产品简介体外定点突变技术是当前生物医学各领域研究中的一种重要实验手段, 多用于改造优化目的基因 ; 探索启动子的调节位点 ; 以及研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系本试剂盒采用目前领先技术, 可在目标载体上直接对靶基因进行单点突变, 多点突变及插入或缺失突变, 并且单点突变的突变率可达 90%

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拜尹
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1 Order: Toll-free: / TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD 版本号 : KM Fast Site-Directed Mutagenesis Kit 快速定点突变试剂盒目录号 :KM101 产品内容产品组成 KM101 (20 rxn) FastAlteration DNA Polymerase (2.5 U/μl) 30 μl 5 FastAlteration Buffer 200 μl Dpn I restriction enzyme (20 U/μl) 20 μl 4.5 kb Control plasmid (5 ng/μl) 40 μl Control primers (5 μm, each) 80 μl FDM competent cells μl 储存条件收到本产品后, 请立即将 FDM competent cells 置于 -70 条件下保存, 试剂盒其他组分置于 -20 条件下保存感受态细胞 -70 条件下保质期 6 个月, 试剂盒其他组分在 -20 条件下保质期 1 年本产品仅供科研使用请勿用于医药临床治疗食品及化妆品等用途

2 产品简介体外定点突变技术是当前生物医学各领域研究中的一种重要实验手段, 多用于改造优化目的基因 ; 探索启动子的调节位点 ; 以及研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系本试剂盒采用目前领先技术, 可在目标载体上直接对靶基因进行单点突变, 多点突变及插入或缺失突变, 并且单点突变的突变率可达 90% 以上另外, 与以往的突变试剂盒需要多轮 PCR 及亚克隆等耗时耗力的步骤不同, 本试剂盒的操作更为简便, 从未突变菌株到突变菌株的构建只需要 4 步 ( 如图 1 所示 ) 图 1 TIANGEN 快速定点突变试剂盒操作流程试剂盒提供的 FastAlteration DNA Polymerase 是一种快速高保真 DNA 聚合酶, 该酶保真性能优良, 灵敏度高, 扩增速度可达 15~30 sec/kb, 并且最高可扩增长度为 10 kb 的质粒 DNA 试剂盒附带的 FDM 感受态细胞具有体内降解甲基化质粒的功能, 可以对未被 Dpn I 降解掉的质粒模板进行进一步的降解, 因此可以保证试剂盒具有更高的阳性率同时, 本试剂盒还为客户提供了对照质粒和引物, 方便客户查找实验问题试剂盒特点简便快速 : 试剂盒采用非链取代式质粒扩增技术, 只需 4 步即可实现由非突变菌株到突变菌株的转变, 而不需要多轮 PCR 及亚克隆等耗时耗力的步骤高效引物 : 试剂盒采用部分重叠的引物设计原则, 可以扩增得到更多的突变质粒应用广泛 : 本试剂盒不但可进行单点突变, 还可以进行多点突变, 且突变点数可达 5 个适应性强 : 本试剂盒最大可对 10 kb 的质粒进行定点突变, 基本覆盖所有常用质粒突变率高 : 本试剂盒具有体外和体内双重消化甲基化质粒模板的功能, 可以保证更高的突变率对于单点突变而言, 本试剂盒的突变率可达 90% 以上 2

引物设计原则 1. 两条引物上都要包含突变位点, 且除突变位点以外的碱基都要与质粒模板互补配对 2. 若引物中只有一个突变位点, 则需采用图 2-A 的设计原则此类引物包括 5 重叠区和 3 延伸区两部分引物总长度大约为 30 nt, 其中 5 重叠区为 15-20 nt,3 延伸区至少为 10 nt 突变位点在正向突变引物的重叠区以后, 反向突变引物的 5 末端 3.

