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灯田锺
5 years ago
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1 畜牧兽医学报 "%("'%'%", " % %,)@) %),****),),), 猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量 8+ 检测方法的建立武昱孜熊祺琰刘蓓蓓张珍珍王佳华利忠韦艳娜邵国青 ) 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京,, ) 省部共建国家重点实验室培育基地江苏省食品质量安全重点实验室南京,, 摘要建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量方法根据猪肺炎支原体序列和猪鼻支原体序列的特异性引物分别标记 ; 和!' 荧光报告基团的条 %2 '% 探针建立和优化双重实时荧光定量反应条件和体系同时检测其敏感性特异性和重复性建立的双重荧光定量对猪肺炎支原体和猪鼻支原体的最低检测值均为, " = 与猪源致病菌病毒和其他常见细菌均无交叉反应各浓度标准品的 " 值变异系数小于 + 重复性好检测份临床样本其中猪肺炎支原体的肺阳性率为, 鼻拭子阳性率支气管肺泡灌洗液阳性率 +) 猪鼻支原体的肺阳性率为, 鼻拭子阳性率 ** 支气管肺泡灌洗液阳性率 )* 建立的双重荧光定量方法比普通更加敏感实用性强可用于临床样品的检测该方法能同时快速和定量地检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体在短时间内获得样品的多个信息快速地解决了多次检测所需的时间以及经济消耗为猪肺炎支原体和猪鼻支原体的监测和防控提供了新型可靠的检测技术关键词猪肺炎支原体猪鼻支原体双重荧光定量中图分类号 +) 文献标志码 ; 文章编号,****,,,, &+ '$ 8+ $%" #" $ $ ""# -8 > 5 0:? '% =08 ( < ; <. %5. % -; ' 8; = 5. % - 0>'%%' ;: 2 % 3+% '%" '+ ("'%'+ % ' % + *!"'+ ' $"$' %" % "' ' '!%' ("'%'+ &' $ "!!""$" ("'%'+ * #%!$ % + ' $"$'%! %,, % 3+% 4$%"+% % "+ #%!$' "%"3+% '%" '+ ' %! %,, % 4 $ $. 7' % 3 "' %2 '%"# ( (' % 3 " & "! # ' $ & # % &*+ &%!% + &$ %'% *+ &%!% + '!). " & "# $ # '% "# ( '( 7. ; '%!' # " 3 7 # % '$" &. % &*+ &%!% + &$ %'% % &*+ &%!% + '!). # ' % $ & "!# ' $ 7' '(. '% " $ 5 '% % 3 " & '% # " ' '( 7 # '%' 5 ). % 3 & "!# ' $ '(. 7', " 收稿日期,,, 基金项目江苏省农业科技自主创新资金项目,, 肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心作者简介武昱孜女山西太谷人硕士主要从事生物化学与分子生物学研究通信作者邵国青 $' 2.' %@*) $

