液相色谱条件系统 : ACQUITY UPLC H-Class Bio 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH Glycan 色谱柱 1.7 µm, mm 柱温 : 40 流动相 A: 50 mm 甲酸铵 (ph 4.4) 流动相 B: 乙腈注 : 本实验使用了 LC/MS 级别

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1 [ 应用纪要 ] N- 链接寡糖的表征与分析 : 将精确质量 标准 GU 值和功能强大的 UNIFI 软件有机结合, 更准确地进行寡糖结构确证 Ying Qing Yu 沃特世公司 应用优势沃特世 UNIFI 生物制药平台化方案以 UPLC( 超高效液相色谱 )- FLR( 荧光检测器 )- QTof MS ( 串联四极杆飞行时间质谱仪器 ) 为核心, 是生物制药领域最优的糖基化分析表征工具, 涵盖从药物研发到 QC 检测的各个环节 此方案可作为常规分析手段用于 N- 链接寡糖分析 : 保留时间经校准后, 使用相应的荧光和质谱检测数据和基于保留时间的糖数据, 对 N- 链接寡糖结构进行分析 这种方法适用于单个蛋白质的糖型分析, 也适用于多批次生物药以及生物仿制药与创新药的比较性研究 沃特世解决方案 UNIFI 生物制药平台化方案 ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统 ACQUITY UPLC BEH Glycan 色谱柱 ACQUITY UPLC FLR 检测器 Xevo G2-S QTof GlycoWorks 样品制备试剂盒沃特世分析标准品与试剂 :2-AB 标记 Dextran Ladder 标准品和仪器性能测试标准品 简介沃特世 UNIFI 生物制药平台化方案以业内领先的 UPLC ( 超高效液相色谱 ) 生物分离色谱柱和仪器系统为核心, 结合光学和质谱检测, 能对蛋白质药物进行全面的结构分析和表征 UNIFI 科学信息系统基于法规依从性架构, 将数据采集 数据处理 生物信息学以及报告功能自动整合在一起 本应用纪要详细介绍了一个用于蛋白质游离寡糖分析的新流程 利用最新版本的 UNIFI 生物制药平台化方案, 通过使用荧光检测和精确质量对糖结构进行分析 以寡糖生物仿制药与创新药的荧光标记 (2-AB) N- 链接寡糖分析的比较性研究为例, 来展示此流程在寡糖分析的实际应用 本研究中所使用的分析平台由 ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统 ACQUITY UPLC 荧光检测器和 Xevo G2-S QTof 串联四极杆飞行时间质谱仪组成 UNIFI 寡糖方案基于校正的保留时间 ( 以葡萄糖单位表示, 也称为 GU) 和沃特世寡糖 GU 数据库中的精确质量数 ( 整合于 UNIFI 1.7 软件及更高版本 ), 实现了对 2-AB 标记的游离 N- 链接寡糖进行确证和表征分析 经证实, 精确质量数信息对进一步确认糖结构非常有用, 因为在实际分析工作中, 有时一个峰的 GU 值会对应数据库中多个寡糖结构 UNIFI 生物制药平台化方案还可用于采集和处理其它如寡糖 DDA MS/MS 数据, 或者通过使用外切糖苷酶进行寡糖序列研究等, 这些补充性数据信息能够帮助对糖结构进行充分寡糖确证, 相关的具体细节我们会在近期的应用纪要中加以说明 关键词 生物仿制药, 依那西普, 沃特世寡糖 GU 数 据库, 葡萄糖单位 1

