 等. 高效液相色谱法同时测定发酵前后果蔬中 4 种水溶性维生素 [J]. 食品科学,2015,36(20): [10] 韩秀梅, 祖述春. HPLC 法测定复合维生素 B 片中维生素 B 1,B 2,B 6 的含量 [J]. 中国药事, 2012, 26(8): [11] 陈新, 张风, 李健. 反相离子对高效液相色谱法测定啤酒中的 B 族 177 维生素 [J]. 酿酒科技, 2015(12): [12] 叶翠平, 谭兆平, 区硕俊. 反相离子色谱法同时检测皮炎软膏中的 6 种水溶性维生素成分含量 [J]. 当代化工,2016(8): [13] CHAMPAGNE C P, TOMPKINS T A, BUCKLEY N D, et al.effect of fermentation by pure and mixed cultures of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus helveticus on isoflavone and B-vitamin content of a fermented soy beverage[j]. Food Microbiology, 2010, 27 (7): [14] 任丹丹, 谢云峰, 刘佳佳, 等. 高效液相色谱法同时测定食品中 9 种水溶性维生素 [J]. 食品科学 2014,35(12): [15] 张志清, 白琦, 湛珺雯. RP-HPLC 法测定功能性饮料水溶性维生素含量 [J]. 食品科学, 2010, 31(14): [16] 周围, 王波, 刘倩倩, 等. 超高效合相色谱法同时测定复合维生素片中 11 种脂溶性维生素及其衍生物 [J]. 分析化学, 2015, 43(1): [17] 张榕杰, 苏永恒, 王爱月. 超高效液相色谱法同时测定维生素强化食品中多种水溶性维生素 [J]. 中国卫生工程学, 2008,7(1): [18] 贺利民, 吕岱竹, 苏贻娟. 高效液相色谱法同时测定多种水溶性维生素 [J]. 海南大学学报 ( 自然科学版 ),2004, 22(1): [19] 郭玉华, 郁有祝. 高效液相色谱法测定茶叶中五种水溶性维生素 [J]. 食品研究与开发, 2012(8): [20] 李克, 王华娟, 潘朝晖, 等. 离子对反相高效液相色谱法同时测定复合维生素片中 4 种水溶性维生素 [J]. 色谱, 2013, 21(1): [21] 黄力, 张宝川.HPLC 法测定多维片中的水溶性维生素 [J]. 中国药事,2007, 21(4): [22] 高旭, 李淑娟, 安娟, 等. 高效液相色谱法同时测定食品中 8 种水溶性维生素 [J]. 中国医药指南, 2008, 6(19): [23] 张晓娜, 校瑞, 牛家华, 等. HPLC 同时测定维生素 B 片中 4 种水溶性维生素的含量 [J]. 河南大学学报 ( 自然科学版 ), 2016(9): [24] 荣琳, 邵丽华, 王淑娥, 等. HPLC- 二极管阵列检测器同时测定保健品中 7 种水溶性维生素 [J]. 卫生研究, 2009, 38(5): [25] 白靖, 向柏, 申磊, 等. HPLC 法同时测定复合维生素口服液中 4 种水溶性维生素的含量 [J]. 中国药房, 2011, 22(29): [26] 李强, 李挥, 庞坤, 等. 功能性饮料中 11 种水溶性维生素的高通量检测技术研究 [J]. 河北省科学院学报, 2012, 29(3): [27] 宋萍萍, 刘书慧. 反相高效液相色谱法测定果醋中的 8 种维生素 [J]. 食品科学,2012,33(12): [28] 华晶忠, 刘笑笑, 武巍, 等. 苜蓿中维生素 C 含量测定及变化规律 [J]. 食品研究与开发, 2016(1): 收稿日期 :

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