中 国 畜 牧 兽 医 卷,-&!-/"/"#%$'."/719*"#!"/"#& 头孢氨苄 '."/71 又称头孢菌素 先锋霉素 等 属于人兽共用的第一代人工半合成头孢菌素类抗生素 因其具有抗菌谱广 疗效确切 价格低廉等优点 在医学和兽医临床上都有着广泛 应用 但 1 的不合理使用 不仅会造成环境

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1 中国畜牧兽医! " # 抗头孢氨苄单克隆抗体的制备与初步应用 张 伟 王 兴 刘金萍 徐声乐 秦海艳 刘若璇 蔡云虹 汝晓飞 侯 珂 王捍东 扬州大学兽医学院 扬州 张浦镇动物防疫站 昆山 摘 要 为制备抗头孢氨苄 '."/71 的单克隆抗体并建立鲜奶中 1 残留检测的 19* 方法 本试验采用戊二醛两步法分别将 1 与牛血清白蛋白 卵清白蛋白 (2 偶联 用合成的 1 作为免疫原免疫 9 雌鼠 次免疫后 应用杂交瘤细胞融合技术建立并筛选出两株 分泌抗 1 单克隆抗体 -/"/"#%0% 的杂交瘤细胞株 将 细胞株注入 9 小鼠腹腔制备腹水 并对腹水进行纯化及鉴定 结果显示 腹水效价大于 4= 其抗体亚型为 *&% 亲和力常数 = 9-/ 交叉试验结果显示 该单克隆抗体除了与头孢拉定有 < 的交叉反应率外 与头孢噻呋 头孢曲松 头孢噻肟 头孢噻吩 青霉素 链霉素 四环素均无明显交叉反应 建立了测定鲜奶样品中 1 的 19* 方法 线性范围为 &-9 线性方程 $7 检测下限为 4&-9 平均回收率为 < 平均变异系数低于 < 低于中国及欧盟规定的头孢氨苄最高残留限量 具有一定的应用前景 关键词 单克隆抗体 头孢氨苄 19* 人工抗原中图分类号 45 6 文献标识码 文章编号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收稿日期 基金项目 江苏高校优势学科建设工程 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 江苏省高校重点实验室开放课题作者简介 张 伟 男 安徽淮南人 硕士生 研究方向 动物性食品卫生安全 1-"/."&- 通信作者 王捍东 4 男 江苏兴化人 教授 硕士生导师 研究方向 动物性食品有害残留检测与控制 1-"/$."-

2 中 国 畜 牧 兽 医 卷,-&!-/"/"#%$'."/719*"#!"/"#& 头孢氨苄 '."/71 又称头孢菌素 先锋霉素 等 属于人兽共用的第一代人工半合成头孢菌素类抗生素 因其具有抗菌谱广 疗效确切 价格低廉等优点 在医学和兽医临床上都有着广泛 应用 但 1 的不合理使用 不仅会造成环境污染 且易引起动物性食品中的残留 食用含有 1 残留的食品会对人体造成一系列不良的后果 如过 敏反应 黄疸 肾毒性等 还可引起耐药菌株 的增加 欧盟及中国对该药物在牛体内最大残留限量 09 有相同且明确的规定 奶 && 肌肉 && 脂肪 && 肝脏 && 肾脏 && 目前 关于 1 的检测方法主要有紫外 可见 4 分光光度法 高效液相色谱法 液质联用 毛 细管电泳法及免疫学检测方法等 传统的理化分析法具有准确度高 假阳性率低 特异性强的优点 但这些方法耗时长 操作复杂 仪器要求较高 不适宜实际检测中快速批量筛选 免疫学方法操作简单 检测成本低 灵敏度高 将免疫学方法与 990 等理化分析方法结合起来不仅可大规模快速筛选 而且也能保证检测结果的可靠性 但免疫学方法在很大程度上受到抗体特异性和亲和力等影响 因此 本研究旨在制备出亲和力高 特异性强的抗 1 单克隆抗体 并初步建立鲜奶中检测 1 残留的 19* 方法 为 1 残留监控提供理论和技术支持 材料与方法. 