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桃古
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T7 RNAi Transcription Kit TR102 www.vazyme.

1 T7 RNAi Transcription Kit TR102 Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 7.1

2 目录 Contents 01/产品概述 T7 RNA ploymerase可识别带有t7启动子的dna模版以四种NTP为底物体外合成RNA T7 RNAi Transcription Kit是在T7 High Yield RNA Transcription Kit基础上为双链RNA而设计优化的版本可用于21 bp的sirna和长片段的dsrna 产物经纯化后可用于阳离子脂质体磷酸钙共沉淀电穿孔 DEAE-葡聚糖及显微注射等方法介导的RNAi实验一般情况下一个反应可产生20-80 µg的rna 02/产品 T7 Enzyme Mix 100 µl 100 µl 10 Annealing Buffer 500 µl NTP Mix 200 µl 400 µl DNase I 25 µl RNase T1(100 U/µl) 25 µl 300 µl 600 µl Control Template* 5 µl 10 µl 5 ml 5 ml RNA Clean Beads 2 ml 4 ml RNase T1 Dilution Buffer Box 2 TR102-02(50 rxn) 2 10 Transcription Buffer Box 1 TR102-01(25 rxn) * 本试剂盒提供的Control Template为500 bp双端含t7启动子的pcr产物浓度为0.5 µg/µl 03/保存条件 Box 1于-20 保存 Box 2于4 保存 04/适用范围 01/产品概述 /产品 /保存条件 /适用范围 /自备材料 /注意事项 /模板制备 /PCR模板 /合成模板 /实验流程 /产物纯化 /siRNA干扰实验 /常见问题及解决方案本试剂盒适用于体外siRNA及长链dsRNA 单链RNA推荐使用T7 High Yield RNA Transcription Kit (Vazyme #TR101) 05/自备材料模板带T7启动子序列的线性化质粒 PCR产物或化学合成的DNA片段其他 RNase-free EP管移液器吸头 PCR仪磁力架无水乙醇 06/注意事项 1.实验时请佩戴一次性手套及口罩以避免产物被RNase降解 2.请使用RNase-free的实验耗材 3.前请先电泳确定模板为单一片段 01/ 02

3 01/ 产品概述 T7 RNA ploymerase 可识别带有 T7 启动子的 DNA 模版, 以四种 NTP 为底物, 体外合成 RNA T7 RNAi Transcription Kit 是在 T7 High Yield RNA Transcription Kit 基础上为双链 RNA 而设计优化的版本, 可用于 21 bp 的 sirna 和长片段的 dsrna 产物经纯化后可用于阳离子脂质体磷酸钙共沉淀电穿孔 DEAE- 葡聚糖及显微注射等方法介导的 RNAi 实验一般情况下, 一个反应可产生 µg 的 RNA 02/ 产品 TR102-01(25 rxn) TR102-02(50 rxn) Box 1 T7 Enzyme Mix 10 Transcription Buffer 10 Annealing Buffer NTP Mix DNase I RNase T1(100 U/µl) RNase T1 Dilution Buffer Control Template* µl 25 µl 25 µl 300 µl 5 µl 100 µl 100 µl 500 µl 400 µl 600 µl 10 µl Box 2 RNA Clean Beads 5 ml 2 ml 5 ml 4 ml * 本试剂盒提供的 Control Template 为 500 bp 双端含 T7 启动子的 PCR 产物, 浓度为 0.5 µg/µl 03/ 保存条件 Box 1 于 -20 保存,Box 2 于 4 保存 04/ 适用范围本试剂盒适用于体外 sirna 及长链 dsrna, 单链 RNA 推荐使用 T7 High Yield RNA Transcription Kit (Vazyme #TR101) 05/ 自备材料模板 : 带 T7 启动子序列的线性化质粒 PCR 产物或化学合成的 DNA 片段其他 :RNase-free EP 管移液器吸头 ;PCR 仪 ; 磁力架 ; 无水乙醇 06/ 注意事项 1. 实验时请佩戴一次性手套及口罩以避免产物被 RNase 降解 2. 请使用 RNase-free 的实验耗材 3. 前请先电泳确定模板为单一片段 02