3 引物设计原则 1. 两条引物上都要包含突变位点, 且除突变位点以外的碱基都要与质粒模板互补配对 2. 若引物中只有一个突变位点, 则需采用图 2-A 的设计原则此类引物包括 5 重叠区和 3 延伸区两部分引物总长度大约为 30 nt, 其中 5 重叠区为 nt,3 延伸区至少为 10 nt 突变位点在正向突变引物的重叠区以后, 反向突变引物的 5 末端 3. 若引物上含有 2-5 个突变位点, 则需采用图 2-B 的设计原则此类引物的两条序列完全互补, 分为突变区和非突变区两部分引物总长度大约为 40 nt, 其中突变区为 nt, 非突变区至少为 10 nt 根据实验需求可在突变区内设计 2-5 个突变位点 4. 为保证高突变率, 突变引物需通过 FPLC 或 PAGE 方式纯化 5. 突变引物 Tm 值的计算按下列公式进行 : Tm = (GC%) / N- mismatch% (N: 引物长度 ) 注意事项图 2 TIANGEN 快速定点突变试剂盒引物设计原则 1. 在进行单引物多位点突变时, 由于增加了突变位点个数, 所以突变率较单点突变时会有所降低, 根据我们的实验数据, 当突变位点个数达到 5 个时, 突变阳性率会降低到 50% 因此建议客户要增加验证的克隆子数 2. 本试剂盒支持多引物多位点突变, 这样可以在基因内更广泛的范围内进行突变实验突变位点个数的上限仍然是 5 个 3. 建议在进行新的突变实验时要带上试剂盒附带的对照质粒和引物, 以便于对实验问题进行分析适用范围本试剂盒适用于 : 改造优化目的基因和载体 ; 分析启动子上与调控蛋白结合的关键位点 ; 研究蛋白质结构和功能之间的关系 3

4 操作方法一建立 PCR 反应体系 : 注意 : 以下举例仅供参考, 实际反应条件因模板引物等的结构不同而各异, 需根据实际情况, 设定最佳反应条件 1. 将 -20 下保存的 PCR 反应相关试剂, 突变引物及模板质粒解冻并混匀 2. 按照下表中各组分的加入量进行反应液的配制反应体系 : 组成成分 50 μl 体系终浓度 DNA Template 10~100 ng - 正向突变引物 (10 μm) 2 μl 400 nm 反向突变引物 (10 μm) 2 μl 400 nm 5 FastAlteration Buffer 10 μl 1 FastAlteration DNA Polymerase (2.5 U/μl) 1.5 μl U/μl RNase-Free ddh 2 O 至 50 μl - 3. 按照下表体系配制对照组 PCR 体系反应体系 : 组成成分 50 μl 体系终浓度 4.5 kb Control plasmid (5 ng/μl) 2 μl 0.2 ng/μl Control primers (5 μm, each) 4 μl 400 nm 5 FastAlteration Buffer 10 μl 1 FastAlteration DNA Polymerase (2.5 U/μl) 1.5 μl U/μl RNase-Free ddh 2 O 至 50 μl - 4. 将实验组及对照组按照如下 PCR 反应程序进行 PCR 反应 PCR 反应程序 : 注 : 下表中 PCR 程序按照对照组实验条件设置, 客户可根据自身实验进行相应调整 4

5 阶段循环温度时间内容预变性 min 预变性 sec 变性 PCR 反应 sec 退火 min 延伸补充延伸 min 补充延伸二质粒模板的消化 1. 按照下表所述配制酶切体系 : 组成成分 51 μl 体系终浓度 PCR 产物 50 μl - Dpn I restriction enzyme (20 U/μl) 1.0 μl 0.4 U/μl Total Volume 51 μl - 2. 充分混匀后, 将上述酶切体系于 37 条件下消化 1 h 三转化宿主菌注 : 此转化流程为通用流程, 可用于实验组及对照组 1. 从 -70 冰箱中取出 1 支 FDM 感受态细胞置于冰上解冻 2. 感受态细胞解冻后, 加入 5 μl Dpn I 消化产物 ( 在感受态细胞刚刚解冻时加入产物 ), 继续冰浴 30 min 准确热激 90 sec, 立即置于冰上 2 min 4. 加入 350 μl 无菌的 SOC 或 LB 培养基 ( 不含抗生素 ), 混匀后置于 37 摇床振荡培养 45~60 min(150 转 / 分钟 ), 使菌体复苏 5. 孵育结束后, 将离心管内菌液混匀, 并将所有菌液涂布到含相应抗生素的 LB 固体琼脂培养基上, 将平板置于室温直至液体被吸收, 倒置平板,37 培养 12~16 h 6. 待菌落长出后, 进行突变克隆筛选 5

