Endotoxin-Free Maxiprep Kit (BAC/PAC compatible)

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慨宁锺
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1 闪电克隆试剂盒 Lightening Cloning Kit Components BDIT BDIT BDIT Lightening Cloning Master Mix(2 ) 125μl(~25 次 ) 250μl(~50 次 ) 500 μl(~100 次 ) 介绍不同于普通分子克隆方法, 闪电克隆试剂盒通过简单的体外一步 ( 同源重组 ) 实现 DNA 克隆该方法极大简化了克隆过程, 无论是单链 DNA, 还是大到几百 kb 的 DNA 片段, 均可以高效完成克隆构建只需将载体质粒线性化, 再用 PCR 法将与载体质粒同源区 ( 约 15bp) 导入插入片段 (Inserts) 两端, 混合后加入重组酶, 即完成质粒构建该方法可以一步实现多个片段按顺序同时插入载体质粒中特点 1. 比传统克隆方法更简单, 步骤更少, 试剂需求也少, 整个流程时间更短 2. 可同时插入多个插入片段, 无需寻找合适的酶切位点 3. PCR 产生的片段无需酶切, 线性化载体可以通过酶切或 PCR 方法产生 4. 重组产生的 DNA 接头处不引入任何多余碱基, 有利于融合蛋白或核糖体结合位点 RBS 的构建 5. 可用于将线性化 DNA 重新连接成环状, 适合定点突变操作 6. 只要是可以 PCR 的 DNA 片段, 均可用该克隆试剂盒 7. 插入 n 个 DNA 片段与一个片段所花费的时间是一样的保存 -20 保存 1 年 ( 此温度下不会冻结, 无需分装 ); 冰袋运输闪电克隆流程 1. 设计用于扩增插入片段 ( 和 / 或载体质粒 ) 的引物序列, 引物上携带合适的重叠序列 2. 用高保真聚合酶 PCR 扩增插入片段 ( 无需考虑产物末端有无 A 尾, 重组过程中将被去除, 在最终质粒中不会出现 ) 3. 用高保真酶 PCR 扩增 ( 或酶切 ) 将载体质粒线性化 4. 测定插入片段和线性化载体的浓度 5. 将插入片段和线性化载体加入 Lightening Cloning Master Mix 溶液中,50 水浴 15 min 6. 转化 DH5α 等感受态细胞 1 / 7

2 图 1: 闪电克隆流程示意图 ( 以同时插入 2 个插入片段为例 ) 含重叠区 (Overlap) 的引物构建原则闪电克隆所用 PCR 的引物包含以下两部分 : 针对载体上插入位点两端的重叠区部分 ; 针对要扩增的插入片段部分 ; 重叠区序列放在引物的 5 - 端, 与要插入位点的 5 - 末端序列一致重叠区序列长度由其 GC 含量不同有所变化建议重叠区长度为 nt,tm 值等于或大于 48 插入片段序列放在引物的 3 - 端, 紧随重叠区遵从一般引物设计原则 2 / 7

方法一 :PCR 法线性化载体的引物设计如果用 PCR 法来为某个插入片段而线性化载体, 可以考虑将部分插入片段的序列放入载体的引物 ( 见图 2 中 IV 的蓝色字母序列及 RP2 引物 ), 这样可以减少引物长度 ; 但如果要在该载体分别放入不同的插入片段, 那么载体的引物只能全部针对载体序列, 不能含有插入片段的序列 ( 见图 2 中 IV 的黄色字母序列及 FP2 引物 ) PCR

3 方法一 :PCR 法线性化载体的引物设计如果用 PCR 法来为某个插入片段而线性化载体, 可以考虑将部分插入片段的序列放入载体的引物 ( 见图 2 中 IV 的蓝色字母序列及 RP2 引物 ), 这样可以减少引物长度 ; 但如果要在该载体分别放入不同的插入片段, 那么载体的引物只能全部针对载体序列, 不能含有插入片段的序列 ( 见图 2 中 IV 的黄色字母序列及 FP2 引物 ) PCR 法线性化载体比方法二的酶切法背景更低, 如果用较高浓度的载体质粒作为 PCR 模板, 或发现克隆中背景较高时, 建议用 DpnI 对 PCR 产物进行酶切处理 (DpnI 只切开来自 E. Coli 的甲基化的质粒 DNA, 对非甲基化的 PCR 产物无作用 ), 如有必要, 可以再进行电泳和回收, 进一步降低背景图 2:PCR 法线性化载体的引物设计方法二 : 酶切法线性化载体的引物设计载体也可以通过限制性内切酶方法实现线性化 ( 单酶切就可以, 不会产生自连背景但双酶切比单酶切更能降低因为载体酶切不彻底而产生的背景, 建议尽量选择靠多克隆位点两端的酶切位点, 避免残留的酶切位点的发卡结构干扰同源重组 ) 1. 有些限制性内切酶不能充分切开超螺旋 DNA, 为了减少背景, 最好对酶切后的载体进行回收 2. 限制性内切酶对不同质粒提取试剂盒提取的质粒可能存在酶切效率差异, 这种情况下可以通过延长酶切时间或增大酶量以确保酶切完全 3. 如果插入片段中含有与载体酶切相同的位点, 就必须对酶切后的载体进行纯化, 方法包括热灭活或酚 - 氯仿抽提 / 酒精沉淀或琼脂糖凝胶电泳 3 / 7

