实时定量PCR的全套解决方案

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联艇鲍
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1 08-03 ScriptMAX TM Thermo T7 Transcription Kit (Code No.:TSK-101) 使用说明书科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN

2 目录 1 前言试剂盒内容试剂盒以外所需物品模板 DNA 的准备 RNA 的合成 RNA 的纯化 RNA 的纯度分析常见问题相关产品... 8 注意本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂请勿作为诊断临床试剂用在使用时, 请严格遵守实验室的一般注意事项, 适当使用保护用品, 安全操作

3 1 前言 ScriptMAX TM Thermo T7 Transcription Kit 是以 Thermo T7 RNA 聚合酶为基础开发的转录试剂盒, 具有很高的 RNA 合成能力 ScriptMAX TM 含有 RNA 合成反应所必需的所有试剂, 包括 RNA 聚合酶和反应缓冲液 Accelerator solution rntps 混合液 RNase 抑制剂等由本试剂盒合成得到的 RNA 可作为无细胞蛋白质合成试剂 [PROTEIOS TM wheat germ cell-free protein synthesis kit] 所用的 mrna, 也可用于其他各种实验另外本试剂盒含有 RNA 转录所必需的最基本组分, 可以配合其他试剂盒一起使用试剂盒的特征 1. 可根据用途合成相应的 RNA 分别针对线型和环状 DNA 模板制定了最合适的实验步骤另外通过添加 Accelerator solution, 可以制备以往浓度 2-4 倍的高浓度 RNA 2. 最适合用于无细胞蛋白合成试剂盒 [ PROTEIOS TM ] 用 mrna 的合成用本试剂盒制备的 RNA, 最适合用于无细胞体外蛋白合成试剂盒 [ PROTEIOS TM ] 用 mrna 的合成为了将凝胶过滤纯化时 mrna 的损失最小化, 本试剂盒对反应液的组成进行了改良 ( 以环状 DNA 作为模板合成 mrna 时, 无需添加 Accelerator solution) 3. 含有反应所需的各种成分除含有聚合酶以外, 本试剂盒还添附了缓冲液 rntps RNase Inhibitor Nuclease-free water 等试剂, 以方便使用 1

4 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 2 试剂盒内容本试剂盒 (20μl 反应 60 次用 ) 中包含以下的试剂 1) 试剂名容量支数 Thermo T7 RNA polymerase(50u/μl) 60μl 1 10 Basal reaction buffer 2)3) 400μl 1 5 Accelerator solution 400μl 1 25mM rntps mixture 280μl 1 RNase Inhibitor(40U/μl) 30μl 1 Nuclease-free water ( 未经 DEPC 处理 ) 1ml 1 1) 所有的试剂请于 -20 保存 2) 可能产生的白色沉淀物并非品质问题可于 37 放置 5 分钟左右, 用力搅拌使之完全溶解, 不会影响使用效果 3) 在本试剂盒中添附的 10 Basal reaction buffer 和本公司生产的 Thermo T7 RNA polymerase (TRL-201) 中添附的缓冲液组分不同 3 试剂盒以外所需物品使用本试剂盒时, 请另外准备如下试剂和样品 : 模板 DNA( 环状或线型 ): 需要注意的是, 模板 DNA 必须具有 T7 启动子位点同时, 模板 DNA 应为 RNase-free 级 Nuclease-free water: 本试剂盒添附如因稀释样品需大量使用时请另行准备 ( 通常可以使用灭菌蒸馏水 ) RI 核酸标记 : 如欲对合成的 RNA 通过 [α- 32 P]UTP 等方法进行标记, 请另行准备本试剂盒中添附的 rntp 是预先混合的, 请另外准备未经混合的 ratp, rctp, rgtp, rutp( 参见 9 相关产品) RNase-free DNase l: 转录反应液中所含有的模板 DNA 相对于反应生成的 RNA 而言, 浓度非常低多数情况下, 不必除去残留的模板 DNA 请根据具体需要进行准备垂询电话 :

5 4 模板 DNA 的准备模板 DNA 必须要求 RNase-free 级尤其是使用质粒作为模板时, 从菌体抽提质粒的过程中如使用了 RNase, 必须通过苯酚氯仿处理等方法除去 RNase 5 RNA 的合成方法 A 适用于以下用途 : 以线型 DNA 为模板,[ PROTEIOS TM ] 用 mrna 的合成 1) ; 大量合成 trna,rrna,ribozyme,anti-sense RNA 等 ; RNAi 用双链 RNA 的合成 1. 根据以下组成配制反应液, 轻轻混匀 2) 10 Basal reaction buffer 5 Accelerator solution 25mM rntps mixture RNase Inhibitor Template DNA Thermo T7 RNA polymerase Nuclease-free water Total volume 2 μl 4 μl 4.5 μl 0.5 μl 100ng-1 μg 1μl up to 20μl 20 μl 2. 在下放置 2 小时 3) 1) 以环状质粒为模板制备无细胞蛋白合成试剂盒 [ PROTEIOS TM ] 用 mrna 时, 请参考方法 B 如根据方法 A 来制备, 会降低蛋白质合成的量 2) 反应液的配制须在室温下进行如在低温下配制, 缓冲液中的亚精胺和 DNA 容易形成沉淀, 会降低反应效率 3) 本试剂盒中添附的 RNA 聚合酶是耐热性酶 Thermo T7 RNA Polymerase TT7 和野生型酶相比较, 在高温下的稳定性得到了改良, 可适用于更宽的温度区间 ( 请参见下页图 ) 3

