112 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No DH5α pdsred2 1 载体 pegfp N1 载体包含小鼠 β 酪蛋白基因第一和第八外显子两端同源臂序列的 T 载体限公司 ;Esp3I(BsmBI) 购自 Fermentas;T4DNALig

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(3): 檪檪技术与方法檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 GoldenGate 克隆法构建靶向载体梁 1 龙杨 2,3 华 2,3 杨永林 2,3 刘守仁 2,3 皮文辉 (1 石河子大学动物科技学院石河子新疆农垦科学院畜牧兽医研究所石河子 ) (3 新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室石河子 ) 摘要在同一反应体系内, 利用 IS 型限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶进行 GoldenGate 克隆方法, 将多个目的基因片段按照设定的顺序连接, 实现多基因片段一步无缝连接为编辑小鼠 β 酪蛋白基因位点, 利用 GoldenGate 克隆法, 构建了小鼠 β 酪蛋白基因位点同源重组靶向载体关键词 DNA 重组 GoldenGate 克隆法小鼠 β 酪蛋白基因中图分类号 Q78 经典酶切连接克隆法采用限制性核酸内切酶和连接酶, 逐级将多个目的基因片段克隆进入载体, 是最基础的分子生物学实验内容之一然而在实际实验过程中, 特别是多个基因片段连接时, 经典克隆法的步骤显得较为繁琐, 比较费时, 而且在连接基因片段之间保留了限制性内切酶结合位点基于位点特异性重组 (site specificrecombination) 的基因克隆技术, 为快速有效地进行 DNA 体外重组提供了新途径如 Invitrogen 公司开发的 Gateway 克隆系统 Clontech 公司开发的 Creator 克隆系统以及 Stephen Eledge 实验室开发的 Univector 克隆系统 [1] 这些克隆技术能够简单高效准确地实现目的片段与特定载体的融合然而, 用这些克隆方法构建的重组载体中保留了特定重组位点序列且无法消除, 进而新增了额外的氨基酸 ( 如果这些位点位于表达序列 ) [2 3] 2008 年,Engler 等报道了一种 IS 型限制性核酸内切酶 (ISrestrictionenzymes) 介导的克隆策略, 称为 IS 克隆法 (IS cloning), 也称为 GoldenGate 克隆法 [4] IS 型限制性内切酶能够特异识别双链 DNA 上的靶位点, 并在靶位点下游非特异性地对 DNA 双链进收稿日期 : 修回日期 : 兵团博士资金 (2009JC05); 国家自然科学基金 ( ); 国家留学基金委西部人才培养特别项目 ([2009]5007) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :wzjpwh@163.com 行切割, 在 DNA 双链的 5 或 3 端产生粘性末端 [5] GoldenGate 克隆法是在同一反应体系中, 利用 IS 型限制性核酸内切酶, 在识别位点之外切开 DNA, 产生含粘性末端的 DNA 片段, 同时用连接酶将几个 DNA 片段按照既定的顺序连接, 拼接成不含酶识别位点的 DNA 片段, 就像一个线性拼图被正确地拼接在一起, 使多个目的 DNA 片段按照设定的顺序实现无缝连接 [2 3] 如果一种 IS 酶切割 DNA 产生 4 个碱基的粘性末端, 能够形成 256 种不同的粘性末端因此设计者能够非常灵活的设计 GoldenGate 克隆法实施方案目前人工构建转录激活样效应子 DNA 结合域方案中, 多篇文献采用 GoldenGate 克隆法 [4,6 8] 为了构建小鼠 β 酪蛋白基因位点同源重组红色荧光蛋白报告基因靶向载体, 实验将目的基因片段进行 IS 型酶切分析, 确定目的基因片段不含 BsmBI 酶切位点然后设计了 GoldenGate 克隆方案, 在一个反应体系中, 实现了两端同源臂和报告基因共三个片段按照预先设定的顺序同载体融合, 成功构建小鼠 β 酪蛋白基因位点同源重组靶向载体, 为编辑小鼠 β 酪蛋白基因位点提供靶向载体 1 材料与方法 1.1 材料菌株与载体大肠杆菌 (Escherichiacoli)

