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1 匠心品质, 快乐科研 分子克隆技术实验流程 Molecular Cloning Workflow 孟文举上海翊圣生物科技有限公司产品主管 Good Science,Good Products

2 通过这场讲座, 您可以了解 : 问题 1: 了解分子克隆常见方法及原理 问题 2: 解决克隆实验的难题, 提升成功率

3 重组 DNA 技术 基因影响性状 定义 : 目的是将不同的 DNA 片段 ( 如某个基因或 基因的一部分 ) 按照人们的设计定向连接起来, 在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达, 产生影响受体细胞的新的遗传性状 也叫分子克隆技术

4

5 主要内容匠心品质, 快乐科研 /Good Products,Good Science 分子克隆实验中的重组质粒 常见的分子克隆方法 15min 完成连接实验 一步法克隆技术的注意事项

6 分子克隆实验中的重组质粒匠第一部分研匠心品质, 快乐科研 /Good Products,Good Science 心品质,快乐科

7 质粒改造之路 天然质粒 :F plasmid 第一个重组质粒 : 第二代重组质粒 : psc101 pbr322

8 重组质粒 puc18/ bp pet-28a 5369bp plenti-puro 7067bp pcmv-luc 6226bp pspcas9-gfp 9325bp 克隆质粒蛋白表达质粒病毒表达质粒报告基因质粒基因敲除质粒

9 重组质粒的组成元件 复制起始位点 Ori 抗性基因 MCS 表达系统元件 标签蛋白 报告基因 决定拷贝数 兼容性选择性标记外源基因插入调控转录 翻译 FLAG His GST Luciferase

10 认识 质粒, 读懂质粒图谱 Promoter Ribosome binding site Amp r MCS Transcription Termination Origin of replication relaxed or stringent neo r 质粒图谱

11 认识 质粒, 读懂质粒图谱 真核生物 常见启动子 原核生物 启动子 RNA 聚合酶转录因子 promoter gene 5' 3' CMV EF1α U6 T7 T7lac

12 分子克隆策略 T 载体 ( 序列分析 ) 表达载体等 ( 功能研究 ) 目的基因 中间载体 终载体 一步法

13 常见的分子克隆方法匠第二部分研匠心品质, 快乐科研 /Good Products,Good Science 心品质,快乐科

14 质粒改造 分子克隆方法 4. Golden Gate Clone 1. TA 克隆 2. 酶切连接克隆 3. TOPO 克隆 连接酶 特殊内切酶混合酶 修饰酶 5. SLIC 克隆方法 重组酶 7. Gateway 克隆 6. 一步法克隆

15 2.TOPO 克隆 克隆载体构建 有时 很重要 1. 传统 TA 克隆 T4 DNA ligase ccdb Amp R TOPO-Vector 1865bp puc origin T-A 配对 : 特异性 依赖布朗运动 Topoisomerse I: 末端活化 ccdb 基因 :suicide gene

16 TOPO 克隆优势 2/ 高效, 大片段成功率高 1/ 简单 快速 3/ 关键点 不能超过 5min?

17 1. 传统克隆方式 T4 DNA ligase T4 DNA ligase

18 2.SLIC 方式 homology insert homology T4 DNA Polymerase 5' Exonuclease 3' A homology dttp 5' 3' Polymerase T A Exonuclease vector

19 3.Golden Gate Assembly 方式 recognition sequence homology 5' 3' GGTCTCNNNNN CCAGAGNNNNN insert 识别序列丢失 BsaⅠ GGTCTCN NNNN CCAGAGNNNNN insert T4 DNA ligase Vector NNNN NNNN insert

20 4.Gateway 克隆方式 方向性 :BP 和 LR 无缝连接 : 否 dedicated vector: 多片段连接 :

21 各种方法的比较 酶切连接克隆方法 SLIC Golden Gate 克隆技术 Gateway 克隆技术 Enzymes ü restriction enzyme ü T4 DNA ligase ü T4 DNA Polymerase ü BsaⅠ ü T4 DNA ligase ü BP Clonase ü LR Clonase Advantages 性价比高 不受酶切位点限制 多片段连接 高通量克隆 多片段连接 高通量克隆 快速 效率高 Disadvantages 克隆效率低 酶切位点选择困难 操作步骤多 操作时间长 实验应用性有限 克隆效率低 受载体限制 应用范围有限 受载体限制 价格昂贵 步骤较繁琐 1-4 个片段的连接 Applications CAS9 载体构建高通量构建

