ClonExpress ultis One Step Cloning Kit C113 www.vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 7.1
目录 Contents 01/ 产品概述... 02 02/ 产品组分... 02 03/ 保存条件... 02 04/ 适用范围...... 02 05/ 自备材料... 02 06/ 实验流程概要... 03 07/ 实验步骤... 03 07-1/ 线性化载体制备...... 03 07-2/ 插入片段获得... 04 07-3/ 线性化载体与插入片段的使用量... 05 07-4/ 重组反应... 06 07-5/ 重组产物转化... 07 07-6/ 重组产物鉴定... 07 08/ 注意事项... 09 09/ 常见问题与解决方案... 10 01
01/ 产品概述 ClonExpress 技术是一种简单 快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术, 可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点 使用任意方式将载体进行线性化, 在插入片段正 / 反向 PCR 引物 5 端引入线性化载体的末端序列, 使得 PCR 产物 5 和 3 最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列 (15 bp - 20 bp) 这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化载体按一定比例混合后, 在重组酶的催化下,37 反应 30 min 即可进行转化, 完成定向克隆 ClonExpress ultis 作为新一代的重组克隆试剂盒, 专门针对多片段重组反应进行优化, 可以一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆 该试剂盒独特的非连接酶依赖体系, 极大地降低了载体自连背景, 且无需考虑插入片段自身携带的酶切位点 ; 高度优化的反应缓冲液及增强的重组酶 Exnase ultis, 可显著提高克隆的重组效率与对杂质的耐受度, 使得线性化载体与插入片段不进行纯化直接用于重组克隆成为可能, 极大的简化了实验步骤 02/ 产品组分 组分 5 CE ultis Buffer Exnase ultis puc19 control vector,linearized (50 ng/μl) Control insert ix* * 0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl C113-01 (10 rxn) 40 μl 20 μl 5 μl 5 μl C113-02 (25 rxn) 100 μl 50 μl 5 μl 5 μl 03/ 保存条件 - 20 保存 使用过程中避免反复冻融 04/ 适用范围 快速克隆 高通量克隆 无缝克隆 DNA 定点突变 05/ 自备材料 片段扩增用模板 引物 ; 线性化载体 高保真聚合酶 : Phanta ax Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme #P505) 或其他等效产品 感受态细胞 : 克隆菌株制备的化学感受态细胞 DH5α Competent E.coli Strain (Vazyme #C502) 常规克隆, 适用于 <15 kb 质粒 ; XL10 Competent E.coli Strain (Vazyme #C503) 大片段克隆, 适用于 >10 kb 质粒 ; 其他材料 :ddh 2O PCR 管 PCR 仪等 02
06/ 实验流程概要 Fragments Preparation (2 hr) Recombination (30 min) Transformation (1 hr) Vector A Linearize Linearized Vector C D B PCR B PCR B PCR Exnase ultis A 载体线性化 : 通过酶切或反向 PCR 获得线性化载体 B 插入片段获得 : 由 PCR 制备, 所用扩增引物在设计时需在其 5 端添加同源序列 ( 图中以深蓝色 深灰色 浅蓝色和红色标记 ), 使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有一段同源序列 C 重组反应 : 将线性化载体和各插入片段按比例混合, 在 Exnase ultis 催化下, 37 反应 30 min 即可完成重组反应, 实现多个线性化 DNA 的体外环化 D 转化感受态细胞 : 重组产物直接进行转化, 平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选 Fig 1. ClonExpress ultis 多片段拼接克隆技术原理 07/ 实验步骤 07-1/ 线性化载体制备 1. 2. 