材料 头孢氨苄 1 购自 * 公司 牛血清白蛋白 卵清白蛋白 (2 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 次黄嘌呤 氨基蝶呤 胸腺嘧啶核苷 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 *&< 1 溶液 四甲基联苯胺 0 尿素过氧化氢 8 均购自 &-" 公司 )010 购自 % 公司 小牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司 新鲜无抗奶由扬州大学实验农牧场提供 ; 酶标仪购自 " 公司 82 型紫外 可见分光光度计购自岛津公司 "#; 标准型 ' 计 购自赛多利斯公司 倒置相差显微镜 8 购自 3 公司 二氧化碳恒温培养箱购自 -" #! 公司 #"'# 购自 1 公司 小鼠单克隆抗体亚型试剂盒购自.-#! 公司 4 周龄 9 雌鼠 4 周龄 * 雌鼠均由扬州大学实验动物中心提供 小鼠骨髓瘤细胞由扬州大学兽医临床内科实验室保存. 人工抗原的合成 免疫原与包被原均以戊二醛 为偶联剂进行合成 方法如下 称取 -& --/ 溶于 -9 中 缓慢滴加 9 < 戊二醛并置室温中缓慢搅拌. 以 为透析液 于 > 透析 4. 将透析后的液体离心并加入 -& 1 --/ 室温避光搅拌. 装入透析袋中 每 4. 换一次透析液 透析 最后分装并保存于 > 包被原合成方法同上 在最后一步加入过量甘氨酸 封闭未反应的醛基 合成路线见图./ 人工抗原的鉴定 紫外分光光度法鉴定 分别配制一定浓度的 (21 标准溶液 将 (2 1 与 1 进行适当比例稀释 在 - 范围内进行紫外扫描 分别记录最大吸收峰 并根据最大吸收峰偏移情况初步判断偶联效果 )1 凝胶电泳鉴定 参照文献 介绍的方法配制各种电泳溶液 浓缩胶浓度为 < 分离胶浓度为 < 上样量 9 浓缩胶电压 42 分离胶电压 2 考马斯亮蓝染色. 后脱色拍照 根据条带所带分子质量大小初步判断偶联效果 免疫学方法鉴定 以 1 为免疫原免疫小鼠 分别于三免和五免后一周采集血清 然后以 1(2 为检测抗原 采集的血清作为一抗 进行间接 19* 19* 检测 根据效价高低确定偶联效果. 单克隆抗体的制备 免疫程序 以 周龄 9 雌鼠为试验动物 利用超声破碎仪将免疫原与弗氏完全和不完全佐剂充分混合 在三免和五免后 测血清效价及抑制 选取检测结果最佳的小鼠进行冲击免疫 具体免疫程序见表

3 期 张 伟等 抗头孢氨苄单克隆抗体的制备与初步应用 图 戊二醛法制备人工抗原路线 $.#(&#$#+$3&!! 表 小鼠免疫程序 6+((3##)&$&(&( 免疫程序 免疫原 免疫剂量 免疫途径 *--;"#'&"- *--;& *--;"# &-9 只 *--;/&"/'"#."$ 首免 抗原 6 完全佐剂 腹腔注射 #--;"# 二免 周后 抗原 6 不完全佐剂 皮下注射 6 腹腔注射 --;"##./"# 三免 周后 抗原 6 不完全佐剂 皮下注射 6 腹腔注射.--;"# #/"# 四免 周后 抗原 6 不完全佐剂 皮下注射 6 腹腔注射 ;#.--;"# #/"# 五免 周后 抗原 6 不完全佐剂 皮下注射 6 腹腔注射!#.