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1 呋喃唑酮代谢物单克隆抗体和胶体金免疫层析试纸条的研制李春生 1, 刘静静 1, 杜顺丰 2, 武孝丽 2, 曹秀梅 2, 吴萌 1 1, 张娜 (1. 河北省科学院生物研究所, 河北石家庄 ) (2. 秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心, 河北秦皇岛 ) 摘要 : 本研究旨在建立一种快速检测呋喃唑酮代谢物残留的方法试验用呋喃唑酮代谢物的衍生物 (CPAOZ) 与牛血清白蛋白 (BSA) 的偶联物免疫小鼠, 利用单克隆抗体技术制备杂交瘤细胞, 用间接 ELISA 和间接竞争 ELISA 法对阳性克隆进行筛选单克隆细胞株诱生腹水后, 经纯化即为单克隆抗体, 用于胶体金标记, 制备呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条融合后得到 2 株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株, 其中 4G3 纯化后的抗体效价达到 1:100 万, 对 CPAOZ 的 50% 抑制质量浓度 (IC 50 ) 为 1.7 μg/l, 亲和常数 Ka= L/mol 该抗体制备的胶体金试纸条的检测限为 4 μg/l, 与其他 3 种硝基呋喃代谢物的衍生物 CPAHD CPSEM 和 CPAMOZ 均不存在交叉反应, 对样品的检测与高效液相色谱结果一致本研究制备了抗呋喃唑酮代谢物特异性单克隆抗体, 并研制了以单抗为基础的胶体金免疫层析试纸条, 能够实现呋喃唑酮代谢物残留的快速灵敏的检测关键词 : 呋喃唑酮代谢物 ; 单克隆抗体 ; 胶体金免疫层析试纸条文章篇号 : (2017) DOI: /j.mfst Preparation of Monoclonal Antibody and Colloidal Gold Immunochromatographic Test Strip against Furazolidone Metabolites LI Chun-sheng 1, LIU Jing-jing 1, DU Shun-feng 2, WU Xiao-li 2, CAO Xiu-mei 2, WU Meng 1, ZHANG Na 1 (1.Biology Institute, Hebei Academy of Sciences, Shijiazhuang , China) (2.Qinhuangdao City Agricultural Products Quality and Safety Supervision and Inspection Center, Qinhuangdao , China) Abstract: The aim of the study was to establish a method for the rapid detection of the furazolidone metabolites. A conjugate of the derivatives of furazolidone metabolites and bovine serum albumin (BSA) was used to immunize mice. The cells were prepared by monoclonal antibody technology, and the positive clones were screened by indirect ELISA and icelisa. Monoclonal antibodies purified from ascitic fluid were used in the colloidal gold tag and for the preparation of the colloidal gold immunochromatographic test strip. Two cell types were obtained, which could stably secrete antibodies. The titer of the purified antibody named 4G3 was 1:10 6, and the median inhibitory concentration (IC 50 ) was 1.7 μg/l with affinity constant Ka= L/mol. The results showed that the detection using the test strips was limited to four μg/l, there were no cross reactions between CPAHD, CPSEM, and CPAMOZ, and the test results of the samples were consistent with the results of HPLC. In this study, specific monoclonal antibodies against CPAOZ were prepared, and colloidal gold immunochromatographic test strips were developed based on the antibodies, which could achieve rapid and sensitive detection of furazolidone metabolite residues. Key words: furazolidone metabolites; monoclonal antibody; colloidal gold immunochromatographic test paper 呋喃唑酮 (Furazolidone,FZD), 又名痢特灵, 是一种硝基呋喃类药物, 对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌有抑制作用, 作用于微生物酶系统, 抑制乙酰辅酶 A, 干扰微生物糖代谢, 从而起到抑菌作用, 广泛用于水产和禽类, 用以治疗菌痢肠炎和球虫等, 以及养殖鱼的疥疮赤鳍病和溃疡等 [1] 因其杀菌能力强, 收稿日期 : 基金项目 : 河北省科技支撑计划项目 ( D) 作者简介 : 李春生 (1981-), 男, 副研究员, 研究方向 : 免疫生物化学抗菌谱广, 不易产生耐药性, 口服吸收迅速, 与其他抗生素无交叉耐药性等优点, 曾广泛应用于临床 [2] 呋喃唑酮具有很强的副作用, 而且在动物体内很快就代谢为 3- 氨基 -2- 唑烷酮 (AOZ),AOZ 在胃酸条件下直接代谢成为具有强烈致突变性和致癌性的 β- 羟乙基肼, 对人体健康与生态平衡具有潜在威胁 [3~5] 目前, 欧盟美国日本及中国等规定禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素我国国务院食品安全办等部门于 2016 年 8 月至 2017 年 12 月, 在全国范围内集中开 326

2 展畜禽水产品抗生素禁用化合物及兽药残留超标专项整治行动, 其中水产品环节就以硝基呋喃和孔雀石绿为重点, 严厉打击硝基呋喃类药物的非法使用生产和销售 [15] 呋喃唑酮原药在动物体内的代谢分解迅速, 稳定性只有数小时, 很难检出, 但其代谢物 AOZ 与蛋白质结合而相当稳定, 在体内可残留数周 [6,7] 因此, 可以通过检测组织中的 AOZ 水平达到检测动物源性食品中呋喃唑酮残留的目的目前有关呋喃唑酮残留的检测技术主要有高效液相色谱法 (HPLC) 液相色谱- 质谱联用法 (LC-MS) 液相色谱串联质谱法 (LC-MS/MS) [8] 及免疫分析技术, 前 3 种方法灵敏准确, 但操作繁琐, 对实验设备和技术要求较高, 不适合大批量样品的快速检测 [10,11] 免疫分析方法包括酶联免疫吸附法(ELISA) 和胶体金免疫层析法 (GICA), 具有灵敏度高特异性好成本低和操作方便等特点, 适于大批量样品筛选 [12] GICA 作为一种新的免疫学检测方法, 既有免疫学方法的特异性, 又有简便快速不需仪器的特点, 其在医学动植物检疫食品检测等多领域已得到了广泛应用 [13] [9] 周克楠等获得了 1 株特异性较好的抗 CPAOZ 单抗, 并以此单抗制备了胶体金免疫层析试纸条, 最低检测限为 7.5 μg/l 开发呋喃唑酮胶体金试纸条有助于 AOZ 残留快速准确的检测, 有效遏制其在水产品中的违规使用及残留超标问题, 提高人民群众水产品餐桌质量安全水平本研究应用单克隆抗体技术筛选出阳性细胞株, 获得了具有高特异性的 CPAOZ 单抗, 并在此基础上制备了其胶体金免疫层析试纸条, 用于样品检测能获得与仪器法一致的结果, 