22 完成连接实验匠第三部15min 分研匠心品质, 快乐科研 /Good Products,Good Science 心品质,快乐科

23 一步法克隆技术的原理 3' 5' 5' 5' 3' 5' Exonuclease 5' 3' Annealing 5' 3' Extension High Fidelity Polymerase Repair DNA ligase

24 一步法克隆技术的实验流程 1 质粒线性化 质粒载体 2 插入片段的制备 线性化质粒 线性化方式 : 酶切或者 PCR 酶切产物纯化 : 胶回收 引物设计 带末端同源序列的插入片段 引物设计 :15bp 载体重叠序列 PCR 产物纯化 : 单一产物 ( 建议纯化 ) 3 片段重组 & 产物转化 线性化载体 / 插入片段 :1:2-1:3 反应条件 :50 15min 感受态细胞 :10 8 cfu/ug

25 一步法克隆技术更加简便 快速 传统方法 片段扩增片段纯化片段酶切 产物纯化 连接 转化 克隆鉴定 载体酶切 产物纯化 One Step 片段扩增片段纯化 15min 连接转化 克隆鉴定 载体酶切 产物纯化

26 连接时间 :15-30min 载体 / 片段比 :1:2-1:4 插入片段范围 : 几百 bp- 8kb 载体 :pfastbac1,4.7 kb 载体 :pcdh,8 kb

27 一步法克隆技术的应用 例 : 某疾病模型机制研究时, 需要构建 K 基因点突变模型, 观察点突变前后疾病严重程度变化 点突变载体 构建策略 Chromosome K13 5 UTR K13 ORF (2217b) K13 3 UTR K13 point mutation

28 一步法克隆技术的应用 例 : 某疾病模型机制研究时, 需要构建 K 基因点突变模型, 观察点突变前后疾病严重程度变化 vector 点突变载体 构建策略

29 构建策略 : Vector arm1 1 突变点的引入 2 多个片段的连接 3' UTR Vector arm1 K13 3' UTR arm1 3' UTR

30 多片段重组 载体 :pcamiba1302,10kb 载体量 :160ng/20μl 反应体系重组反应条件 50,20min

31 一步法克隆技术的优势 高效 快速 阳性克隆率达 90% 以上 15min 完成连接反应 简单 片段制备简单, 无需酶切 限制因素少 不受酶切位点限制 应用广泛 单片段 多片段 点突变 成本低

32 一步法克隆技术的注意事项匠第四部分研匠心品质, 快乐科研 /Good Products,Good Science 心品质,快乐科

33 一步法克隆技术的引物设计 重叠序列的 Tm 值 基因扩增的 Tm 值 引物设计工具

34 一步法克隆技术的疑难问题 无克隆生长 克隆数少 1 排除试剂失效 2 引物设计不合适 阳性对照实验 检查序列,GC 含量 无克隆或克隆数较少 3 载体与片段比例错误 重新计算 假阳性率高 4 含抑制剂 载体与片段胶回收 5 感受态细胞问题 1 效率低 ;2 转化体积过大 ; 3 克隆感受态细胞 6 筛选抗生素错误 阳性对照

35 一步法克隆技术的疑难问题 无克隆或克隆数较少 假阳性率高

36 一步法克隆技术的疑难问题 无条带, 菌落 PCR 不含插入片段 无克隆或克隆数较少 有条带, 大小不对 假阳性率高 有条带, 大小正确, 测序错误

37 一步法克隆技术的疑难问题 2. 假阳性率高 无条带, 菌落 PCR 不含插入片段 有条带, 大小正确, 测序错误 插入片段污染质粒 : 设置阴性对照 线性化片段污染质粒 : 设置阴性对照 有条带, 大小不对 插入片段污染模板质粒 : 设置阴性对照 插入片段加入量过大 : 设置以测序引物和基因特异性引物扩 增鉴定 序列同源性 : 不适合, 换传统方法构建 非特异性扩增 : 提高特异性

38 玩转分子克隆, 畅游基因世界 翊圣科技 ( 上海 ) 技术有限公司 techserv@yeasen.com

39 玩转分子克隆, 畅游基因世界 Hieff Clone TOPO-T Kit Hieff Clone TOPO-Blunt Kit Hieff Clone Plus One-Step Clone Kit Hieff Clone Plus Multi One-Step Clone Kit 翊圣科技 ( 上海 ) 技术有限公司 techserv@yeasen.com

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