2 液相色谱条件系统 : ACQUITY UPLC H-Class Bio 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH Glycan 色谱柱 1.7 µm, mm 柱温 : 40 流动相 A: 50 mm 甲酸铵 (ph 4.4) 流动相 B: 乙腈注 : 本实验使用了 LC/MS 级别的水和乙腈 本研究中, 我们展示了寡糖分析平台的多项特点 : 通过 FLR 和 MS 数据通道的自动采集和时间校准, 分析工作流程从数据采集无缝推进到数据处理, 从而形成常规 可重复的数据处理和报告方法 依据经精确质量数确证的保留时间 ( 以 GU 表示 ), 沃特世多聚糖 GU 数据库实现了多聚糖结构的可靠表征分析 通过生成 N- 链接寡糖的定量 ( 相对百分比 ) 和定性分析报告, 这一精简的工作流程让科学家能够轻松传达关键信息, 而不需要将信息导出至外部数据包, 从源头减少了数据处理出错的几率 因此, 实验室符合法规依从性和数据完整性能力得以增强 质谱条件 MS 系统 : Xevo G2-S QTof MS 模式 : ESI+, 灵敏度模式 毛细管电压 : 3.0 kv 锥孔电压 : 80 V 源温度 : 120 脱溶剂气温度 : 300 脱溶剂气流速 : 800 L/h 扫描时间 : 0.5 s 间隔时间 : 20 s ACQUITY UPLC FLR 检测器参数设置 数据采集 处理和报告 UNIFI 科学信息系统,1.7 版本 UPLC HILIC 梯度表 2

3 样品制备和保留时间校正的 GU 值 2-AB 标记的葡萄糖均聚物 (Dextran Ladder 样 ) 和寡糖分析仪器性能测试标准品由沃特世公司提供 使用 Dextran Ladder 标准品对寡糖的保留时间进行校正和归一化标记, 以实现日间 系统间和实验室间的卓越重现性 同时, 通过沃特世寡糖 GU 数据库的常规使用可以实现主要寡糖的结构鉴定 选取聚合度为 4 至 12 个葡萄糖单位的色谱峰, 其保留时间用于生成葡萄糖单位 (GU) 与保留时间的五阶导数拟合的校准曲线 利用校正后的 GU 值对实验样品峰进行自动分配并生成报告 寡糖分析仪器性能测试标准品包括一组双天线寡糖, 其中包含高甘露糖和唾液酸化糖, 是治疗性单克隆抗体中典型的糖型 使用沃特世 GlycoWorks 样品制备试剂盒从依那西普的生物创新药和候选生物仿制药中制备出 2-AB 标记的游离 N- 链接寡糖 请参照试剂盒说明书中的详细信息进行操作 荧光和 MS 图谱校正 在仪器控制台页面中输入实验数据, 在数据采集过程中对荧光和 MS 图谱进行自动校正 时间补 偿值取决于管路 (FLR 和 MS 入口之间连接部分的管线 ) 长度和流速, 因不同系统而异 重要设置在 UNIFI 处理方法中, 对 2-AB 标记的 Dextran Ladder 标准品样进行保留时间校正设定 ( 对于单克隆抗体的寡糖样品, 常用的校正范围为 GU 4-12) 五阶导数拟合和三次样条曲线拟合都适用于保留时间校正 3

4 结果与讨论本研究中, 我们提供了使用 UNIFI 生物制药平台化方案进行寡糖 UPLC/FLR/MS 分析工作流程 ( 图 1) 的具体细节, 包括单一寡糖样品的有效分析和复杂寡糖的比较性研究中所用到的分析方法 数据查看工作流程以及报告方案的详细信息 数据采集 通过科学数据库检索进行数据处理和确证 报告生成 图 1. 使用 FLR 与 MS 确证进行寡糖检测工作流程 第 1 步 : 数据采集使用配备 FLR 和 MS 检测器 ( 后者采用 Xevo G2-S QTof MS) 的 ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统对荧光标记寡糖进行分离 将 ACQUITY UPLC FLR 检测器直接与 QTof MS 相连, 不对流路做任何改变 FLR 与 MS 图谱将按上述操作对保留时间进行自动匹配 图 2 给出了 UPLC/FLR/QTof MS 色谱图的一个示例 图 2. 2-AB 标记寡糖标准品 ( 寡糖分析仪器性能测试标准品,GPTS) 的 UPLC/FLR/MS 色谱图 上图为 FLR 色谱图, 下图为 BPI MS 色谱图 在数据采集过程中以 FLR 对 BPI MS 迹线进行时间校正 4