2 畜牧兽医学报卷 = & #*+ &%!% + &$ %'% *+ &%!% + '!). # 7' % # # ' %7.. # $$ %3 #' '% (' # ' "'. % ). % % #' % & '% '# & % &3'# ' % & "3' 7'.'%+ % ' % # "# ( ) # 3 # % ' '$" 7 # (. "!# ' $ ' ' ). #. 7.'. " 3 #' &*+ &%!% + &$ % 7 #, '% +) % % %' ' 7'( '% (# %. ' 3 '# '3' & '$" # " 3. " 3 #' &*+ &%!% + '! 7 #, ** '% )* % % %' ' 7'( '% (# %. ' 3 '# '3' & '$" # " 3 ). "!# ' $ & # %*+ &%!% + &$ %'% *+ &%!% + '! $ '% 7' $ # % 3.'%. $$ % '% '% ( & # % % ' '$" ). ' 3'% ' &. $..' '%' 2 # 3'# %& #$' % & '$" %'. # $ '% '3. $ '% % $ % $" % &$ " '% "# 3 '% 7'% # '( %.% & # %'% % # &*+ &%!% + &$ %'% *+ &%!% + '!) 7 (-" *+ &%!% + &$ %*+ &%!% + '! "!# ' $ 猪支原体肺炎 " ' $' "% $ % ' & 7 % 的主要病原是猪肺炎支原体 *+ &%!% + &$ %* + &$ % 是一种慢性高传染性可接触性的动物呼吸道疾病发病率高死亡率低在世界各地的猪场广泛流行和传 * 播引起的猪呼吸道疾病综合征 " # % # " # ' # ' $"! 又加重了病情严重危害规模化养猪业的健康发展 * + &$ % 被认为是最难净化流行范围最广也最容易受其他病原影响的动物病原之一猪鼻支原体 *+ &%!% + '!* + '! 属于一种常在的寄生菌常存在于病猪的鼻腔气管和支气管分泌物中被认为是猪支原体肺炎, 的第二致病病原 * + '! 主要通过呼吸道和直接接触传播感染率高在猪免疫力下降时是猪多发性浆膜炎胸膜炎腹膜炎肺炎心包炎关节炎咽鼓管炎中耳炎等的主要病原常与一些病毒细菌混合感染给养猪业造成巨大的经济损失另外 * + '! 是细胞培养中常见的污染物一旦受到污染很难被清除掉而且与人类 +* 的某些肿瘤疾病的发生有关 * + &$ % 和 * + '! 的检测方法主要是依靠临床诊断屠宰场监测分离培养血清学和分子生物学诊断方法基于荧光定量技术具有敏感性好特异性高快速定量精确等优点现已成为疾病诊断的良好工具本研究建立一种同时针对 * + &$ %* + '! 的双重荧光定量方法有助于快速地定性和定量监测 * + &$ % 和 * + '! 的感染为动物疫病的防控提供平台技术材料与方法材料 )) 菌株 * + &$ %* + '! 猪滑液支原体 * +!+ % 猪絮状支原体 * $%' 猪流感病毒 7 % %& %5' 3 # 01 猪胸膜肺炎放线杆菌 " % $! &$' &$ %; 猪圆环病毒型 " # % # 3 # " 1 副猪嗜血杆菌 % & $!&%'%!$! 猪细小病毒病 " # % "'#3 3 # %& % 0 猪繁殖与呼吸综合征病毒 " # % # "# 3 '% # " #' # % # $ 3 # 1 鸡毒支原体 *+ &%!%-%!&" $ 金黄色葡萄球菌 "%& + $!%$'$! ;8 大肠杆菌! ' % 均由江苏省农业科学院兽医研究所猪病防控研究室保存 )) 主要试剂及仪器动物 ; 试剂盒柱式细菌 ; 试剂盒一管式病毒 ; ; 试剂盒均购自北京天恩泽基因科技有限公司 ;?2 "# ( $' #$! 购自南京诺唯赞生物科技有限公司常规反应试剂盒购自宝生物工程大连有限公司? '% + 荧光定量仪为美国. #$ &. # % & 公司产品 )) 引物和探针合成 * + &$ % 序列和 * + '! 序列 + 荧光定量方法的探针采用相同的荧光信号因此对 *