2 112 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No DH5α pdsred2 1 载体 pegfp N1 载体包含小鼠 β 酪蛋白基因第一和第八外显子两端同源臂序列的 T 载体限公司 ;Esp3I(BsmBI) 购自 Fermentas;T4DNALigase (HC) 购自 Promega 公司 ; 其他试剂均为国产分析纯 pt mexon1 和 pt mexon8 由本实验室保存引物根据目的基因片段 DNA 序列和重组酶类及主要生化试剂 BglI EcoR I Hind DNA 理论序列, 设计引物并加入 BsmBI 酶切位点 ( 小 I NcoI 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ;TaqDNA 聚合酶 pfudna 聚合酶购自天根生化科技 ( 北京 ) 有写斜体字母 ) 和其他所需要的酶切位点 ( 下划线部分 ) 引物由 Invitrogen 公司合成 ( 见表 1) 表 1 引物名称及序列 Table1 Primernameandsequence Name 引物 Sequence ZTF ZTR B1LF B1LR Red1F Red1R B1RF B1RR B8LF B8LR Red8F Red8R B8RF B8RR AGTGAGATCTGACAgagacgCCTGAAGCCTGATAACCAAG ACTGGAATTCGAGTCgagacgCTGTTCTGACGGTGGTATAG TGCGTCcgtctcCTGACAGCATTGGAAGTGTAGTTGAG GCTGACcgtctcCGGCTGTCAAGTCCTTTAGTGGAGGACAAGAGAGGAGGT TGCGTCcgtctcTAGCCATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATCAC GCTGACcgtctcTTGGAGCAGTGAAAAAAATGCTTTA TGCGTCcgtctcTTCCACTAAAGGTAAGAACTTC GCTGACcgtctcCGAGTGCACTATGGAGCCTCACTTCT TGCGTCcgtctcCTGACCCATCCTTCCCAAGCACAAAC GCTGACcgtctcTATGACCTTAAATGCAAACA TGCGTCcgtctcTTCATGGCCTCCTCCGAGAAC GCTGACcgtctcTCCTCTTAAAGCAAGTAAAACCTC TGCGTCcgtctcGGAGGATTTCCAGGTTATTTTCTCCTCC GCTGACcgtctcCGAGTACTGCTCCTCGTGTTTTGGT 1.2 方法同源重组靶向载体目的片段 PCR 扩增针对小鼠 β 酪蛋白基因第一和第八外显子, 用 4 对引物 B1LF/B1LR B1RF/B1RR B8LF/B8LR 和 B8RF/ B8RR, 以 pt mexon1 和 pt mexon8 为模版, 扩增得到目的片段 B1L(1156bp) B1R(1033bp) B8L(965bp) 和 B8R(771bp) 针对左右臂之间导入的红色荧光蛋白基因序列, 用引物 Red1F/Red1R 和 Red8F/Red8R, 以 pdsred2 1 为模版, 扩增目的片段 Red1(914bp) 和 Red8(881bp) 中间载体 pegfp N1 BsmBI 构建由于常用载体多克隆位点 I 型限制性核酸内切酶识别序列具有回文结构, 切割产生的粘性末端呈反向互补序列反向互补粘性末端存在, 可能降低 GoldenGate 克隆法的效率 [3] 为顺利实施 GoldenGate 克隆方案, 本实验将真核细胞表达载体 pegfp N1 进行改造, 在 pegfp N1 载体多克隆位点导入一段两端含有 BsmBI 酶切位点的外源 DNA 片段, 构建了 pegfp N1 BsmBI 中间载体以 pt mexon8 为模板,ZTF/ZTR 为引物,PCR 扩增得到 594bp 的外源 DNA 片段, 经 BglI/EcoRI 双酶切, 将其克隆进入 pegfp N1 载体, 构建得到 pegfp N1 BsmBI 中间载体 ( 图 1) 图 1 中间载体 pegfp N1 BsmBI Fig.1 Therecombinantintermediatevector GoldenGate 克隆法组装同源重组靶向载体靶向载体构建方案示意图见图 2 首先用琼脂糖凝胶定量, 调整目的片段 B1L Red1 B1R 及 B8L Red8 B8R 浓度至 45ng/μl, 调整中间载体质粒 pegfp N1 BsmBI 浓度至 80ng/μl 采用 10μl 反应体系 :10U/μl Esp3I0.8μl,10 Tangobufer1μl,10μmol/LDTT1 μl,20u/μlt4dna Ligase(HC)0.75μl,25μmol/l ATP0.4μl,3 个插入片段各 1μl, 中间载体 pegfp N1 BsmBI1μl, 用 ddh 2 O 补至 10μl 反应条件:37 5 min,16 5min, 共 25 个循环,80 灭活 20min 取 5μl 连接产物转化 DH5a 感受态细胞过夜 37 培养, 挑 20 个长势良好的单克隆菌落,LB 平板划线 37 培

2013,33(3) 梁龙等 : GoldenGate 克隆法构建靶向载体 113 养, 培养 6h 后做菌落 PCR 筛选阳性克隆为检测中间载体经 BsmBI 内切酶消化后在体系中的自连率, 平行做阴性对照实验, 对照组反应体系只加中间载体 pegfp N1 BsmBI, 不加线性目的片段图 3 中间载体 pegfp N1 BsmBI 鉴定 Fig.