6 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司方法 B 适用于以下用途 : 以环状 DNA 为模板,[ PROTEIOS TM ] 用 mrna 的合成 1) ; 探针标记等高特异性少量 RNA 的合成 1. 根据以下组成配制反应液, 轻轻混匀 2) 10 Basal reaction buffer 25mM rntps mixture RNase Inhibitor Template DNA Thermo T7 RNA polymerase Nuclease-free water Total volume 2 μl 2 μl 0.5 μl 1-2 μg 1μl up to 20μl 20 μl 2. 在下放置 2-4 小时 3) 1) 以环状质粒为模板制备无细胞蛋白合成试剂盒用 [ PROTEIOS TM ] mrna 时, 请参考方法 B 如根据方法 A 来制备, 会降低蛋白质合成的量 2) 反应液的配制须在室温下进行如在低温下配制, 缓冲液中的亚精胺和 DNA 容易形成沉淀, 会降低反应效率 3) 本试剂盒中添附的 RNA 聚合酶是耐热性酶 Thermo T7 RNA Polymerase TT7 和野生型酶相比较, 在高温下的稳定性得到了改良, 可适用于更宽的温度区间 ( 请参见下图 ) RNA 合成量 ( 相对值 ) TOYOBO ScriptMAX TM B 公司产品 C 公司产品反应温度 ( ) 图 : 反应温度和 RNA 合成量的比较根据方法 A, 在不同温度进行 2 小时的反应和其他公司使用野生型酶制成的试剂盒相比较, ScriptMAX TM 在高温段的 RNA 合成量比较稳定垂询电话 :

7 6 RNA 的纯化合成后的 RNA, 请根据用途采用相应的方法进行纯化这里介绍 [ PROTEIOS TM ] 用 mrna 的标准纯化法本法可能也适用于其它用途的 RNA 的纯化 (1) 凝胶过滤法 1) 1. 参照相应说明书将凝胶混合均匀后注入 G-25 离心柱 ( 如 Amersham Biosciences 公司生产的 MicroSpin TM G-25 Columns 等 ), 装入 1.5ml 微量离心管,3,000rpm 离心 1 分钟, 去除保存液 2. 在离心柱中加入 200μl 缓冲液 2),3,000rpm 离心 2 分钟, 去除溶出液 3. 重复第 2 步一次 4. 将转录后的反应液在 12,000rpm 离心 2 分钟 5. 将 4 的上清上样到离心柱 ( 换用新的离心管 ) 6. 3,000rpm 离心 2 分钟, 溶出 RNA 1) 如果 RNA 合成的反应液不足 50μl, 混合 G-25 凝胶之后, 可适量的吸掉一部分, 或在反应液中用水补足 50μl 进行纯化时, 如果溶液太少, 会降低回收率 2) 如采用 PROTEIOS TM 的 batch 法进行蛋白质合成, 应加入 20mM HEPES-KOH(pH7.6); 如采用 PROTEIOS TM 的重层法进行蛋白质合成, 应加入 PROTEIOS 中添附的 Buffer Mix; 其他用途, 请根据具体情况选用相应缓冲液或水 (2) 乙醇沉淀法 1. 根据需要在转录后的反应液中加入灭菌水 ( 或 Nuclease-Free water) 至 100μl 2. 加入 100μl 的 TE 饱和苯酚 (ph 8.0) 1), 在室温下混合 5 分钟 3.4,12,000rpm 离心 5 分钟 4. 小心将上清液转移到另一个微量离心管, 注意不要吸到中间的变性蛋白质层 5. 在上清液中添加 100μl 的氯仿, 进行混合 6.4,12,000rpm 离心 5 分钟 7. 将上清液转移到另一个微量离心管 5