选择合适的克隆位点, 对载体进行线性化 推荐尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆 当载体克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量均在 40% - 60% 之间时, 重组效率将达到最大 载体线性化方式 : 可以选择限制性内切酶酶切消化, 或反向 PCR 扩增 酶切制备线性化载体时, 推荐使用双酶切方法使载体线性化完全, 降低转化背景 ( 假阳性克隆 ); 若使用单酶切线性化, 请适当延长酶切时间以减少环状质粒残留, 降低转化背景 ClonExpress ultis 重组反应体系内无 DNA 连接酶, 不会引发载体自连 因此, 即使是单酶 切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理 重组产物转化后出现的假阳性克隆 ( 无插入片段 ), 是由未线性化环状载体转化而形成 如果假阳性克隆比例较高, 推荐重新制备线性化载体 反向 PCR 扩增制备线性化载体时, 推荐使用高保真聚合酶 Phanta ax Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme #P505) 进行载体扩增, 以减少扩增突变的引入 50 μl 的 PCR 反应体系中, 推荐使用 0.1 ng - 1 ng 环状质粒模板, 或使用预线性化质粒作为模板, 以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响 03
07-2/ 插入片段获得 1. ClonExpress ultis 引物设计的总原则 : 通过在引物 5 端引入同源序列, 使扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列 (15 bp - 20 bp 不包括酶切位点 ) 推荐登陆诺唯赞官网下载引物设计软件 CE Design(http://www.vazyme.com), 自动生成插入片段的扩增引物 若手动设计, 可参照以下实例 : 以试剂盒所提供对照体系 ( 在 puc19 载体的 EcoR I 和 Hind III 酶切位点间插入三段基因, 长度分别为 0.5 kb 1 kb 2 kb 的插入片段 ) 的部分引物设计为例, 引物具体设计方案如下 : 其中, 两侧片段与载体重组端的引物设计方式为 : 最上游片段正向扩增引物 : 5 -- 上游载体末端同源序列 + 酶切位点 ( 可保留或删除 ) + 基因特异性正向扩增引物序列 --3 最下游片段反向扩增引物 : 5 -- 下游载体末端同源序列 + 酶切位点 ( 可保留或删除 ) + 基因特异性反向扩增引物序列 --3 基因特异性正 / 反向扩增引物序列即常规插入片段正 / 反向扩增引物序列,Tm 值 60 ~ 65 为佳 ; 上 / 下游载体末端同源序列即线性化载体最末端序列 ( 用于同源重组 ),GC 含量 40% - 60% 为佳 0.5 kb 1 kb 2 kb puc19 2.7 kb puc19 克隆位点上游载体序列 puc19 克隆位点下游载体序列 15 bp EcoR I 5 ------- CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTC AAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGC --- ----3 3 ------- GCAACATT GCTGCCGGTCACTTAAG TTCGAACCGCATTAGTACCAGTATCG --- ----5 Hind III 15 bp 15 bp EcoR I 0.5 kb 正向扩增序列 0.5 kb 正向扩增序列为 : 5 ------- AAAACGACGGCCAGTGAATTCATCAGTCATTTCTCGCACATTG ------- 3 2 kb 反向扩增序列为 : 3 ------- GCCCGTGACTTAGTACCTTCGAACCGCATTAGTACCAG ------- 5 2 kb 反向扩增序列 Hind III 15 bp Fig 2. 最上游的正向扩增引物和最下游的反向扩增引物设计方案 如果最终引物长度超过 40 bp, 推荐在引物合成时选用 PAGE 纯化, 可提高克隆成功率 计算扩增引物退火温度时, 只需计算基因特异性扩增序列的 Tm 值, 引入的同源序列及酶切位点不应参与计算 中间各插入片段之间的引物设计方式有以下三种 : a. 以前一片段 3 端 15 bp - 20 bp 作为同源序列添加至后一片段 5 端 ; b. 以后一片段 5 端 15 bp - 20 bp 作为同源序列添加至前一片段 3 端 ( 如 Fig 3 所示 ) ; c. 两片段各取一部分作为同源序列 ( 总计 15 bp - 20 bp), 分别添加至另一片段末端 04
0.5 kb 1 kb 2 kb puc19 2.7 kb 0.5 kb 片段 3 末端序列 1 kb 片段 5 末端序列 1 kb 正向扩增引物为 :5 -- GCAGCTTGCATCCATTGCATCG -- 3 5 -- AACCCATTGACCTCCAACCCCGTAA -- 3 3 -- TTGGGTAACTGGAGGTTGGGGCATT -- 5 0.5 kb 特异性反向扩增序列 1 kb 特异性正向扩增序列 5 -- GCAGCTTGCATCCATTGCATCGCTT -- 3 3 -- CGTCGAACGTAGGTAACGTAGCGAA -- 5 20 bp 1 kp 片段 5 端同源序列 0.5 kb 反向扩增引物为 :3 -- ACTGGAGGTTGGGGCATT + CGTCGAACGTAGGTAACGTA -- 5 Fig 3. 最上游的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计方案 3. 