Order: Toll-free: / TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD 版本号 : VT Lethal Based Fast Cloning Kit plb 零背景快速克隆试

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町崎阎
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1 Order: Toll-free: / TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD 版本号 : VT Lethal Based Fast Cloning Kit plb 零背景快速克隆试剂盒目录号 :VT205 产品内容产品组成 plb Vector (35 ng/µl) T4 DNA Ligase (3 U/µl) 2 Reaction Solution Blunting Enzyme plb Vector Forward Sequencing Primer (10 µm) plb Vector Reverse Sequencing Primer (10 µm) Control Insert DNA (700 bp, 50 ng/μl) ddh 2 O VT (20 μl) 20 μl 20 μl 100 μl 10 μl 200 μl 200 μl 10 μl 1 ml 保存条件请将试剂盒置于 -20 保存, 避免反复冻融本产品仅供科研使用请勿用于医药临床治疗食品及化妆品等用途

2 产品简介 plb 零背景快速克隆试剂盒是一种阳性选择克隆系统, 可以高效克隆各种 PCR 产物和任何具有平末端或粘性末端的 DNA 片段该试剂盒对磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效阳性选择载体和插入片段连接仅需 5 min 即可获得超过 95% 的阳性重组克隆由具有校正活性的聚合酶 ( 如 :Pfu Polymerase) 扩增的平末端 PCR 产物可直接连入克隆载体由无校正活性的聚合酶 ( 如 :Taq Polymerase) 或聚合酶混合物扩增的 PCR 产物在连接前需用试剂盒提供的热稳定 DNA 平端化酶进行末端平端化 (7 min) 即可连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株试剂盒提供一个新颖的即用型阳性选择克隆载体 plb Vector 该载体含有致死基因( 内含多克隆位点 ), 多克隆位点插入外源片段会引起基因失活, 因此只有转化了重组质粒的细菌才能存活形成克隆菌落而自身环化的 plb Vector 表达致死的毒性蛋白 ( 无外源片段插入 ), 转化后杀死大肠杆菌细胞这种阳性筛选策略无需蓝白斑筛选, 极大地加速了克隆筛选进程产品特点高效快速 : 零背景无需蓝白斑筛选,5 min 快速连接灵敏广泛 : 适合低浓度片段和长片段连接, 适合平 / 粘末端连接不同片段使用量 1. 载体与片段的摩尔比控制在 1:3-1:10, 对于 1kb 以下的片段建议使用 1:3 的比例,1kb 以上的片段建议使用 1:7 的比例 2. 请根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度和片段长度来计算其摩尔比插入片段用量, 可根据以下公式粗略计算 : 插入片段长度插入片段用量 ng =(3~10) 载体长度载体用量 ng 连接体系中 35 ng 的载体, 不同大小的 PCR 产物最佳加入量举例如下 : PCR 产物长度 (bp) 最佳的使用量 (ng) 700 bp 25 ng 2000 bp 165 ng 2

3 使用方法 ( 以下的步骤请在无菌条件下操作 ) 一平末端连接方法 : 用于高保真耐热 DNA 聚合酶产生的具有平末端的 PCR 产物的克隆若由其他耐热聚合酶产生的粘性末端的 PCR 产物进行克隆时, 请先进行平端化, 详见粘末端连接方法本方法也适用于由限制性内切酶产生的平末端的 DNA 片段, 连接前 DNA 片段应使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收, 载体与片段的摩尔比参考不同片段使用量的介绍 1. 按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分组成成分体积目的 PCR 片段 X μl plb Vector(35 ng/μl) 2 Reaction Solution 5 μl T4 DNA Ligase(3 U/μl) ddh 2 O 补足至 10 µl 轻弹离心管以混匀反应液, 短暂离心 3-5 sec 2. 将混合反应液放置室温 (22 ) 反应 5 min 反应结束后, 将离心管置于冰上, 进行后续的转化反应注意 : 如果插入片段长度大于 3 kb, 可以将反应时间最大延长至 30 min 二粘性末端连接方法 : 用于 Taq DNA Polymerase 或含有 Taq DNA Polymerase 的混合酶产生的 3 端带 A 的 PCR 产物的克隆如果 PCR 产物末端的结构不明确, 请使用粘性末端连接方法本方法也适用于由限制性内切酶产生的 5 或 3 带有突出端的 DNA 片段, 连接前 DNA 片段应使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收, 载体与片段的摩尔比参考不同片段使用量的介绍 3