6 四根据对照组统计突变结果试剂盒提供的对照质粒和对照引物主要用于评估试剂盒的突变率在氨苄抗性的平板上, 涂布 20 μl 0.2 M 的 IPTG 和 40 μl 40 mg/ml 的 X-gal, 正常情况下, 对照组在上述平板上的菌落生长数应该在 50 个以上, 且阳性突变菌株显蓝色, 因为对照质粒上的 lacz 基因是经过改造的, 而成功的突变会使其回复成野生型因此可根据菌落的颜色推断本次操作的阳性突变率, 具体计算公式如下 : 突变率 = 呈蓝色的菌落数 (cfu) 平板上所有的菌落数 (cfu) 100% 注意 : 对于突变实验而言, 需要通过测序来最终验证突变是否成功, 及突变位点以外的碱基未发生改变常见问题及解决办法 1. 转化效率低或菌落数少原因解决办法反应体系中扩增出的突变质粒量不足增加转化体系的量至 10 μl PCR 反应体系中模板将模板质粒进行琼脂糖凝胶电泳及定量分析, 质粒量不足以确定质粒的质量和浓度是否符合试剂盒要求 2. 对照组突变率低或者菌落数少原因 PCR 程序不适宜解决办法确定 PCR 程序适宜对照组要求, 并用确定后的程序再进行一次对照组实验以彻底排除 PCR 程序的影响扩增产物不足可将 PCR 反应的循环数增加至 25 个感受态细胞保存不当收到试剂盒以后应第一时间将感受态细胞转入 -70 冰箱中保存, 且应将感受态放于冰箱的里面而不要放在门口对本试剂盒而言, 应在氨苄抗性的平板上, 涂布 20 μl X-gal 和 IPTG 的用量不足 5 PCR 反应 Buffer 反复冻融 0.2 M 的 IPTG 和 40 μl 40 mg/ml 的 X-gal, 才能保证阳性突变株的菌落变为蓝色此 Buffer 中含有 dntp 等容易降解的成分, 反复冻融会加速这些物质的降解, 因此, 在实际操作中应尽量避免对 5 PCR 反应 Buffer 的反复冻融 6

7 3. 实验组突变率低或者菌落数少原因 PCR 程序不适宜反应体系混合不均匀加入 Dpn I 后未混匀充分转化体系中质粒模板过剩 5 PCR 反应 Buffer 反复冻融解决办法确定 PCR 程序适宜实验组要求, 并用确定后的程序再进行一次对照组实验以彻底排除 PCR 程序的影响用移液器轻轻吸打将反应体系混合混匀酶切阶段, 加入 Dpn I 后一定要用移液器轻轻吸打多次以保证 Dpn I 与 PCR 体系混合均匀质粒模板过剩会极大的影响突变效率若排除其他影响后, 突变率仍然很低, 可以考虑增加 Dpn I 的用量至 2 μl 或延长酶切时间至 1.5 h 此 Buffer 中含有 dntp 等容易降解的成分, 反复冻融会加速这些物质的降解, 因此, 在实际操作中应尽量避免对 5 PCR 反应 Buffer 的反复冻融 7

8 浓缩国际权威精华, 铸就 TIANGEN 优秀品质! TIANGEN 为您提供国际化标准的生物学产品和服务 PCR RT-PCR 系列核酸 DNA RNA 分离纯化系列 DNA 分子量标准克隆载体感受态细胞细胞生物学产品蛋白分子量标准蛋白质染色检测及定量相关产品 8

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CATALOG 概述 Muta-direct 定点突变试剂盒使用说明 Muta-direct 定点突变试剂盒可以在克隆于质粒 DNA 序列的特定位点诱导突变, 理论上可以保证突变率达到 100%, 整个实验过程简单快捷只有两步, 而不需要用到 M13 载体和甲基化步骤该试剂盒可以诱导某个已知基因的特定碱基进行定点突变再突变成野生型密码子突变插入或者缺失等, 因此可以用于功能基因组学和蛋白质组学的研究