为 AOZ 残留的免疫学检测方法的建立奠定了基础 1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器 HAT HT 弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂 PEG4000 免疫球蛋白亚型试剂盒氯金酸(HAuCl 4 ) 和柠檬酸三钠 (Na 3 C 6 H 5 O 7 2H 2 O), 均购自 Sigma; DMEM 培养基, 购自 Gibco 公司 ;HRP 标记羊抗小鼠 IgG, 购自北京中杉金桥生物科技有限公司 ; 辛酸硫酸铵均为国产分析纯 ;SP2/0 细胞为本实验室保存 ; CPAOZ-BSA,CPAOZ-OVA, 本实验室自制二氧化碳培养箱,SANYO 公司 ; 净化工作台, 苏州净化设备有限公司 ; 酶标仪, 美国 Bio-TEK;96 孔 24 孔培养板,Costar 公司 ; 三维平面点膜喷金机, 上海金标生物科技有限公司 1.2 试验动物 Balb/c 小鼠, 河北医科大学实验动物中心 1.3 单抗的制备及特性鉴定杂交瘤细胞的筛选及单抗的制备 6 周龄的雌性 Balb/c 小鼠, 免疫剂量 40 μg/ 只, 每隔 2 周免疫一次 4 周免疫后 10 d 断尾取血, 间接 ELISA 检测小鼠血清抗体效价, 间接竞争 ELISA 测定抗血清抑制率, 选择效价高, 且抑制效果较好的小鼠加强免疫,3 d 后用于融合融合小鼠摘眼球放血, 将血清作为阳性对照, 脱颈处死后无菌条件下取出脾脏, 制备脾细胞, 与 SP2/0 细胞按 5:1 的比例通过 PEG 融合, 将融合后的细胞悬液加入已铺有饲养细胞的 96 孔板, 放入 37 5% CO 2 的培养箱中培养, 次日检查有无污染融合后第 10 d 换用 HT 培养基换液后 2~3 d 用间接 ELISA 和间接竞争 ELISA 进行阳性孔筛选, 尽量挑选出强阳性抑制率高单个克隆细胞状态好的孔, 通过有限稀释法进行亚克隆, 同时进行扩大培养冻存, 直至建立单一分泌抗体的单克隆细胞株采用小鼠体内诱生腹水的方法制备抗体, 取健康的 Balb/c 雌性小鼠, 每只小鼠体内注射石蜡油 0.5 ml, 7 d 后调整克隆化阳性杂交瘤细胞 10 6 /ml, 每只小鼠腹腔注射 1 ml,7~9 d 取腹水, 离心弃脂肪, 先后经辛酸 - 硫酸铵 Protein A 亲和层析柱纯化, 冻干后 -20 保存单克隆抗体效价的测定采用间接 ELISA 法, 具体步骤如下 : 包被 : 用碳酸盐缓冲液稀释包被原至浓度为 2 μg/ml,96 孔酶标板 100 μl/ 孔,4 过夜 ; 洗涤 : 包被板恢复至室温, 倾去包被液, 每孔加洗液 300 μl, 每次静置 1 min, 洗涤 3 次, 最后一次拍干 ; 封闭 : 每孔加 200 μl 含 10% 小牛血清的洗液,37 1 h; 倾去封闭液, 洗涤 3 次, 拍干 ; 加一抗 : 用洗液将单抗以 1:2000 倍开始倍比稀释, 每孔加入 100 μl, 并设置空白对照孔 (PBS) 和阴性对照 ( 阴性血清 ),37 放置 45 min; 倾去一抗, 洗涤 3 次, 拍干 ; 加酶标二抗 : 每孔加入 100 μl 的 l:10000 倍稀释的 HRP 酶标记的山羊抗鼠 IgG,37 放置 30 min; 倾去二抗, 洗涤 3 次, 拍干 ; 显色 : 每孔加底物显色液 100 μl,37 避光反应 15 min; 终止 : 每孔加入 50 μl 终止液, 终止反应 ; 检测 : 测定波长为 450 nm 处的吸光度值 (A 450 nm ) 结果判定: (A 样品孔 -A 空白对照 )/(A 阴性对照 -A 空白对照 )

3 且阴性对照的 A 450 nm 小于 0.2 时, 此时抗体的稀释倍数即为抗体效价单克隆抗体敏感性的测定采用间接竞争 ELISA 法, 包被洗涤封闭同间接 ELISA 加单抗和标准品 : 将标准品母液用 PBS 稀释成和 0.1 μg/l, 每孔加入 50 μl, 再加入一定稀释倍数的单抗, 每孔 50 μl, 同时设置空白对照孔 (PBS) 和阴性对照 (50 μl 单抗 +50 μl 洗液 ),37 保温保湿 45 min; 以下步骤同单抗效价的测定单抗免疫球蛋白的类别和亚类的鉴定采用 Sigma 公司鼠单克隆抗体分类试剂盒鉴定单抗 Ig 类和亚类, 对比不同二抗作用下的显色结果, 