--;"# #/"# 冲击免疫 周后 抗原 6 生理盐水 腹腔注射 #--;#$/"# 细胞融合 参照刘秀梵介绍的方法进行细胞融合 将冲击免疫后的小鼠断颈处死取脾脏 分散脾细胞后与准备好的小鼠骨髓瘤细胞 按照 的比例混合 再缓慢滴加 < 1 溶液进行细胞融合 将融合后的细胞用 培养基重悬并滴加至已铺有饲养细胞的 孔板中 然后将 孔板放置于 > < ( 恒温培养箱中进行选择性培养 后用 培养基进行半换液 后用 培养基进行全换液 再过 改用 < )010 高糖培养基 细胞株的筛选与亚克隆及稳定性测定 采用间接 19* 测细胞上清效价 用竞争 阻断 19* 测细胞上清药物抑制情况 选取结果最佳 生长状态最好的细胞进行亚克隆 亚克隆采取有限稀释法 筛选方法同上 经过连续 次亚克隆且上清阳性率均为 < 时 将细胞进行扩大培养并及时冻存 细胞株在体外连续传代 次并冻存复苏培养 检测细胞上清效价变化情况 以此判断该细胞 株稳定性 腹水的制备 本试验采用体内诱生法制备腹水 将建株的细胞扩大培养 调节其生长状态 向经产 9 小鼠腹腔注射无菌液体石蜡 后调整杂交瘤细胞密度至 = 个 -9 并向每只小鼠腹腔注射 -9 后采集腹水 将腹水离心 取中间层 并用 - 滤膜过滤 > 分装保存 腹水的纯化与保存 参照 #"'# 亲和纯化柱说明书纯化腹水 并将纯化后的腹水置于 > 分装保存. 单克隆抗体的初步鉴定与应用 效价测定 间接 19* 测效价 取适宜浓度的 1(2 为包被原包被酶标板 > 过夜后 溶液洗板 次 每次 - 用 < 明胶 溶液封闭. 洗板后将腹水进行系列浓度稀释加入其中 同时设置空白对照 阴性对照及阳性对照 > 温育. 后洗板 再加入酶标二抗 > 作

4 中 国 畜 牧 兽 医 卷 用. 后洗板 最后每孔添加 0 显色液并用 -/9 的 ( 终止反应 放置酶标仪下测定每孔 - 值 以大于阴性对照 - 值的 倍为阳性孔 以阳性孔中最大稀释倍数为该小鼠腹水效价 抗体亲和力鉴定 根据 "#$ 等的报道 采用 19* 方法对所制备的腹水进行亲和力鉴定 单克隆抗体亚型测定 利用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体进行亚类鉴定 操作方法参照试剂盒说明书进行 单克隆抗体特异性鉴定 将 1 与结构类似物及畜禽常用抗生素 头孢拉定 头孢噻呋 头孢曲松 头孢噻肟 头孢噻吩 青霉素 链霉素 四环素等 作系列稀释 配成标准溶液 通过竞争 阻断 19* 分别绘制抗 1 单克隆抗体对各竞争物的标准抑制曲线 根据曲线求出各药物半数抑制浓度 * 通过以下公式计算各药物与抗 1 单克隆抗体的交叉反应率 从而判断抗体特异性 交叉反应率 <* 1* 竞争物 =< 间接 19* 标准抑制曲线及相关参数 鲜牛奶 - 离心 - 弃上层脂肪和下层沉淀 取中间层液体 为排除基质干扰 将样品进行 倍稀释 加入 1 样品标准液 使 1 终浓度为 和 &-9 以抑制率 为纵坐标 以 9&6 不同浓度 1 的值为横坐标 绘制样品溶液标准抑制曲线 并进行相关数据分析 计算公式为 抑制率 * 标准差 ) 半数抑制浓度 * 对应的 * = 检测下限 9() 对应的 9() ) 添加回收试验 将空白样品做 倍稀释后 通过添加 1 标准溶液 分别配制低 &-9 中 &-9 高 &-9 个浓度鲜奶样品溶液 每个浓度重复 次 用 建立的标准抑制曲线测定样品添加回收率 结 果. 