5 以 2-AB 标记的 Dextran Ladder 标准品作为保留时间校正标准品 通常, 目标样品就像三明治夹在多个 Dextran Ladder 标样之间进样 通过全部标准品的平均值自动计算保留时间与葡萄糖单元值之间的五阶导数拟合曲线或三次样条曲线, 随后该曲线被用于寡糖实验色谱图的数据处理过程 保留时间校正的好处在于可以调整保留时间的变化, 从而适应任何流动相配制 仪器配置的变化以及用户和实验室的其它可变因素 图 3 显示出了 Dextran Ladder 标样的校正结果 图 3. Dextran Ladder 标样校准示例 上方色谱图显示了葡聚糖校准曲线标准品四次进样的叠加图, 分别采集于两次样品运行前后 下图为由这些进样生成的五阶导数拟合曲线 R 2 ( ) 和重叠的数据点显示出这些进样间极佳的保留时间相关性 5

6 第 2 步 : 数据处理和科学数据库检索沃特世寡糖 GU 数据库包含来自多种不同糖蛋白如人血清中的 2AB 标记 N- 链接寡糖的保留时间 ( 以 GU 表示 ) 和质量数信息 现有寡糖的种类数量为 300 每种寡糖都有相应的 GU 值 分子式 寡糖结构和单一同位素质量数 科研人员可在数据库中对某种寡糖或特定类别的寡糖进行检索 图 4 显示了一个例子 所选试剂为 2- 氨基苯甲酰胺 (2-AB), 因为沃特世寡糖 GU 数据库中的实验 GU 值取决于 2AB 标记蛋白质 搜索标准功能可作为过滤器, 通过限制多种类型寡糖应用属性来缩小寡糖 GU 检索范围 沃特世寡糖 GU 数据库是 UNIFI 生物制药平台解决方案中附带的默认数据库, 但用户也可以自己创建 GU 数据库用以替代或补充沃特世数据库 图 4. 沃特世寡糖 GU 数据库的数据库检索设置 6

7 沃特世寡糖 GU 数据库 UNIFI 软件的自动化数据处理包括 GU 值的计算 ( 用于 FLR 峰积分 ), 相关峰的精确质量数的测定, 以及由此产生的科学数据库检索 具体操作遵循以下规则 : 1. 在 GU 值数据库范围内检索所有实验糖苷的 GU 值 ( 实验数据与数据库比对 ) 都必须有相应的 FLR 峰 2. 在所有可能配型过程中, 已确证精确质量数的寡糖优先进行匹配, 与搜索结果最接近的 GU 值通常作为默认备选 3. 由于 FLR 比质谱更为灵敏, 因此, 那些含量比较低的寡糖可能会有良好的 FLR 信号, 却没有或者只有很低的 MS 信号 对于这种情况下的寡糖只能根据数据库中 GU 值的差异来确定糖型 4. 对于共流出或具有相同 GU 值的寡糖, 如具有最高丰度的 ( 根据质谱信号 ) 可得到默认分配 而较低丰度的寡糖 ( 如果存在 ) 仍作为备选分配 ( 经质量数确证 ) 5. 当在数据库中按照给定的搜索条件未能找到 GU 值时, 这样的峰将会被标记为 未覆盖 组分 这些峰的确证还需进一步的研究, 一旦结构确证后, 便可创建一个新的数据库条目 6. 互为结构异构体的寡糖往往具有相近的 GU 值和相同的质量数 在这种情况下, 匹配的异构体将会被标记为质量数已确证 ; 而具有最接近 GU 值的异构体将会突出显示为首要分配任务 但可能还需要进行糖苷酶处理或 MS/MS 分析以便直接分配 图 5 是 UNIFI 软件的查看页面的截屏, 其中详细列出了经处理的数据库搜索结果 FLR 峰均被积分和匹配最佳的糖型 操作人员可在查阅搜索结果后, 将某个分配更改为另一个具有相似 GU 值的寡糖 软件的审计追踪功能将对这一变化进行追踪 图 5. 沃特世寡糖 GU 数据库搜索结果的查阅窗口 左侧为经处理的 FLR 色谱图和突出显示的一个寡糖的 XIC MS 图 ; 右侧为所选寡糖峰的数据库搜索结果 图中列出了诸如结构 ( 采用连接分配 ) 可能的 GU 值 可能的质量数 GU 差值和质量数差值等信息 此外, 如果观察到任何备选寡糖的质量数, 则图中 已确证质量数 框会被选中 7