以是否显色判定单抗所属类别和亚类单抗亲和力的测定采用非竞争 ELISA 法测定亲和常数 (Ka), 包被时用碳酸盐缓冲液稀释包被原至浓度为 μg/ml, 加一抗用洗液将单抗以 100 μg/ml 开始倍比稀释, 分别加入 4 个包被原浓度, 其他步骤同单抗效价的测定测定波长为 450 nm 处的吸光度值 (A 450 nm) 按下列公式计算 Ka Ka=(n-1)/2(n Ab -Ab) 式中 :Ab 为抗原浓度为 Ag 时, 产生半数吸光度值的抗体浓度 ;Ab 为抗原浓度为 Ag 时, 产生半数吸光度值的抗体浓度 ;n 为 Ag 和 Ag 之间的稀释倍数 [14] 1.4 胶体金免疫层析检测试纸条的制备胶体金溶液的制备取 100 ml 蒸馏水, 煮沸 5 min, 加入质量浓度为 1% 的氯金酸 1 ml 和质量浓度为 1% 的柠檬酸三钠溶液 1.5 ml, 继续搅拌加热, 溶液最终经过灰色酒红色至呈透亮的红色, 冷却到室温, 分别通过目测法紫外分光光度法进行质量鉴定, 合格的胶体金溶液 4 避光保存胶体金标记抗体最佳 ph 值确定取 7 只离心管, 编号 1~7, 每管加入胶体金溶液 1 ml, 再依次加入 0.1 mol/l 的 K 2 CO 3 溶液 μl, 分别加入 CPAOZ 抗体 5 μl, 混匀, 静置 30 min 各管加 10% NaCl 10 μl, 混匀, 静置 2 h, 观察结果对照管只加胶体金溶液, 观察每管溶液的颜色变化溶液的颜色没有变化的即为胶体金标记抗体的最适 ph 值胶体金标记抗体最佳蛋白量的测定取 8 只离心管, 编号 1~8, 每管内加入已调好 ph 的胶体金溶液 1 ml, 然后依次加入 CPAOZ 抗体溶液 μl, 混匀, 静置 30 min; 对照管加抗体稀释液, 其余各管分别加 10% NaCl 溶液 10 μl, 混匀, 静置 2 h, 观察结果使红色保持不变的最低抗体量, 就是胶体金标记蛋白质最低稳定量, 在此基础上增加 20% 即为胶体金标记最适蛋白用量胶体金标记单克隆抗体取已制备好的胶体金溶液 100 ml, 用 0.1 mol/l K 2 CO 3 将胶体金溶液调至 ph 值为 8.5 左右, 按最适抗体用量边搅拌边加入 CPAOZ 单抗 0.7 mg; 室温避光静置 30 min, 然后搅拌时加入 1 ml 10% 的牛血清白蛋白使其终浓度为 1%, 继续搅拌 5 min 后避光反应 30 min, r/min 离心 30 min, 轻轻吸取上清弃去, 沉淀加入 10 ml 0.01 mol/l ph 7.4 的 PBS 缓冲液 ( 含 1% BSA), r/min 离心 30 min, 弃上清液, 如此洗涤 3 次, 以彻底去除未结合的蛋白质 ; 将沉淀用 10 ml 含 1% BSA 的 PBS 缓冲液 (0.01 mol/l,ph 7.4) 溶解,4 避光保存备用胶体金检测试纸条的优化和组装本实验采用竞争法, 即样品中的 CPAOZ 和固定在 NC 膜上的包被抗原 CPAOZ-OVA 竞争胶体金标记的抗 CPAOZ 单克隆抗体优化胶体金试纸条层析条件, 抗原及二抗工作浓度金标抗体稀释度选择一组浓度, 以条带显色均匀, 颜色深浅适合观察为最佳按优化条件将金标抗体溶液用喷金仪均匀喷到结合垫上 ( 喷量为 0.4 µl/mm), 真空干燥后于 4 存放 ; 用划膜仪将 CPAOZ-OVA 和酶标二抗 ( 工作浓度分别为 3.0 mg/ml 和 1.0 mg/ml) 包被在 NC 膜上, 形成检测线 (T 线 ) 和质控线 (C 线 ),37 烘干 48 h 将干燥好的样品垫胶体金垫 NC 膜以及吸水纸, 按常规金标试纸条的组装方法, 分别粘贴在 PVC 板上, 用切割机切成 2~3 mm 宽的条状, 即制成试纸条, 置于 4 避光干燥保存 1.5 胶体金检测试纸条的性能测定样本处理取鱼肉虾肉组织匀浆后, 称取 2 g 于 50 ml 离心管中, 加入 4 ml 去离子水,1 ml 1 mol/l 盐酸溶液, 振荡 1 min, 再加入 0.5 ml 对羧基苯甲醛, 振荡 1 min,37 水浴避光孵育 16 h; 取出后加入 0.5 mol/l 磷酸氢二钠溶液 1 ml, 用 1 mol/l 氢氧化钠溶液调节 PH 至 7.5 左右, 振荡 1 min, 加入 5 ml 乙酸乙酯, 振荡 1 min,5000 r/min 离心 10 min; 移取上层乙酸乙酯层溶液于另一离心管中, 水相再用 5 ml 乙酸乙酯重复萃取两次, 合并后氮气吹干 ; 加入 1 ml 正己烷, 加盖振荡 1 min, 然后加入 0.5 ml PBST 缓冲液, 振 328