3 期武昱孜等猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量检测方法的建立 + '! 序列探针进行了优化使用!' 标记取代了 ; 荧光定量所用的探针引物由 ' ' ' 公司合成普通 * 引物由金斯瑞生物科技有限公司合成方法 ) ) 荧光定量方法建立与优化在已建立的 * + &$ % 和 * + '! 荧光定量 + 方法基础上对双重荧光定量反应的引物浓度探针浓度进行优化建立最佳反应体系荧光定量反应体系,= 组成如下 ;? 2 "# ( $' #$!,=* + &$ % 和 * + '! 引物探针终浓度 +$ = 模板 = : 补足至,= 反应条件 +, $ %+,$ %+ + *, *,, 个循环根据以上的基本反应及扩增条件分别以 * + &$ % 和 * + '! ; 为模板对引物浓度范围,$ = 探针浓度范围,)++$ = 和退火温度 +,*, 进行优化 ) ) 敏感性检测 * + &$ % 和 * + '! 阳性质粒分别以, 倍梯度稀释的标准品为模板经优化好的反应体系和反应条件检测该方法的灵敏度 ) ) 特异性检测参照柱式细菌 ; 试剂盒一管式病毒 ; ; 试剂盒说明书提取 * + &$ %* + '!* +!+ %* $%'01; ;8 阳性样本的 ; 并用优化好的多重检测体系和条件来评价该检测方法的特异性 ) ) 重复性试验以个不同浓度的 * + &$ % 质粒和个不同浓度的 * + '! 质粒合并将混合物作为模板分别进行次批内批间的平行试验通过计算变异系数 ( 来判定该方法的重复性 ) )+ 临床样本的采集及检测, 份肺组织样本 +, 份鼻拭子份支气管肺泡灌洗液样本采集自江苏省多个发病猪场肺组织样本的采集需要将待检猪剖杀采取新鲜猪肺并用无菌冲洗干净剪切正常与病变交界处鼻拭子样本的采集先将待检猪绑定后棉签轻轻碰到鼻中隔刺激猪打喷嚏 + 次后迅速拔出棉签得到鼻拭子样本支气管肺泡灌洗液样本的采集需将待检猪剖杀收集新鲜肺从气管灌入无菌溶液轻轻揉捏肺使充分浸入肺收集灌洗液样本样本处理后应用所提取基因组 ; 为模板用优化好的双重荧光定量体系进行检测并同时做 * + &$ %* + '! 普通比较两种方法的检出率结果荧光定量 8+ 方法建立与优化以, 倍梯度稀释的 * + &$ %* + '! 质粒的混合物为模板进行双重荧光定量扩增通过优化确定双重荧光定量反应体系引物探针的最佳配比,$ =,)+=,$ =,)+ =, $ =,)+=,$ =,)+=,$ =,)+=,$ = )+= 模板 = : 补足至,= 优化的反应条件 +, $ %+, $ %+ + *, *,, 个循环荧光定量 8+ 标准曲线的建立将 D, * 拷贝 = 的 * + &$ % * + '! 的重组质粒, 倍系列稀释以 D, D, * 拷贝 = 的稀释液为模板进行双重荧光定量扩增扩增结果浓度为横坐标对应的 " 值为纵坐标得到条标准曲线图 * + &$ % 的斜率 " 线性相关系数和扩增效率分别为 )+,))+ * + '! 的 " 和分别为 )*,)++)++ 扩增产物的 " 值与浓度之间线性关系良好特异性试验以 * + &$ %* + '!* +!+ %* $%'01; ;8 阳性样本的 ; 为模板进行双重荧光定量检测结果如图所示用所建立的方法检测 * +!+ %* $%'01; ;8 结果均为阴性无扩增曲线该方法能特异性检测 * + &$ %* + '! 敏感性试验 * + &$ %* + '! 重组质粒以 D, D, * 拷贝 = 的稀释液为模板进行荧光定量扩增检验该体系敏感性由扩增曲线可以确定 D, 拷贝 = 为最低检出量图

4 )(G( 畜!牧!兽!医!学!报图 M! 双重荧光定量 $VC 体系标准曲线 X M!# *12*. 2= < <D, 8. *, 9 :-$VC >L 图 N!(7D 特异性试验结果曲线 X N!)7 -*:D, 5 = * 41= < = 5 =8D. :-1 0 >L D 图 K! 荧光定量 $VC 体系敏感性试验 X K!# *, 9 :-$VC (! 卷!

5 期武昱孜等猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量检测方法的建立 + 重复性试验将 D, * D, + D, 拷贝 = 个不同浓度的 * + &$ % 质粒和个不同浓度的 * + '! 质粒合并将混合物作为模板进行次批内和批间平行试验根据计算变异系数 ( 衡量该方法的重复性如表所示该方法批内试验和批间试验的变异系数均小于 + 本研究所建立的 * + &$ % 和 * + '! 双重荧光定量检测方法具有很好的重复性表荧光定量 8+ 的批内和批间检测结果 % $ $ $ $ " $"#, & '$ 8+ 菌株浓度拷贝 = 变异系数 ( #' % % % #' % & '% '# " = 批内试验 0% #'' ' 批间试验 0% #' ' D, *,),,)+ * + &$ % D, +,), ) D,,), )+ D, *,) ) * + '! D, +,) )* D,,) )* ) 临床样本检测, 份肺样本 +, 份鼻拭子份支气管肺泡灌洗液 ; 经双重体系检测出 * + &$ % 肺阳性率, 鼻拭子阳性率支气管肺泡灌洗液阳性率 +) * + '! 肺阳性率, 鼻拭子阳性率 ** 支气管肺泡灌洗液阳性率 )* 如表所示表双重荧光定量 8+ 和普通 8+ 检测临床样品的结果 % $"#$%, & '$ 8+ "! $ " 8+$ $ "#, 双重荧光定量 "!# ' $ 普通 %3 % %' 肺 = % 鼻拭子 ' ' 7'( 支气管肺泡灌洗液 = 肺 = % 鼻拭子 ' ' 7'( 支气管肺泡灌洗液 = * + &$ %,, +, +),, +, + * + '!,, +,** + )*,, +, ) 表中数值是阳性总数百分比. 3' %. '( '# 3 ' '$" ) = ) # %. ' 3 '# '3' & 通过试验对比本研究建立的 * + &$ % 和 * + '! 双重荧光定量比普通方法更敏感特异且具有较好的临床实用性可用于临床样品的检测讨论 * + &$ % 和 * + '! 已成为猪场的常见病和多发病常发生混合感染及其后的继发感染严重危害养猪业的发展越来越多的研究人员开始研究其致病机制而如何有效地防控猪支原体疾病也已成为重要的课题近年来新的检测方法不断应用于猪源支原体的检测现阶段实验室检测主要以分离培养 =0; 等免疫学方法及荧光定量等常规分子生物学方法为主支原体较难分离培养且培养速度缓慢需要周甚至更长时间才能在显微镜下观察到支原体的形态另外在样本采集后运输过程分离培养等各环节都需要苛刻的温度和湿度很容易在培养过程中发生死亡或丢失导致分离培养失败出现假阳性的结果因此不能为临床提供及时的诊断普通仪器和试剂相对较廉价对于条件相对简单的基层实验室普通检测方法仍有一定的实用