如果最终引物长度超过 40 bp, 推荐在引物合成时选用 PAGE 纯化, 可提高克隆成功率 计算扩增引物退火温度时, 只需计算基因特异性扩增序列的 Tm 值, 额外引入的同源序列不参与计算 插入片段 PCR 扩增 插入片段可用任意 PCR 酶 (Taq 酶或高保真酶 ) 扩增, 无需考虑产物末端有无 A 尾 ( 重组过程中将被去除, 在最终载体中不会出现 ) 但为了减少扩增突变的引入, 推荐使用高保真聚合酶 Phanta ax Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme #P505) 进行扩增 07-3/ 线性化载体与插入片段的使用量 1. 浓度测定 : ClonExpress 同源重组体系推荐使用电泳比较条带亮度的方法对 DNA 进行定量 若线性化载体与各插入片段已通过高质量的试剂盒进行胶回收纯化, 且经电泳检测无明显杂带或 Smear 残留时, 也可使用 Onedrop 等基于吸光度的仪器进行浓度测定, 但只有当 A260/A280 在 1.8-2.0 之间时浓度值可信 当样品浓度低于 10 ng 时, 不同型号的仪器基于 A260 得到的浓度值可能存在较大差异, 推荐使用 Qubit PicoGreen 等进行浓度测定 未经纯化的线性化载体或各插入片段, 请务必按照下图所示, 通过电泳比较条带亮度的方法对 DNA 进行定量 将线性化载体和插入片段分别做数个梯度稀释后, 原液和稀释后产物各取 1 μl 进行电泳, 与标准的 DNA 定量 arker( 条带浓度均一且确定 ) 比较条带亮度以确定其近似浓度 稀释倍数 puc19 酶切产物 0 2 4 0.5 kb 扩增产物 0 2 4 8 1 kb 扩增产物 0 2 4 8 2 kb 扩增产物 0 2 4 8 3.0 kb 1.5 kb 1.0 kb 0.5 kb Fig 4. 线性化载体和插入片段凝胶电泳浓度检测 05
:DL5,000 arker 上样 5 μl, 除 1.0 kb 条带为 100 ng 以外, 其余条带 DNA 量均为 50 ng 图中黄色框 / 橙色框 / 白色框 / 蓝色框分别标记线性化载体与各插入片段在某个稀释梯度下与相近大小的 arker 条带亮度相似 因此 : Vector 浓度约为 :50 ng 2 = 100 ng/μl; 0.5 kb 扩增产物浓度约为 :50 ng 8 = 400 ng/μl; 1 kb 扩增产物浓度约为 :100 ng 4 = 400 ng/μl; 2 kb 扩增产物浓度约为 :50 ng 8 = 400 ng/μl 2. 载体 片段使用量计算 : ClonExpress ultis 重组反应体系最适 DNA 使用量为每个片段 ( 包括线性化载体 ) 各 0.03 pmol 该摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得 : 每个片段最适使用量 = [0.02 片段碱基对数 ] ng(0.03 pmol) 例如, 将长度分别为 0.5 kb 1 kb 2 kb 的插入片段克隆至长度为 5 kb 的克隆载体时, 载体与各片段最适使用量为 : 线性化克隆载体最适使用量 :0.02 5000 = 100 ng; 0.5 kb 插入片段最适使用量 :0.02 500 = 10 ng; 1 kb 插入片段最适使用量 :0.02 1000 = 20 ng; 2 kb 插入片段最适使用量 :0.02 2000 = 40 ng; a. 线性化克隆载体的使用量应在 50 ng - 200 ng 之间 当使用上述公式计算 DNA 最适使用量超出这个范围时, 直接选择最低 / 最高使用量即可 b. 各插入片段的使用量应大于 10 ng 当使用上述公式计算最适使用量低于这个值时, 直接使用 10 ng 即可 c. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行 DNA 纯化直接使用时, 加入总体积应不超过反应体系体积的 1/5, 即 4 μl 07-4/ 重组反应 1. 根据公式计算重组反应所需 DNA 量 为了确保加样的准确性, 在配制重组体系前可将线性化载体与插入片段做适当稀释, 各组分加样量不低于 1 μl 2. 于冰上配制以下反应体系 : 组分 重组反应 阴性对照 -1 b 阴性对照 -2 c 阳性对照 d 线性化载体 a n 个插入片段 a 5 CE ultis Buffer Exnase ultis ddh2o X μl Y1-Yn μl 4 μl 2 μl to 20 μl X μl 0 μl 0 μl 0 μl to 20 μl 0 μl Y1-Yn μl 0 μl 0 μl to 20 μl 1 μl 1 μl 4 μl 2 μl to 20 μl a. b. c. d. X/Y 根据公式计算得到载体用量和各插入片段用量 阴性对照 - 1 可用来确认线性化克隆载体中有无环状质粒残留, 推荐进行 阴性对照 - 2 当插入片段扩增模板是与克隆载体抗性相同的环状质粒时, 推荐进行 建议将线性化载体与插入片段的环状质粒残留检测独立进行 阳性对照反应可用来排除其他实验材料及操作因素的影响 06