4 4. 避免用产生高 G/C 粘性末端 ( 比如 GGCC 等 ) 的内切酶位点, 这类粘性末端会通过自连产生背景 5. 载体质粒经过酶切后末端有 3 种可能 :5 突出 (5 Overhang) 3 突出 (3 Overhang) 和平末端 (Blunt-end) 不管哪种末端, 插入片段与其重组后, 该酶切位点都会消失当然, 可以在引物的重叠区 (Overlap Region) 和插入片段区 (Gene-specific Sequence) 之间设计新的酶切位点 ( 见图 3) 图 3: 酶切法线性化载体的引物设计下游引物里的重叠区一定要延伸到载体酶切后 3 末端的最后一个碱基注意 : 上闪电克隆步骤 1. 按下表建立一个 10μl 闪电克隆反应体系 ( 建议用无核酸酶的 PCR 管, 并置于冰上操作 ): 内容线性化载体插入片段 (1 个或多个 ) Lightening Cloning Master Mix (2 ) ddh2o 体积 1-2 μl 2-4 μl 5 μl to 10 μl 注 1: Lightening Cloning Master Mix (2 ) 容易挂壁, 使用前请低速离心, 将所有液体集中到管底注 2: 通常最佳反应条件是 ng 线性化载体 DNA, 载体和片段的摩尔比为 1:1 至 1:3 如果插入片段小于 200bp, 加大到 5 倍量对于未纯化的 PCR 产物, 其体积不要超过总体积的 20%( 建议对线性化载体和插入片段进行回收纯化 ) 插入片段越多或越长, 克隆效率就越低如果同时插入多个插入片段, 建议按相同摩尔数加入 2. 在 50 水浴锅内放置分钟完成后放置在冰上或 -20 保存至下一步转化试验 4 / 7

5 注 : 为了提高克隆效率, 可以将反应时间延长到 60 分钟 ( 但不要超过 60 分钟 ) 3. 取 2-4μl 反应液转化 DH5α 等感受态细菌转化步骤 1. 冰上溶解 100μl DH5α 等感受态细菌 2. 加入 2μl 冰预冷的闪电克隆反应液用移液枪轻轻吹打, 或手指轻拨管壁 4 次混匀不用振荡 3. 冰上静置 30 分钟水浴锅内热击 45 秒 5. 冰上放置 2 分钟 6. 往里面加入 950μl 平衡至室温的 SOC/LB 培养液 ( 不含抗生素 ) 摇床中振荡 (250rpm) 培养 60 分钟 8. 将筛选平板放入 37 培养箱中预热 9. 取 100μl 涂平板 ( 含抗生素 ) ( 建议使用适当稀释的质粒作为阳性对照, 检测转化效率 ) ( 检测感受态效率方法 : 转化 100pg 的阳性对照质粒一般感受态的转化效率在菌落 /μg DNA) 培养箱培养过夜 5 / 7

6 常见问题现象原因解决方法感受态效率低重新制备或购买效率更高的商品化感受态转化效率低严格按步骤进行转化阳性对照板未长菌落感受态操作不当平板抗生素不对闪电克隆试剂盒失效 1. 感受态不能反复冻融, 最好在冰上溶解, 并马上进行转化试验 2. 感受态很脆弱, 不能剧烈震荡, 混匀时要轻柔 3. 检测感受态效率 4. 感受态细菌要保持在 -80 冰箱换上正确种类和浓度的抗生素常用抗性为氨苄, 浓度 50μg/ml 检查闪电克隆试剂盒保存方法是否正确, 是否过期引物设计错误检查引物设计是否正确避免将重叠区设计在有重复序列区域, 否则重组效率会降低 10 倍如果要插入的位置是多克隆位点 (MCS), 强烈建议选择靠 MCS 两端的酶切位点, 重叠区设计不当避免回文结构的干扰如果必须使用位于 MCS 中间的酶切位点, 转化时请加大反应液的量加大插入片段和载体的用量重新进行闪电克隆试验建议反应前对插入片插入片段 DNA 和载体的段 DNA 和载体进行纯化注 : 建议尝试尽量加大载体和片段的用量, 以量不正确闪电克隆板未长菌落增加重组几率通常 PCR 产物都是非常特异的一条带如果发现 PCR 产物有很多条带, 可插入片段的 PCR 产物量能是 PCR 模板没有处理好, 建议不要直接用基因组做模板, 应先将目的片太少或太杂段装入 T 载体, 测序正确后再作为模板插入片段越大或插入片段越多, 克隆效率越低尽量避免同时插入 3 个或以上片段 ( 可以考虑分次插入 ) 注: 可取少量闪电克隆反应液进行琼克隆效率低脂糖电泳, 通过观察插入片段载体以及重组带的亮度变化来判断闪电克隆效率分析插入片段是否对 E. coli 有毒性, 如果是, 可以考虑换低拷贝载体, 比转化效率低如 BAC 如果 PCR 产物不是单一条带, 必须进行电泳和回收, 避免混入其它非特异插入片段不正确条带含插入片段的 DNA 转化分析插入片段是否对 E. coli 有毒性, 如果是, 可以考虑换低拷贝载体, 比效率低如 BAC 得到大量菌落, 但没确保载体酶切完全, 否则重新酶切和跑胶纯化另外, 避免用会产生高有正确的插入片段载体未完全线性化 G/C 粘性末端 ( 比如 GGCC 等 ) 的内切酶位点, 这类粘性末端会通过自连产生背景 PCR 产物中混有的质粒先用 DpnI 酶切 PCR 产物, 再进行电泳回收模板温馨提示 : 如果您是首次使用闪电克隆试剂盒, 建议您在实验前与我们的技术支持取得联系 ( 联系方法见本说明书页脚 ), 他 6 / 7

7 们会让您快速理解和掌握本试剂盒的使用方法, 避免不必要的失误 7 / 7

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