6 * 畜牧兽医学报卷性但敏感性低无法对未知样本进行定量因此很大程度上限制了的应用荧光定量操作简便敏感性好不需要后处理降低了污染的可能性还实现了对检测样本的准确定量双重荧光定量是在荧光基础上衍生出来的更加高效经济操作便捷的检测技术对待检病原的不同基因做不同荧光标记以达到一次反应就可以检测多种病原目前双重荧光定量广泛应用于动物疫病的检测及诊断食品安全检验等领域根据实验室前期研究 * + &$ % 和 * + '! 普通均可检测到, 拷贝 = 单重的荧光定量均可检测到, 拷贝 = * + 本研究参照 )=) #' 等武昱孜等建立的荧光定量检测方法通过荧光信号强度较高且干扰较小的 ; 和!' 两种不同的荧光信号建立双重荧光定量检测方法能在. 内同时鉴定区分 * + &$ % 和 * + '! 且敏感性也可达到单重荧光定量的最低检出限, 拷贝 = 双重荧光定量检测 * + &$ % 和 * + '! 的标准曲线的相关系数分别达,),)+ 具有较高的准确性和良好的稳定性检测不同浓度的 ; 样本时 * + &$ % 和 * + '! 基因在同一个体系中进行扩增效率基本相同且 ;!' 这种荧光信号同时收集不存在相互干扰的现象稳定性良好更有效地简化了试验过程国内外尚未见有关于荧光定量方法同时检测 * + &$ % 和 * + '! 两种猪支原体的研究报道本研究建立同时鉴别诊断种猪主要支原体检测方法大大缩短检测时间提高了检测的准确性很有应用前景应用所建立的方法对江苏省发病猪场采集的, 份肺样本 +, 份鼻拭子份支气管肺泡灌洗液进行了检测双重荧光定量可以显著提高临床样本中 * + &$ % 和 * + '! 的检出率定量方法的阳性率明显高于定性方法两种方法的结果显示多数的样本同时感染了 * + &$ % 和 * + '! 可能此次采集的几个猪场发病猪存在混合感染的现象猪群中混合感染及其后的继发感染现象比较普遍用此方法检测 * + &$ % 和 * + '! 可以大大缩短检测时间本次研究所收集的临床样本数量有限后期将会收集更多的临床样品进行验证进一步改进和完善本方法的临床应用结论根据猪肺炎支原体序列和猪鼻支原体序列的特异性引物分别标记 ; 和!' 荧光报告基团的条 '2$'% 探针优化双重实时荧光定量反应条件和体系建立了同时鉴别诊断猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量该方法这两种病原体的最低检测值均为, 拷贝 = 与猪源致病菌病毒和其他常见细菌均无交叉反应重复性好临床样本检测结果表明建立的双重荧光定量方法比普通更加敏感实用性强可用于临床样品的检测参考文献 + # : ; : <: ' )= % '% ' #( #% #'% " # & %& 1 '% *+ &%!% + &$ %&# $ ' 7 % " " ' % % & 7.$ " 3 #' 3'# '% )("* ',,+,) 于艳霞王成达王芳 ) 浅谈猪支原体肺炎的控制综合防控措施 ) 吉林畜牧兽医, ) >8 >-; -; ) '#."# # '%. % #' "# 3 % %'% % #.% 2 &$ " ' $'"% $ % ' )# % $! % '+% ("'%'+*, ) %. % 邵国青 ) 我国主要动物支原体病研究述略与展望 ) 畜牧与兽医,,, ) ;:?) # &# 3 7 &# '#. % $" # '% '% $' " '$' ' %. %' )% $! % '+ ) ("'%'+ *,,, ) %. % ; ; : 8 ; 8 : ; :: ' ) $"'# % & % "# # &*+ &%!% + &$ %*+ &%!% +!+ %'% *+ &%!% + '! % % % '% % 3 ' & & '. # " '%. # # ( % %.' '% ) ' & %" ', ) + 程跃红余华邓小红等 ) 猪支原体病的流行及防控策略 ) 安徽农业科学,* ) > >8 ' ) #'