4 荡 1 min,5000 r/min 离心 10 min; 吸取下层水相溶液抗体效价均达到 1:100 万以上, 其中以 4G3 的效价最高, 结果见图 1 用于分析试纸条灵敏度测试将 1 mg/ml 呋喃唑酮代谢物衍生物 (1 mg CPAOZ 溶于 1 ml 甲醇 ) 用 PBS 分别稀释为 μg/l 的一系列标准溶液, 再分别取 90 μl 上述标准溶液滴在试纸条的样品垫上,5 min 后观察试纸条的显色情况 C 线和 T 线同时显示红色条带时为阴性 ;C 线显示红色,T 线不显示红色, 为阳性随着标准溶液的浓度增大,T 线的颜色会越来越浅, 直到肉眼观察不到, 此时标准溶液的浓度为试纸条的检测限试纸条特异性测试选取 4 种硝基呋喃代谢物的衍生物 (CPAOZ CPAHD CPSEM 和 CPAMOZ) 测试, 将其母液分别用 0.01 mol/l PH 7.4 的 PBS 稀释至 50 μg/l, 滴加到试纸条的样品孔, 观察试纸条显色效果,PBS 作对照与仪器方法的比对随机取 8 份水产样品, 作为供试试样每份样品分别用 HPLC 法和本研究制备的 CPAOZ 胶体金检测试纸条进行检测, 比较检测结果 2 结果与讨论 2.1 单克隆抗体筛选 4 免后 2 号小鼠血清抗体效价高且抑制效果好, 加强免疫后用于融合融合后共选出了 6 个分泌抗体效价高药物抑制效果好的单个细胞孔经 4 次亚克隆, 得到 3 株能够稳定分泌 CPAOZ 抗体的细胞株, 命名为 2C8 4E10 4G3, 表明抗 AOZ 单克隆细胞株筛选成功 2.3 单克隆抗体亚型的测定采用间接 ELISA 方法测定抗 CPAOZ 单克隆抗体的亚类 3 株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与不同亚类的二抗显色有明显差异, 其中与 Ig G1 二抗的 A 450 nm 值最高, 与 Ig M 的二抗显色微弱, 而与 Ig G2a Ig G2b Ig G3 和 Ig A 二抗几乎不显色,3 株细胞分泌的抗体类型均以 Ig G1 为主 2.4 单克隆抗体敏感性的测定图 2 抗体 CPAOZ-4G3 抑制曲线 Fig.2 Antibody CPAOZ-4G3 inhibition curve 用间接竞争 ELISA 检测, 以吸光度百分比 B/B0%(B 代表不同浓度标准液的 A 450,B0 代表零浓度标准液的 A 450 ) 为纵坐标, 以不同浓度标准液的对数 [Lg(CPAOZ)] 为横坐标, 绘制抗体抑制曲线如图 2, 抗 CPAOZ 抗体对药物的抑制情况分别为 :4G3 IC 50 为 1.7 μg/l,2c8 IC 50 为 3.8 μg/l, 且 R 2 均大于 0.99, 对 CPAOZ 具有较高的敏感性 ;4E10 IC 50 为 27.7 μg/l, 抑制情况较差 4G3 效果最佳, 选做进行后续试验 2.2 单克隆抗体效价的测定 2.5 单克隆抗体亲和力的测定图 1 单克隆抗体间接 ELISA 效价测定 Fig.1 Monoclonal antibody titer by indirect ELISA 将 3 株细胞扩大培养后诱生腹水, 纯化后经检测, 图 3 单克隆抗体亲和力的测定 Fig.3 Determination of the affinity of the monoclonal antibody 亲和常数计算以抗体浓度的对数为横坐标, 相应 329

的 A 450 值为纵坐标, 绘制 S 型曲线以每条曲线上部平坦段的吸光度值作为 100%, 查出 50% A 450 值时相对应的抗体浓度, 代入公式计算亲和常数 Ka (CPAOZ-4G3) 为 1.6 10 9 L/mol 2.

4 Sensitivity of the colloidal gold strip test 由图 4 所示, 当 CPAOZ 添加浓度为 3 μg/l 时, T 线相对于 0 μg/l 时的 T 线的颜色变浅, 而当 CPAOZ 的添加浓度为 4 μg/l 时,T 线消线, 说明胶体金试纸条的检测限为 4 μg/l 2.

HPLC/(μg/kg) 未检出未检出 1.73 未检出未检出未检出 2.35 未检出 ICA - - + - - - + - 注 : + 表示阳性, - 表示阴性 3 结论 3.