8 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 8. 加入 250μl 灭菌水和 55μl 7.5M 醋酸铵 9. 加入 875μl 的酒精, 充分混匀 10. 在室温下静置 2-3 分钟 11.4,12,000rpm 离心 5 分钟 12. 弃上清液 13. 加入 70-80% 的乙醇 ( 室温 )1ml, 轻轻倒转 2-3 次进行混匀 14.4,12,000rpm 离心 5 分钟 15. 弃上清液 16. 离心沉淀 RNA, 用移液器完全吸掉乙醇溶液 17. 加入适量的缓冲液 2), 用移液器上下吹打使沉淀溶解 1) 当制备用于 PROTEIOSTM 的 mrna 时, 推荐使用弱盐基性的 DNA 用苯酚 (ph8.0); 使用 RNA 用的弱酸性苯酚时, 有时也可以得到高效的蛋白合成其他用途, 请根据具体情况选择相应的 ph 条件 2) 如采用 PROTEIOSTM 的 batch 法进行蛋白质合成时, 应加入 20mM HEPES-KOH(pH7.6); 如采用 PROTEIOS TM 的重层法进行蛋白质合成, 应加入 PROTEIOS 中添附的 Buffer Mix; 其他用途, 请根据具体情况选用相应缓冲液或水 7 RNA 的纯度分析纯化后的 RNA, 进行后续实验前一般须进行必要的定量和分析通过琼脂糖电泳分析如想要确认合成 RNA 的链长和产物的量, 可在使 RNA 变性的条件下进行电泳 1), 以下为 RNA 的简易变性法 1. 配制 RNA 变性缓冲液请按照以下配方配制 ( 配制好的缓冲液请冷藏保存 ) 64% 甲醛 26mM MOPS,pH mM 醋酸钠 0.6mM EDTA,pH8.0 垂询电话 :

9 2. 将 RNA 反应液 2μl,RNA 变性缓冲液 20μl, 电泳用 Dye 5μl 混匀后,65 加热 15 分钟, 然后置于冰上急速冷却 2) 3. 用 1%TAE 琼脂糖凝胶进行电泳 1) 对 PROTEIOS TM 用的 mrna 进行分析时, 可以使用非变性条件下的 1%TAE 琼脂糖凝胶电泳的简易方法 RNA 合成正常时, 电泳图谱应为 smear 状 ( 如转录模板 DNA 含有终止序列, 也可能产生条带 ) 如果 RNA 合成不正常, 电泳图谱将呈条带状, 在低分子量区域则为一团 2) 在强变性条件下进行电泳时, 请使用 MOPS 进行凝胶电泳通过吸光度测定进行浓度分析可使用吸光度计等测定被合成的 RNA 量纯化后的 RNA 溶液中会有少量 DNA 模板残留, 但是相对于 RNA 量来说非常少, 不会影响 RNA 的定量 RNA 的浓度可通过吸光度来计算对 RNA 溶液适当稀释 ( 通常倍 ) 后, 测定 A 260 值,RNA 浓度 (μg/ml) 为 260nm 的吸光度值乘以稀释倍数再乘以系数 40 RNA 浓度 (μg/ml)=(a 260 空白值 ) 稀释倍率 40 空白值为溶解 RNA 的相应缓冲液的 A 260 值 7

10 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 8 常见问题 RNA 不能合成, 或合成效率低原因对策混入了 RNase 模板中不包含启动子, 或是启动子的种类不同被合成的 RNA 可能被分解用苯酚氯仿对模板 DNA 样品进行处理, 除去 RNase 在试剂盒中提供的 RNA 聚合酶对启动序列识别非常严格, 基本上无法识别其他的序列请使用含有正确的启动序列的模板 DNA 模板 DNA 中混入了盐之类的杂质请对模板进行两次以上的苯酚抽提乙醇沉淀进行纯化基因结构产生的问题通过氯化铯梯度离心纯化 DNA 可以缓和扩增质粒时大肠杆菌的培养有问题有些培养基培养的细菌, 抽提的质粒有可能不适合合成 RNA 推荐使用 LB 培养基进行培养细菌 9 相关产品品名及内容规格 Code No. 保存 Themo T7 RNA Polymerase 7,500U TRL C rntps mixture ( 各 25mM) 0.5μmoles NTP-211(2) C rntps set ( 各 100mM) 0.5μmoles NTP-111(10) C ratp(100mm) 10μmoles ATP-111(5) C rgtp(100mm) 10μmoles GTP-111(5) C rctp(100mm) 10μmoles CTP-111(5) C rutp(100mm) 10μmoles UTP-111(5) C RNase Inhibitor 2,500U SIN C PROTEIOS TM Wheat germ cell-free Protein synthesis kit* 5 次用 20 次用 60 次用 CPS-601M CPS-601 CPS C PROTEIOS TM buffer set* 1set CPS C * 来自本公司的 PROTEIOS TM wheat germ cell-free protein synthesis kit 以及 PROTEIOS TM buffer set 的销售对象仅限于非赢利组织垂询电话 :

11 [ 制造销售商 ] 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司上海市浦东新区张杨路 188 号汤臣商务中心 C 座 310 室邮编 : 交货期限订货相关咨询 Tel: Fax: sales@bio-toyobo.cn 产品内容技术相关咨询 Tel: Fax: tech@bio-toyobo.cn 代理商资料 :

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