7 期武昱孜等猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量检测方法的建立 &"# 3 % %'% % # & *+ &%!% + &$ % # # $'% $ ' $"$'%!,* ) %. % * 华利忠邵国青周勇岐 ) 以疫苗免疫为核心的猪气喘病控制与净化技术 ) 中国兽药杂志, * +,+) 8;=< ;:?< :8 >?) % # '% #' ' % &*+ &%!% + &$ % (' % 3' % $$ % 5' % )!# $'% ("' %'+1'$, *+,+) %. % -: : 0=; ) #'% $ % &' % &. " # % # " #' # ' $"! ( 7 % 7 %. # '# 3 7) '# '% #'% $ %( '% $' % ' )1"! '%'5"! ',, * ) 顾玉芳谢磊 ) 猪支原体肺炎临床病例病理分析 ) 长江大学学报自然科学版, ) 8 > 0 =) % ' "'. ' '%' & *+ &%!% + &$ % )# $'% % "5'!"+ %" % ", ) %. % 杨莉杨茂生吴位珩等 ) 猪气喘病的研究进展 ) 上海畜牧兽医通讯,*) >; =>; -8 - ' ). # '#."# # &" '.$' ) % %# $'% % $! % '+ % ("'%'+ *,*) %. %, 王占伟熊琪琰邵国青 ) 猪鼻支原体与猪地方性肺炎 ) 中国人兽共患病学报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武昱孜张旭白方方等 ) 猪鼻支原体种核酸检测方法的临床应用比较 ) 中国预防兽医学报,+ +) -8 ><< ; ;0 ' ) 3' ' % % % ' '"" ' % &.# % ' '$" & ' % ' ' & #. % &*+ &%!% + '! )!# $'% '"("'%'+ *,+ +) %. %, 8 =08-8 >< ' ) 3 "$ % & ' "$ '. #$' '$" & ' % ' ' & # #'" % & *+ &%!% + '! ) %,+ *) ;0 0-0:?>- 0> ' ) % ' %'% % & ' % &* + '! ' '% $"'# % &. #'% $ # ( ' " ( $$ % % '% 3 # % )("'%' %, ) :?8 10== 1 8> ' ) 2 % " % &*+ &%!% + '! #' % % & ( '# ' $ '2 '% ' ' )# * ',+ +**

8 畜牧兽医学报卷 *) ; 0 0 ; ' ):" $ 5 "# & #$ "!% " $ #'.' %# ' % '% & # % ' % & $! &%'%!$! "'&" $!!$!'% *+ &%!% + '! %& # $' %&! "'#'& % $( &# $" 7. " # ) % # ("!, * +,,) ;0 = ; = 0 0: ' ) ' $ ' ' ' # % 3 # '$ % #' % &*+ &%!% + &$ % )# * ',,* ) + 白方方武昱孜刘茂军等 ) 猪鼻支原体 '2 '% 探针荧光定量方法的建立 ) 中国预防兽医学报,+,*) ;0-8 ><=08 ' ) 3 "$ % & %2 '% "# ( # ' $ & # % & *+ &%!% + '! )!# $'% ' "("'%'+ *,+, *) %. % * 刘茂军李冬梅邵国青等 ) 猪肺炎支原体鉴定方法的建立 ) 金陵科技学院学报,,,) =08 =0 ;:? ' ) '(.$ % & $. & #. % & ' % &*+ &%!% + &$ % )# $'% #!""$" +,,,) %. % 张旭白方方武昱孜等 ) 技术检测猪肺炎支原体的研究进展 ) 生物技术通报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编辑白永平

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

畜 牧 兽 医 学 报 卷 = & #*+ &%!% + &$ %'% *+ &%!% + '!). # 7' % # # ' %7.. # $$ %3 #' '% (' # ' "'. % ). % % #' % & '% '# & % &3'# ' % & "3' 7'.'%+ % ' % #

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