4 07/模板制备 07-2/合成模板 sirna的模板短可分别合成四条单链的DNA 再按如图3所示方式退火得到两个双链的 07-1/PCR模板长链的dsRNA可用5 端带T7启动子(TAATACGACTCACTATAGGG)的特定引物扩增转 DNA模板由于siRNA模板片段较短聚合酶与模板结合效率较低合成模板时可在T7启动子录模板方案如下图1所示绿色方框表示T7启动子绿色直线表示模板链起始的5 端加上GATCAC六个碱基以促进酶与模板的结合 sirna 3 末端带两个游离的碱基会提高siRNA与mRNA的结合效率游离碱基为UU时对靶基因的抑制效果位点在T7启动子TAATACGACTCACTATAGGG 3个G的位置(下划线) PCR产物可以不经最强若游离碱基为GG则细胞内的RNase会降解这种结构导致siRNA活性降低纯化直接作为模板但纯化后会得到更高的RNA产出建议模板投入量为0.5 µg a.按照如下体系退火成两个模板方案有三种 ① 模板1和模板2分别在两个PCR管中后再将产物1:1退火成双链 ② 模板1和模板2在同一个PCR管中混合后退火成双链 ③ 用双端带启动子的模板3后退火成双链一般体积 Oligonucleotides A1(或B1) 100 μm Oligonucleotides A2(或B2) 100 μm 10 Annealing Buffer 情况下方案①和②的产物量更高单端启动子 μl μl μl μl 模板A1与A2 模板 B1与B2之间必须配对(如图3所示) 模板制备 b.在pcr仪中进行如下退火程序模板1 模板2 温度时间 95 C C 22 C 双端启动子 2 min 0.1 C/sec 10 min 退火后分别得到两个10 μm的dna模板该模板可以直接体外模板制备模板3 sirna实验流程图1. PCR扩增体外模板示意图 dsrna实验流程 Oligonucleotides A1 5 -GATCAC TT-3 5 -AA GTGATC-3 Oligonucleotides B1 Oligonucleotides A2 3 -CTAGTG AA-5 3 -TT CACTAG-5 Oligonucleotides B2 退火模板3 模板1 模板1-3 TT-3 AA-5 5 -AA GTGATC-3 3 -TT CACTAG-5 正义链 5 -GGG 5 -GATCAC 3 -CTAGTG 模板2 退火正义链 5 -GGG 模板2 UU GGG UU -3 反义链 -3 反义链 5 -GGG 退火杂交退火杂交 5 -GGG 3 -UU -3 GGG-5 5 -GGG 3 - UU -3 GGG-5 酶解酶解 UU UU sirna 图2. dsrna实验流程图3. sirna示意图 03 03/ 04

5 07-2/ 合成模板 sirna 的模板短, 可分别合成四条单链的 DNA, 再按如图 3 所示方式退火得到两个双链的 DNA 模板由于 sirna 模板片段较短, 聚合酶与模板结合效率较低, 合成模板时可在 T7 启动子的 5 端加上 GATCAC 六个碱基以促进酶与模板的结合 sirna 3 末端带两个游离的碱基会提高 sirna 与 mrna 的结合效率, 游离碱基为 UU 时对靶基因的抑制效果最强, 若游离碱基为 GG 则细胞内的 RNase 会降解这种结构, 导致 sirna 活性降低 a. 按照如下体系退火成两个模板 : Oligonucleotides A1( 或 B1) 100 μm Oligonucleotides A2( 或 B2) 100 μm 10 Annealing Buffer 模板 A1 与 A2, 模板 B1 与 B2 之间必须配对 ( 如图 3 所示 ) 体积 14 μl b. 在 PCR 仪中进行如下退火程序 : 温度 95 C C 22 C 退火后分别得到两个 10 μm 的 DNA 模板, 该模板可以直接体外时间 2 min 0.1 C/sec 10 min sirna 实验流程 : Oligonucleotides A1 5 -GATCAC TT-3 5 -AA GTGATC-3 Oligonucleotides B1 Oligonucleotides A2 3 -CTAGTG AA-5 3 -TT CACTAG-5 Oligonucleotides B2 退火退火模板 1 5 -GATCAC 3 -CTAGTG TT-3 AA-5 5 -AA 3 -TT GTGATC-3 CACTAG-5 模板 2 正义链 5 -GGG UU GGG UU -3 反义链退火杂交 5 -GGG UU UU GGG-5 酶解 3 -UU sirna UU -3 图 3. sirna 示意图 04