8 应用实例 : 使用 UNIFI 进行生物治疗创新药和候选生物仿制药的 N- 链接寡糖谱图比对依那西普 ( 商品名为 Enbrel) 是一种生物治疗单克隆抗体融合蛋白质, 用于治疗类风湿性关节炎和其它自身免疫疾病 ; 此药是现今市场上收益最高的生物治疗药物之一 许多生物科技公司正积极努力地研发依那西普的生物仿制药 本研究中, 我们通过 UNIFI 寡糖应用解决方案及其 FLR/MS 工作流程, 对该生物创新药和候选生物 仿制药的 2AB 标记 N- 寡糖谱图进行了对比 我们观察到生物仿制药和创新药的 N- 寡糖谱图高度相 似, 但还是可以检测到一些不同点 例如, 在候选生物仿制药中观察到丰度更高的高甘露糖结构, 包括一些仅在候选生物仿制药中才能检测到的扩展甘露糖 ( 如 Man 6 和 Man 8) 结构 ( 图 6) 我们还观察到候选生物仿制药中含有相对丰富 ( 高于 0.1%) 的寡糖,F(6)A2[6]BG(4)1 F(6)A2[3]G(4)1S(3)1 F(6)A3G(4)3S(3,3)2 和 A2G(4)2S(6)1, 但在依那西普中, 这些唾液酸化寡糖未被观察到或含量低于 0.1% N- 链接寡糖表征差别很可能是由细胞培养条件的差异造成 若要确定这些差异对候选生物仿制 药安全性或疗效的影响, 则需更多的生物检测和临床经验 依那西普 生物创新药 生物仿制药 生物仿制药 生物创新药 生物仿制药 图 6. A) 依那西普的生物创新药和候选生物仿制药的 N- 寡糖叠加色谱图 蓝色箭头指出了仅在候选生物仿制药中观察到的 Man8 寡糖 B) 沃特世寡糖 GU 数据库搜索结果表明图 (A) 中标记的峰为 Man8 标记峰 Man8 Man8 的 XIC 的数据库搜索结果提供了更多的证据, 证明了色谱图窗口中显示的是正确的结构分配 8

9 应用报告 UNIFI 软件中包含了针对特定应用的报告模板 默认的寡糖检测报告模板能提供详细的单个样品及对比数据结果 使用者也可方便地对模板进行修改以满足特定的寡糖分析项目的报告需求 以依那西普的生物创新药 / 生物仿制药中的 N- 链接寡糖分析为例, 图 7 给出了一份常规的寡糖分 析报告所提供的各类信息截图 样品列表 UPLC/FLR/MS 色谱图以及组分表 保留时间校正曲线 汇总表生物创新药 / 生物仿制药 科学数据库检索结果 图 7. 依那西普生物创新药 / 生物仿制药寡糖的 N- 链接寡糖分析和对比的 UNIFI 报告示例 其中包括各种关键信息, 例如样品列表 保留时间校正曲线 每一个检测出的寡糖及相应的科学数据库搜索结果 生物创新药 / 生物仿制药 N- 链接寡糖的相对百分比含量汇总表 UPLC/FLR/MS 色谱图以及组分表 报告模板可进行自定义, 以符合不同分析类型的需求 9

10 结论相较于大多数实验室的常规分析, 如完整蛋白或肽图分析等技术, 寡糖的表征仍然是生物治疗药物表征中的一项挑战 UNIFI 寡糖应用解决方案中增加了寡糖 UPLC/FLR/MS 工作流程, 采用了基于实验数据的沃特世寡糖 GU 数据库, 通过单个寡糖分析结果的快速采集 查看和传送, 以及大量寡糖的对比性研究分析, 满足了用户对寡糖结构分配的合规性 自动化和高度可靠性需求 UNIFI 生物制药平台解决方案的其它功能, 例如寡糖 / 糖肽 DDA MS/MS 分析和执行外切糖苷酶阵列的能力, 以及不断完善新的工作流程, 提供了额外的正交结果, 使得最为复杂的生物治疗糖蛋白表征也能得以实现 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters,The Science of What s Possible,ACQUITY UPLC,UPLC,Xevo 和 UNIFI 是沃特世公司的注册商标 其他所有商标均归各自的拥有者所有 2013 年沃特世公司 印制于中国 2013 年 11 月 ZH AG-PDF 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

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