人工抗原的鉴定 紫外分光光度法鉴定结果 将偶联产物 1 与 1 经适宜浓度稀释后 在紫外分光光度计下的扫描结果见图 由图 可知 1 在 - 处有紫外吸收峰 载体蛋白 在 4- 处有紫外吸收峰 偶联产物 1 在 - 处有吸收峰 可见与 1 相比 偶联产物 1 发生了略微蓝移 与 相比发生了明显蓝移 1(2 偶联情况与此相似 因此 可初步判定半抗原 1 与载体蛋白偶联成功 图 "*< 与 *<5" 紫外图谱 $.8)&"*<#!*<5" )1 凝胶电泳鉴定结果 由图 可知 1 条带所携带分子质量大于 分子质量 且产生明显的 滞后 与 拖尾 现象 这表明 经合成反应后偶联了一定数量的 1 使偶联 产物分子质量大于原载体蛋白分子质量 1 (2 与 (2 电泳结果与此相似 因此 亦可初步判定偶联成功

5 !) 期 张! 伟等$抗头孢氨苄单克隆抗体的制备与初步应用 %%(* %! JIX!>N=( 0! >N=(H! %2"%2&.Y 双色预染蛋白质 H4.; %! JIX!>N=( 0! >N=(H! %2! %2&.Y? ;! M 5 4 $ -;"? # 5 ; $ - H4.; 图 G!4<1 和 B(` S4<1 的 <N< S71R( 分析. 2 G!<N< S71R(/5/ > 2 >)4<1/53B(` S4<1 6F 0 0' %' *! 免疫学方法鉴定结果!! 间接 IWB N= 结果 见图 )&由图 ) 可 知!免 疫 后 小 鼠 血 清 中 含 有 针 对 明偶联方法成功!该 方 法 合 成 的 免 疫 原 免 疫 小 鼠 可 获得高效价的 JIX 多克隆抗体& JIX 的抗体!且五免后的效价大于 %_(' )a%&!表 ) 图 %!B(` 多克隆抗体血清效价测定结果. 2 %!H* > Q,)> * 8 Q@, 2, * 8)B(`7+1C 6F!F!! 抗 B(` 单 克 隆 抗 体 细 胞 株 的 建 株 及 稳 定 性 测定!F G!<N< S71R( 凝胶电泳检测腹水纯化效果 经离心'过滤和? # 5 ; $ -O 亲 和 层 析 柱 纯 化 后! 经过连续 * 次亚克隆!且通过间接 IWB N= 检测 均为 %&&` 阳 性!最 终 获 得 两 株 能 稳 定 分 泌 抗 JIX NAN!?=OI 鉴定结 果 见 图 2& 由 图 2 可 知! 0O) 腹 水纯化前含有一定 量 杂 蛋 白!经 纯 化 后 杂 蛋 白 条 带 单克隆抗 体 细 胞 株 0O) 和 2>*& 经 体 外 连 续 培 养 基本消失不见!表明纯化效果良好!纯化后得到的两 *& 代后冻存复苏培养!其细胞上清 液 效 价 基 本 保 持 不变& 条 带 分 别 是 0O) H,=7 的 重 链 " 22.Y#和 轻 链" 02.Y#&

6 中 国 畜 牧 兽 医 卷 0 ; 双色预染蛋白质 0" 纯化前的腹水 收集的杂蛋白 纯化后的腹水 0;#"# 0"#%!';!"#(#.'##"!#';!" # 图 5%4 鉴定 4 单克隆抗体纯化效果 $.%3&#&3'+4+5%4. 效价测定由表 可知 当腹水稀释至 4= 时 - 值为 阴性对照 - 值为 此时仍为阳性 因此判断腹水效价高于 4= 选 取 - 值为 左右且抑制率最高的孔作为最佳抗原抗体的工作浓度 由该方阵结果可知 包被原最佳工作浓度为 腹水最佳工作浓度为 表 腹水效价及抗原抗体最佳工作浓度 6+&#!#$#5#+!)(-&#$##&# 腹水稀释度 包被原稀释度 "#&"#&/;# )/;#!"# 阴性对照 3&"#,#/ 4 4. 亲和力鉴定与亚型测定间接 19* 测定单克隆抗体的亲和力 计算得出 0% 的亲和力常数 = 9-/ 利用 19* 试剂盒进行单克隆抗体亚型测定 结果表明 0% 亚类为 *&% 轻链. 抗 *< 单克隆抗体特异性鉴定用 19* 方法检测该单克隆抗体对头孢拉定 头孢噻呋 头孢曲松 头孢噻肟 头孢噻吩 青霉素 链霉素 四环素等药物半数抑制浓度并计算出相应的交叉反应率 结果见表 由表 可知 除了与头孢拉定的交叉反应率达 < 外 该单克隆抗体对其他结构类似物的交叉反应率均低于 4< 表明所制备的单克隆抗体对 1 具有较高特异性