4 1. 按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分, 进行平端化反应组成成分 Insert DNA 2 Reaction Solution Blunting Enzyme ddh 2 O 体积 X μl 5 μl 0.5 μl 补足至 8 μl 轻弹离心管以混匀反应液, 短暂离心 3-5 sec 2. 将混合反应液置于 20 反应 2 min, 然后置于 70 反应 5 min, 放在冰上短暂冷却 3. 向平端化的反应体系中加入下列成分组成成分 plb Vector (35 ng/μl) T4 DNA Ligase (3 U/μl) 体积 4. 将混合反应液置于室温 (22 ) 反应 5 min 反应结束后, 将离心管置于冰上, 进行后续的转化反应注意 : 如果插入片段长度大于 3 kb, 可以将反应时间最大延长至 30 min 对照实验实验方法同粘性末端连接 1. 按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分, 进行平端化反应组成成分 Control Insert DNA (700 bp, 50 ng/μl) 2 Reaction Solution Blunting Enzyme ddh 2 O 体积 0.5 μl 5 μl 0.5 μl 补足至 8 μl 轻轻弹动离心管以混匀内容物, 短暂离心 3-5 sec 2. 将混合反应液置于 20 反应 2 min, 然后置于 70 反应 5 min, 放在冰上短暂冷却 3. 向平端化的反应体系中加入下列成分 4

5 组成成分体积 plb Vector (35 ng/μl) T4 DNA Ligase (3 U/μl) 轻弹离心管以混匀反应液, 短暂离心 3-5 sec 4. 将混合反应液置于室温 (22 ) 反应 5 min 反应结束后, 将离心管置于冰上, 进行后续的转化反应转化 1. 制备含有氨苄青霉素终浓度 100 μg/ml 的 LB 琼脂糖平板将平板放置在 37, 至少预热 20 min 2. 转化 a. 取部分连接产物加到 µl TOP10 感受态细胞中 ( 感受态细胞应刚从 -70 冰箱取出放于冰浴上, 待刚刚解冻时加入连接产物, 连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一 ), 轻弹混匀, 冰浴 30 min( 必要时请使用超螺旋质粒 puc19 同步转化感受态细胞作为对照检测转化效率, 将 0.1 ng puc19 加入另一只感受态细胞管中, 其余的操作步骤与连接产物的转化步骤同步进行 ) b. 将离心管置于 42 恒温 90 sec, 取出管后立即置于冰浴中放置 2-3 min, 其间不要摇动离心管 c. 向离心管中加入 µl 37 预热的 LB( 不含抗生素 ) 培养基,150 rpm 37 振荡培养 45 min 目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达, 使菌体复苏 d. 将离心管中的菌液混匀, 吸取 100 μl 加到含氨苄青霉素的 LB 固体琼脂培养基上, 用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开待平板表面干燥后, 倒置平板,37 培养 h 5

6 检测 1. 常规检测 : 将得到的菌落接种 1-5 ml LB 培养基 ( 含有终浓度为 100 μg/ml 的氨苄青霉素 ) 培养基,37 摇床振荡培养过夜, 保存菌种后提取质粒, 应用 PCR 或酶切方法鉴定插入片段是否正确 Control Insert DNA 的 PCR 鉴定, 请参考以下反应条件 : 95 2 min sec sec 30 cycles sec 72 5 min 4 2. 快速检测 : 挑取菌落直接进行 PCR 检测 ( 具体方法见分子克隆第三版 ) 3. 测序鉴定 : 使用常规或快速方法进行初步的鉴定后进行序列的测定注意事项请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项 1. 转化过程中使用对照片段做对照是非常必要的, 在实验出现问题时可以确定原因 2. 建议留下部分连接产物, 在出现问题后能迅速的补救, 减少不必要的重复实验 3. 涂布用量可根据具体实验作相应调整如转化的 DNA 总量较多, 可取更少量转化产物涂布平板 ; 反之, 如转化的 DNA 总量较少, 可取 μl 转化产物涂布平板如果预计的克隆较少, 可通过离心 (4000 rpm,2 min) 后吸除部分培养液, 留下适量的培养基悬浮菌体后将其涂布于一个平板中 ( 涂布剩余的菌液可置于 4 保存, 如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板 ) plb Vector 测序引物 plb vector Forward Sequencing Primer,23-mer plb vector Reverse Sequencing Primer,24-mer 5 -CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3 5 -AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3 6

7 plb Vector 图谱反应体系标准体系为 10 μl 体积,5 μl 的反应体系也能取得很好的效果, 试剂用量减半 7

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