1 08/实验流程 2 3 4 1. 按下表配置反应体系(混合模板方案为例) 2 sirna双酶消化产物 3 单链模板体积 4 双链退火模板 8 μl 1-4 μl 1-4 μl up to 20 μl NTP Mix 10 Transcription Buffer T7 Enzyme Mix DNA模板1 DNA模板2 1 sirna产物图5.

3 Kb的RNA 可将反应延长至4 h或 RNA产物可采用磁珠过柱酚/氯仿抽提及切胶回收的方法纯化本试剂盒推荐磁珠法纯化RNA 更长时间过夜反应不会影响产物的质量磁珠纯化可快速高效去除蛋白游离核酸及盐类纯化所用80%乙醇需自备配置 3.双链长度大于800 bp 37 C反应结束后需72 C 10 min 再自然冷却退火形成dsRNA 1.

6 1 08/实验流程按下表配置反应体系(混合模板方案为例) 2 sirna双酶消化产物 3 单链模板体积 4 双链退火模板 8 μl 1-4 μl 1-4 μl up to 20 μl NTP Mix 10 Transcription Buffer T7 Enzyme Mix DNA模板1 DNA模板2 1 sirna产物图5. sirna 12% PAGE电泳检测结果模板1与模板2按1:1的量投入推荐投入量各0.5 μg 混样后用移液器轻轻吹打混匀并将试剂短暂离心于管底 09/产物纯化 2.在PCR仪中37 C反应2 h 可根据产物片段大小适当的调整反应时间如合成小于0.3 Kb的RNA 可将反应延长至4 h或 RNA产物可采用磁珠过柱酚/氯仿抽提及切胶回收的方法纯化本试剂盒推荐磁珠法纯化RNA 更长时间过夜反应不会影响产物的质量磁珠纯化可快速高效去除蛋白游离核酸及盐类纯化所用80%乙醇需自备配置 3.双链长度大于800 bp 37 C反应结束后需72 C 10 min 再自然冷却退火形成dsRNA 1.将RNA Clean Beads从4 C取出放置室温平衡30 min 使用前请颠倒或涡旋混匀在同一个PCR管中小于800 bp的产物反应后会互补形成dsrna 大于800 bp需要退火形 2.向产物中加入80 μl的磁珠溶液用移液器吹打10次以上使溶液充分混匀成dsRNA 两个模板分别在不同的PCR管中则需将反应结束后两个产物混合后进行退火若产物片段小于100 bp 须加200 μl的异丙醇再充分混匀 4. 用RNase T1 Dilution Buffer将100 U/μl RNase T1稀释成10 U/μl 3.室温孵育8 min 使RNA与磁珠充分结合 RNase T1特异性降解单链RNA及5 端的3个G碱基稀释后的RNase T1须尽快使用不宜保存 4.将PCR管置于磁力架上约5 min 待溶液澄清后小心移除上清液吸取上清时注意勿扰动 5. 按下表配制双酶消化体系到磁珠体积 5.保持PCR管始终处于磁力架上加入200 μl新配制的80%乙醇注意不要扰动到磁珠室温 20 μl 17 μl 1 μl 40 μl Transcription Product DNase I RNase T1(10 U/μl) Total 孵育30 sec 小心移除上清重复该步骤一次 6.开盖空气干燥磁珠5-10 min 干燥至磁珠表面无水光即可过度干燥会影响RNA的洗脱混样后用移液器轻轻吹打混匀并将试剂短暂离心于管底 7.将PCR管从磁力架上取下加入40 μl的用移液器将管壁上的磁珠吹打下 C孵育30 min 来充分混匀并室温孵育3 min 7. 电泳检测产物 8.将PCR管置于磁力架上待溶液澄清后小心将上清转移至新的RNase-free EP管中勿吸长片段dsRNA进行琼脂糖凝胶电泳 sirna则用聚丙烯酰胺凝胶(page)电泳检测 sirna由取到磁珠于片段较小产物会有一定的弥散现象为避免磁珠对后续实验的影响在转移产物时请预留1-的溶液以防止吸取到磁珠 9.检测产物的A260吸光值确定其浓度并于-20 C保存纯化产物 DL2,000 Plus DNA Maker 2和4 分别为500 bp dsrna酶 750 bp 500 bp 10/siRNA干扰实验解前后产物(方案②) 3和5 分别为500 bp dsrna酶解本实验以293T细胞为转染对象 ExFect2000 Transfection Reagent(Vazyme #T202)为转染试前后产物(方案③) 剂用带绿色荧光蛋白(GFP)序列的质粒和21 bp的gfp sirna共转染干扰荧光蛋白表达在RNA干扰实验中细胞的状态转染试剂与RNA的比例 RNA的浓度 RNA的干扰效率转染试剂的转染效率与毒性等都会影响最终的干扰结果如果排出上述条件干扰仍不成功则需重新设计RNA序列 Negative Control GFP sirna 与Positive GFP sirna的碱基组成相同但没有基因靶向功能图 bp dsrna 2%琼脂糖凝胶电泳图 05 05/ 06