3. 使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀) 短暂离心将反应液收集至管底 挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定 扩增引物至少使用一条载体上的通 用测序引物 如果克隆正确 应有长度略大于插入片段大小的条带出现(Fig 6) 4. 37 反应30 min 降至4 或立即置于冰上冷却 推荐在PCR仪等温控比较精确的仪器上进行反应 重组效率在反应30 min左右达到最高 反应 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 时间不足或者太长都将会降低克隆效率 重组产物可于-20 存放一周 待需要时解冻转化即可 3.5 kb 07-5/重组产物转化 1. 在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞(如 DH5α Competent E.coli Strain Vazyme #C502) 2. 取10 μl重组产物加入到100 μl感受态细胞中 轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀) 冰上静置 30 min 重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/6 Fig 6. 菌落PCR琼脂糖凝胶电泳检测 3. 42 水浴热激45 sec后 立即置于冰上冷却2-3 min DL5,000 arker 1-17 16个阳性克隆 4. 加入900 μl SOC或LB培养基(不添加抗生素) 37 摇菌1 h (转速200-250 rpm) 5. 将相应抗性的LB平板固体培养基在37 培养箱中预热 6. 5,000 rpm离心5 min 弃掉900 μl上清 用剩余培养基将菌体重悬 用无菌涂布棒在含有 正确抗性的平板上轻轻涂匀 菌落PCR鉴定为阳性的菌落 可再将剩余菌液接种至含有适当抗生素的液体LB培养基中培 养过夜 提取质粒进行酶切鉴定(Fig 7) 或直接进行一代测序 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 7. 37 培养箱中倒置培养12-16 h 3.4 kb 2.0 kb 07-6/重组产物鉴定 0.7 kb 过夜培养后 重组反应转化平板上形成数百个单克隆 而阴性对照反应转化平板上的克 隆数应显著少于前者(Fig 5) 重组反应转化板 阴性对照转化板 Fig 7. 酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测 DL5,000 arker 1-17 16个阳性克隆 07 08 www.vazyme.com Fig 5. 过夜培养的平板
3. 使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀) 短暂离心将反应液收集至管底 挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定 扩增引物至少使用一条载体上的通 用测序引物 如果克隆正确 应有长度略大于插入片段大小的条带出现(Fig 6) 4. 37 反应30 min 降至4 或立即置于冰上冷却 推荐在PCR仪等温控比较精确的仪器上进行反应 重组效率在反应30 min左右达到最高 反应 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 时间不足或者太长都将会降低克隆效率 重组产物可于-20 存放一周 待需要时解冻转化即可 3.5 kb 07-5/重组产物转化 1. 在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞(如 DH5α Competent E.coli Strain Vazyme #C502) 2. 取10 μl重组产物加入到100 μl感受态细胞中 轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀) 冰上静置 30 min 重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/6 Fig 6. 菌落PCR琼脂糖凝胶电泳检测 3. 42 水浴热激45 sec后 立即置于冰上冷却2-3 min DL5,000 arker 1-17 16个阳性克隆 4. 加入900 μl SOC或LB培养基(不添加抗生素) 37 摇菌1 h (转速200-250 rpm) 5. 将相应抗性的LB平板固体培养基在37 培养箱中预热 6. 5,000 rpm离心5 min 弃掉900 μl上清 用剩余培养基将菌体重悬 用无菌涂布棒在含有 正确抗性的平板上轻轻涂匀 菌落PCR鉴定为阳性的菌落 可再将剩余菌液接种至含有适当抗生素的液体LB培养基中培 养过夜 提取质粒进行酶切鉴定(Fig 7) 或直接进行一代测序 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 7. 37 培养箱中倒置培养12-16 h 3.4 kb 2.0 kb 07-6/重组产物鉴定 0.7 kb 过夜培养后 重组反应转化平板上形成数百个单克隆 而阴性对照反应转化平板上的克 隆数应显著少于前者(Fig 5) 重组反应转化板 阴性对照转化板 Fig 7. 酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测 DL5,000 arker 1-17 16个阳性克隆 07 08 www.vazyme.com Fig 5. 过夜培养的平板