5 的 A 450 值为纵坐标, 绘制 S 型曲线以每条曲线上部平坦段的吸光度值作为 100%, 查出 50% A 450 值时相对应的抗体浓度, 代入公式计算亲和常数 Ka (CPAOZ-4G3) 为 L/mol 2.6 胶体金检测试纸条灵敏度控区 C 线显示一条棕红色线, 检测区 T 线不显示棕红色线, 表示检测结果为阳性, 其他 4 组不能抑制 T 线显色, 说明这 4 种物质不能与抗 CPAOZ 单抗结合, 表明制备的 CPAOZ 胶体金试纸条与其他几种硝基呋喃类代谢物的衍生物不存在交叉反应图 4 胶体金试纸条的灵敏度试验 Fig.4 Sensitivity of the colloidal gold strip test 由图 4 所示, 当 CPAOZ 添加浓度为 3 μg/l 时, T 线相对于 0 μg/l 时的 T 线的颜色变浅, 而当 CPAOZ 的添加浓度为 4 μg/l 时,T 线消线, 说明胶体金试纸条的检测限为 4 μg/l 2.7 胶体金检测试纸条特异性检测结果如图 5 显示, 滴加 CPAOZ 的试纸条质 330 图 5 胶体金试纸条的特异性试验 Fig.5 Specificity of the colloidal gold strip test 2.8 与仪器方法的比对 8 份水产样品经高效液相色谱检测, 其中 6 份样品未检出呋喃唑酮代谢物残留,3 号样品检测出 AOZ 含量 1.73 μg/kg,7 号样品检测出 AOZ 含量 2.35 μg/kg 这些样品同时用呋喃唑酮代谢物胶体金试纸条检测, 结果与 HPLC 法完全符合, 见表 1 表 1 呋喃唑酮代谢物胶体金试纸条与高效液相色谱法检测结果比较 Table 1 Comparison of the results of sample analysis by HPLC and colloidal gold test strips 方法 HPLC/(μg/kg) 未检出未检出 1.73 未检出未检出未检出 2.35 未检出 ICA 注 : + 表示阳性, - 表示阴性 3 结论 3.1 AOZ 分子量小, 只具有反应原性, 所以在抗体制备过程中通常采用其衍生物作为免疫原小分子抗原免疫融合后常出现阳性率高抑制率低的结果, 本实验采取多种免疫原分组免疫的方法, 以提高融合后的抑制率, 最终得到 2 株稳定分泌抗体且抑制效果较好的细胞, 可以用于下一步的胶体金标记 3.2 本研究采用柠檬酸三钠还原法制备出颗粒均匀分散性好的胶体金溶液, 在最适 ph 值按标记抗体的最佳标记量制备了金标抗体溶液, 并在此基础上组装了胶体金免疫层析试纸条经检测, 试纸条的检测限为 4 μg/l, 与其他几种硝基呋喃类代谢物衍生化试剂不存在交叉反应, 检测结果准确可靠, 能够应用于 AOZ 残留的快速检测, 提高水产品质量安全水平, 维护广大人民群众舌尖上的安全参考文献 [1] 闫叶娜. 呋喃西林代谢物单克隆抗体的制备及其免疫分析方法的建立 [D]. 南京 : 南京农业大学,2010 YAN Ye-na. Preparation of monoclonal antibody for nitrofurazone and development of its immunity analysis [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2010 [2] 宋凯, 肖桂英, 姜桥. 高效液相色谱法同步测定饲料及兽药中 4 种硝基呋喃类药物 [J]. 粮食与饲料工业,2010,3:49-51 SONG Kai, XIAO Gui-ying, JIANG Qiao. Simultaneous determination of four nitrofuran drugs in feedstuff and veterinary drugs by high performance liquid chromatography [J]. Cereal and Feed Industry, 2010, 3: [3] Xu W H, Zhu X B, Wang X T, et a1. Residues of enrofloxacin, furazolidone and their metabolites in nile tilapia (Oreochromis niloticus) [J]. Aquaculture, 2006, 254(1-4): 1-8 [4] 李静宇, 何小维, 李敏, 等. 呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备及鉴定 [J]. 现代食品科技,2014,30(10): ,273 LI Jing-yu, HE Xiao-wei, LI Min, et al. Preparation and identification of artificial antigen of furazolidone metabolite

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材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人

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