7 :siRNA 产物 ; 2:siRNA 双酶消化产物 ; 3: 单链模板 ; 4: 双链退火模板图 5. sirna 12% PAGE 电泳检测结果 09/ 产物纯化 RNA 产物可采用磁珠过柱酚 / 氯仿抽提及切胶回收的方法纯化本试剂盒推荐磁珠法纯化 RNA 磁珠纯化可快速高效去除蛋白, 游离核酸及盐类纯化所用 80% 乙醇需自备配置 1. 将 RNA Clean Beads 从 4 C 取出, 放置室温平衡 30 min 使用前请颠倒或涡旋混匀 2. 向产物中加入 80 μl 的磁珠溶液, 用移液器吹打 10 次以上使溶液充分混匀若产物片段小于 100 bp, 须加 200 μl 的异丙醇, 再充分混匀 3. 室温孵育 8 min, 使 RNA 与磁珠充分结合 4. 将 PCR 管置于磁力架上约 5 min, 待溶液澄清后, 小心移除上清液, 吸取上清时注意勿扰动到磁珠 5. 保持 PCR 管始终处于磁力架上, 加入 200 μl 新配制的 80% 乙醇, 注意不要扰动到磁珠, 室温孵育 30 sec, 小心移除上清重复该步骤一次 6. 开盖空气干燥磁珠 5-10 min 干燥至磁珠表面无水光即可, 过度干燥会影响 RNA 的洗脱 7. 将 PCR 管从磁力架上取下, 加入 40 μl 的 RNase-free H 2O, 用移液器将管壁上的磁珠吹打下来, 充分混匀, 并室温孵育 3 min 8. 将 PCR 管置于磁力架上, 待溶液澄清后, 小心将上清转移至新的 RNase-free EP 管中, 勿吸取到磁珠为避免磁珠对后续实验的影响, 在转移产物时, 请预留 1- 的溶液, 以防止吸取到磁珠 9. 检测产物的 A 260 吸光值, 确定其浓度, 并于 -20 C 保存纯化产物 10/siRNA 干扰实验本实验以 293T 细胞为转染对象,ExFect2000 Transfection Reagent(Vazyme #T202) 为转染试剂, 用带绿色荧光蛋白 (GFP) 序列的质粒和 21 bp 的 GFP sirna 共转染干扰荧光蛋白表达在 RNA 干扰实验中, 细胞的状态, 转染试剂与 RNA 的比例,RNA 的浓度,RNA 的干扰效率, 转染试剂的转染效率与毒性等都会影响最终的干扰结果如果排出上述条件干扰仍不成功, 则需重新设计 RNA 序列 Negative Control GFP sirna 与 Positive GFP sirna 的碱基组成相同, 但没有基因靶向功能 06