7 期 张 伟等 抗头孢氨苄单克隆抗体的制备与初步应用 表 /*< '+ 与结构类似物的交叉反应 6+/*&5&*< '+-&33&#$ 化合物 半数抑制浓度 交叉反应率 -'; *&-9 "#,#$"#< 头孢氨苄 '."/7 4 头孢拉定 '." 4 头孢噻呋!#!; = 4 头孢曲松!#"7 = 4 头孢噻肟!#"7- = 4 头孢噻吩 '."/#. = 4 青霉素 / = 4 链霉素 #'#-$ = 4 四环素 #"$/ = 4. 间接 标准抑制曲线的绘制 间接 19* 标准抑制曲线见图 由图 可知 曲线呈典型 形 在 &-9 范围里 线性 关系良好 线性回归方程为 $7 相关系数 * 为 &-99() 为 4&-9 图 鲜奶样品溶液标准竞争抑制曲线 $.#&#!&!3&* #(()3#. 添加回收率的测定 样品添加回收率结果见表 由表 可知 在空白样品中添加低 中 高 个浓度的药物 回收率 为 44<< 平均回收率为 < 变异系数为 4< < 平均变异系数为 < 表 鲜奶样品中 *< 添加回收试验结果 6+0&&3*<!!!( 添加药物浓度 测定值 回收率 变异系数 #"#!1&-9 0";,"/;&-9,$< @4 4 胺环 因此可选用戊二醛法 1) 法 4 和化学交 / 讨 论 /. 人工抗原的制备 1 摩尔分子质量只有 &-/ 属于小分子物质 必须与大分子载体蛋白偶联才具有免疫原性 因 1 分子结构上带有氨基 羧基和 内酰 联等方法进行偶联 经过前期试验对比发现 1) 法和化学交联法所制备的人工抗原并不理想 该结果与赵启法研究结果相同 可能原因是在氨基与羧基共同存在的情况下 1) 易导致自身偶联从而降低偶联效率 1 在碱性条件下的水解速度

8 中 国 畜 牧 兽 医 卷 和水解后的反应活性也可能会干扰化学交联法的偶联程度 目前 戊二醛法主要包括一步法和两步法 因为戊二醛具有易氧化 聚合的特性 因此为减少药物自身互相反应 本试验采用戊二醛两步法制备人工抗原 先将载体蛋白与过量的戊二醛结合 透析后再与 1 反应 试验结果表明该方法取得了较为满意的效果 /. 多克隆抗体及单克隆抗体筛选 为了获得高特异性单克隆抗体 必须排除 (2 及偶联剂戊二醛带来的影响 因此在多克隆抗体和后期的杂交瘤细胞株筛选过程中 采用了间接 19* 方法来进行筛选 以人工合成的 1(2 作为包被原可先去除大部分针对 的杂交瘤细胞 虽然免疫原载体是 但 与 (2 仍存在交叉反应的可能 因此 19* 试验中 设置了 (2 为包被原的阴性对照 以去除针对 (2 的杂交瘤细胞 因戊二醛易聚合特点 产生 桥抗体 的可能性大大增加 本试验采用与彭会建 等相同筛选策略 使用一定药物浓度的 1 来做竞争 阻断 19* 从而排除针对戊二醛的杂交瘤细胞 /./ 单克隆抗体的制备与纯化目前 大量制备单克隆抗体的方法有体外培养法和体内诱生法等 体外培养法虽简单方便 但抗体含量较低且不利于后期的浓缩纯化 故本试验采用体内诱生法制备腹水 试验同时采用 9 小鼠与 * 