08/ 注意事项 1. 2. 3. 重组产物冰上冷却后, 可直接转化化学感受态细胞, 推荐使用商业化的超级感受态 ( 转化效率 >10 8 cfu/μg) 进行转化, 重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的 1/6 ClonExpress ultis 试剂盒可高效克隆 50 bp - 10 kb 片段 载体和插入片段的使用方式 : 片段数较少 (2-3 个插入片段 ) 且片段总长度较短 (<5 kb) 时 : 酶切线性化的载体可通过加热失活内切酶 ( 绝大多数内切酶适用, 具体失活方式参见内切酶使用说明书 ) 后直接用于重组反应 ; 反向 PCR 扩增制备的线性化载体, 如扩增模板经预线性化处理且 PCR 产物电泳条带单一, 扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应 对于插入片段, 若琼脂糖电泳检测结果显示扩增产量足够且条带特异, 同时扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒, 扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应 不同情况下线性化载体与插入片段的使用方法可查阅 Table 1 / Table 2 Table 1. 线性化载体的使用方法 线性化载体制备方式 模板类型 快速实验方案 最佳实验方案 酶切消化制备 环状质粒 加热失活内切酶后直接使用 胶回收 PCR 制备 扩增特异 环状质粒 预线性化质粒 基因组 cdna Dpn I 消化后直接使用 ( 降解扩增模板 ) 直接使用 胶回收或者 Dpn I 消化后胶回收 胶回收 有明显非特异性扩增 胶回收 Table 2. 扩增产物的使用方法 PCR 扩增情况 PCR 模板类型 快速实验方案 最佳实验方案 特异性扩增 与克隆载体抗性相同的环状质粒 Dpn I 消化后直接使用 ( 降解扩增模板 ) 胶回收或者 Dpn I 消化后胶回收 预线性化质粒 基因组 cdna 直接使用 有明显非特异性扩增 胶回收 直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时, 使用体积不应超过 4 μl ( 重组反应总体积的 1/5) 插入片段扩增产物经 Dpn I 消化后,85 加热 20 min 失活 Dpn I 活性, 以避免重组反应时残留 Dpn I 对克隆载体的降解 片段数较多 (4-5 个插入片段 ) 或片段总长度较长 (>5 kb) 时 : 推荐使用高质量的胶回收试剂盒对线性化载体和片段扩增产物进行纯化, 提高载体和插入片段的纯度 09
09/ 常见问题与解决方案 引物如何设计? 1. 引物设计 : 推荐引物设计软件 CE Design, 选择相应模块进行设计 2. 载体的线性化方式有三种 : 双酶切 单酶切 反向 PCR, 优先选择双酶切 3. 引物三部分 : 同源臂 (15 bp - 20 bp, 不计算酶切位点和残留碱基,GC 含量 40% - 60%)+ 酶切位点 ( 根据实验需求保留或者删除 ) + 特异性引物 ( 引物 Tm 值的计算不包括同源臂的序列 ) 平板上未长出克隆或克隆数目很少 1. 引物设计不正确 : 引物包含 15 bp - 20 bp 同源臂 ( 不计算酶切位点 ),GC 含量 40% - 60% 2. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足 / 过量, 或者比例不佳 : 尽量按照说明书中推荐的量和比例配制重组反应体系 3. 载体和插入片段不纯, 抑制反应 : 未纯化 DNA 使用体积不应超过 4 μl( 反应体系体积的 1/5); 建议线性化载体 PCR 产物进行凝胶回收纯化, 纯化产物溶解在 ph 8.0 的 ddh 2O 中 4. 感受态细胞效率低 : 感受态细胞的转化效率需大于 10 7 cfu/μg 可进行简单检测, 转化 1 ng 质粒, 取 1/10 进行涂板, 生长 1000 个菌斑, 估算转化效率为 10 7 cfu/μg; 重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的 1/6, 否则会降低转化效率 ; 选择克隆用感受态细胞 ( 如 DH5α/XL10), 不能选择表达感受态细胞 多数克隆不含插入片段或含有不正确的插入片段 1. PCR 产物混有非特异扩增产物 : 优化 PCR 体系, 提高特异性 ; 胶回收 PCR 产物 ; 鉴定更多的克隆 2. 克隆载体线性化不完全 : 可通过阴性对照检测载体是否线性化完全, 优化酶切体系, 提高限制性内切酶使用量 延长酶切反应时间 胶回收纯化酶切产物 3. 反应体系中混入了相同抗性的质粒 :PCR 扩增模板为环状质粒时, 如扩增产物未纯化直接用于重组反应时推荐 Dpn I 消化, 或者对扩增产物进行胶回收纯化 菌落 PCR 无条带 1. 引物不正确 : 推荐使用载体的通用引物进行菌检, 或至少使用一条通用引物 2. PCR 体系或程序不合适 : 没有目的条带也没有空质粒条带, 建议优化 PCR 体系 程序 ; 或者提取质粒, 以质粒做模板 PCR 验证 ; 或者进行酶切验证 3. 重组失败 : 只有空质粒的条带, 说明重组不成功, 载体线性化不完全, 建议优化酶切体系 10
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