8 短片段模板产量低模板片段小模板与酶的结合效率会较低如合成siRNA比合成其他长度的单双链RNA产量低建议适当延长反应时间或增加模板量以提高RNA产量产物电泳拖尾现象电泳过程中有拖尾现象可能原因是模板投入量较多或者两个模板不以1:1投入而导致模板或者单链RNA酶解不彻底建议适当延长双酶解时间模板与单链RNA在总的产物中含量极低一般不会影响后续实验图6. sirna干扰绿色荧光蛋白表达左图为GFP质粒与Negative control GFP sirna共转染24 h后的293t细胞 RNA产物片段小于预期右图为GFP质粒和Positive GFP sirna共转染24 h后的293t细胞电泳显示产物条带小于预期大小可能原因 ①模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列 11/常见问题及解决方案 ②模板中GC含量高形成了类似茎环的终止结构 dsrna实验方案设计不同的RNA聚合酶识别不同的终止序列若模板中含终止结构建议尝试不同的RNA聚合酶或 dsrna的实验设计有三种方案请根据自己的实验选择方案可参照步骤07-1/PCR 者重新设计模板序列模板进行模板制备若选择方案①和② 模板投入量请按照1:1的比例进行否则产物正义链和负义链RNA的量不相等退火后会残余较多的单链RNA sirna模板链设计 sirna由于模板比较短所以通常采用化学合成的方式得到四条单链DNA模板再两两退火成模板 sirna 3 端带有两个游离碱基推荐在设计模板时在模板链 3 端加两个A碱基 sirna的模板链包含 6个碱基的增强子 20个碱基的T7启动子 19-21个碱基的目标序列及2个游离的A碱基结构如下所示增强子 T7启动子特定序列 GATCAC TAATACGACTCACTATAGGG X19-21AA 产物产量低一般情况下每个反应可以产生20-80 µg的rna 如果实验组产量很低可能原因 ①模板中含有抑制反应的成分 ②模板投入量模板长度及模板结构均与产量密切相关建议使用试剂盒中提供的Control Template做一个对照实验若对照组产量低请咨询诺唯赞技术支持若对照组产量正常但实验组产量低说明实验模板本身原因导致产量低请尝试以下方案解决 a.纯化模板并对模板准确定量 b.加大模板投入量 c.延长37 C反应时间 d.重新设计模板 07 07/ 08

RNA 在总的产物中含量极低, 一般不会影响后续实验 RNA 产物片段小于预期电泳显示产物条带小于预期大小, 可能原因 : 1 模板序列中包含类似于 T7 RNA

9 短片段模板产量低模板片段小, 模板与酶的结合效率会较低, 如合成 sirna 比合成其他长度的单双链 RNA 产量低建议适当延长反应时间或增加模板量以提高 RNA 产量产物电泳拖尾现象电泳过程中有拖尾现象, 可能原因是模板投入量较多或者两个模板不以 1:1 投入而导致模板或者单链 RNA 酶解不彻底, 建议适当延长双酶解时间模板与单链 RNA 在总的产物中含量极低, 一般不会影响后续实验 RNA 产物片段小于预期电泳显示产物条带小于预期大小, 可能原因 : 1 模板序列中包含类似于 T7 RNA 聚合酶的终止序列 ; 2 模板中 GC 含量高形成了类似茎环的终止结构不同的 RNA 聚合酶识别不同的终止序列, 若模板中含终止结构, 建议尝试不同的 RNA 聚合酶或者重新设计模板序列 08

10 T7 RNAi Transcription Kit TR102 Vazyme Biotech Co., Ltd Web: Tel: Sales: Support: Service: Vazyme biotech co., ltd. SYSTEMS 企业已通过 ISO 9001:2015 国际质量管理体系认证使用说明书 Version 7.1

TR101-说明书修改稿4

TR101-说明书修改稿4 T7 High Yield RNA Transcription kit TR101 www.vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 7.1 目录 Contents 01/ 产品概述... 02 02/ 产品组分... 02 03/ 保存条件... 02 04/ 适用范围... 02 05/ 自备材料... 02 06/ 模板制备... 02