小鼠制备腹水 结果发现两种小鼠所制备腹水的相关指标并无明显差别 但 * 小鼠得到的腹水量更多 原因可能是与小鼠体型大小有关 有 报道显示 不同纯化方法对抗体的活性 纯度 回收率均有不同的影响 因此本试验采用 # 亲和层析柱纯化腹水 )1 结果表明所纯化的腹水纯度较高 可用于后续试验 结 论 本试验成功合成了 1 人工抗原 通过杂交瘤技术筛选出两株高特异性 高灵敏度杂交瘤细胞株 对其免疫学特性进行初步鉴定 所建立的 19* 检测方法线性范围宽 检测限为 4&-9 低于欧盟及中国规定的 1 最高残留限量 平均回收率为 < 平均变异系数低于 < 可基本满足现行兽药残留分析的要求 参考文献 张 伟 王 兴 刘金萍 等 动物性食品中头孢氨 苄残留检测研究进展 B 安徽农业科学 44 /"9B'."/'"/&$B (/ " # 44 &/"8--";!";#;&;/, ;$!/& -"--'/"#$B4!!/ (.# "B(.B"&B+#"/*#!"#!&%"'##"/%-"!'."/7 ;'.#7#$ -B"#/,0#( """."..";."$ 3#"/," /""#-%"/;'#%/#$'"#!-#. /#"#&!1### 0 0#".&.'#"/ '/-"$ '#B ( " # &##/ 1 农业部畜牧兽医局 农业部发布动物性食品中兽药最高残留限量 续 B 中国兽药杂志 "" 2","*."E 0#"/),/' -#","/"#!82'#'.#-#-#.!#-"#!'."/7B.#! 4(/," 2)#";"#!"#!'."/7";/,/%,-/%$.&.'!-" /E;.-"#&"'.$ #. / "-'/ /";'B,!4 倪梅林 崔晓美 殷居易 等 动物组织与水产品中头孢氨苄残留量的液相色谱 串联质谱检测 B 分析测试学报 44 汪雪雁 祁克宗 陈玎玎 等 鸡肉中头孢类抗生素的 0*11 检测 B 江苏农业学报 4.9"&A0#"/'."/7 ;##-/"%!%$19*"/"/ &/%"#'#'""$B(/ #! %! 卞素敏 扈洪波 邢仕歌 等 19* 法检测牛奶中头孢氨苄残留 B 食品科学 44 A."&B"&A0#"/.-&;!/; '/""#--;""$!#.#-" #!'."/7"!"7/-/B%/!#"!444 /"- )* 0 0/"B#"/ -'/"!#,-#.#""/$--%"'

9 期 张 伟等 抗头孢氨苄单克隆抗体的制备与初步应用 #%$)1"09)*-"'#-#$B!##.# 刘秀梵 单克隆抗体在农业上的应用 0 合肥 安徽科学技术出版社 "#$B)"#$2/". 0";-#! -/"/"#%$ "!#$ %$ -'##, $---;""$B(# "!4 胡文丽 匡 雪 简宗辉 等 抗 " 多克隆抗体的制备 鉴定和纯化 B 中国畜牧兽医 44 4 王照鹏 李向梅 徐 飞 等 大观霉素人工抗原的合成及其多克隆抗体制备 B 中国畜牧兽医 刘成梅 黄 丽 罗舜菁 等 氨苄青霉素人工抗原的制备及鉴定 B 食品科学 4444 赵启法 头孢氨苄人工抗原的合成及单克隆抗体的制备 ) 郑州 郑州大学 彭会建 王捍东 王宗元 等 0) 单克隆抗体的制备及测定方法的建立 B 畜牧与兽医 马泓冰 几种单克隆抗体纯化方法的比较性研究 ) 苏州 苏州大学 唐佳佳 李小兵 刘国文 等 单克隆抗体纯化的研究进展 B 中国畜牧兽医 44 责任编辑 董晓云

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