2 Theschematicdiagram of constructtargetingvector 2 结果与分析 2.

2 反应系统中缓冲液对酶活性影响分析及载体组装由于酶活性受反应溶液的影响很大, 而 BsmBI 和 DNA 连接酶共处同一反应体系, 故应选择能够同时满 [8] 足两种酶促反应的缓冲系统根据 Sanjana 等报道, 将 BsmBI 和 T7DNA 连接酶置于 Tangobufer 中, 连接了 6 个 DNA 片段我们决定尝试在 BsmBI 适宜的 Tangobufer 中采用

3 2013,33(3) 梁龙等 : GoldenGate 克隆法构建靶向载体 113 养, 培养 6h 后做菌落 PCR 筛选阳性克隆为检测中间载体经 BsmBI 内切酶消化后在体系中的自连率, 平行做阴性对照实验, 对照组反应体系只加中间载体 pegfp N1 BsmBI, 不加线性目的片段图 3 中间载体 pegfp N1 BsmBI 鉴定 Fig.3 Identificationoftherecombinant intermediatevector M:DL10000marker;1:Productsofenzyme restrictionanalysis;2:positiveplasmid 图 2 载体 pegfp N1 me1 HR 和 pegfp N1 me8 HR 构建示意图 Fig.2 Theschematicdiagram of constructtargetingvector 2 结果与分析 2.1 中间载体 pegfp N1 BsmBI 酶切鉴定用 BsmBI 酶切中间载体 pegfp N1 BsmBI, 理论酶切片段大小是 4722bp 与 571bp( 图 1) 由图 3 可知, 酶切结果与理论设计一致, 说明载体 pegfp N1 多克隆位点成功引入 BsmBI 酶切位点,pEGFP N1 BsmB I 中间载体构建成功 2.2 反应系统中缓冲液对酶活性影响分析及载体组装由于酶活性受反应溶液的影响很大, 而 BsmBI 和 DNA 连接酶共处同一反应体系, 故应选择能够同时满 [8] 足两种酶促反应的缓冲系统根据 Sanjana 等报道, 将 BsmBI 和 T7DNA 连接酶置于 Tangobufer 中, 连接了 6 个 DNA 片段我们决定尝试在 BsmBI 适宜的 Tangobufer 中采用 T4DNA 连接酶进行 GoldenGate 克隆实验将 BsmBI 和 T4DNA 连接酶置于 1 Tango bufer 中, 添加三个目的基因 PCR 片段和 pegfp N1 BsmBI 载体, 分析反应体系缓冲系统对两种酶活性的影响由图 4 可知,1 3 5 泳道都有一条大约 570bp 的 DNA 片段, 该片段是 BsmBI 酶切中间载体 pegfp N1 BsmBI 后产生的片段 B1L Red1 和 B1R 三个片段连图 4 重组靶向载体组装图 Fig.4 Homologousrecombination targetingvectorasembly M:DL10000marker;1:pEGFP N1 me1 HR asembly;2:the controlofpegfp N1 me1 HRasemblywithoutBsmBIandT4DNA ligaseenzyme;3:pegfp N1 me8 HRasembly;4:Thecontrolof pegfp N1 Me8 HR asemblywithoutbsmbiandt4ligasedna enzyme;5:negativecontrol(onlyaddedpegfp N1 BsmBIwith BsmBIandT4DNAligaseenzyme) 接理论长度是 3009bp, 图 4 第 1 泳道在 2000~ 4000bp 之间有一条大约 3000bp 左右的暗带, 该条带应为三个插入片段连接后所得线性片段 B8L Red8 B8R 三个片段连接理论长度是 2523bp, 第 3 泳道在 2000~4000bp 之间有一条大约 2500bp 左右的暗带, 该条带应为三个插入片段连接后所得线性片段初步判断两个克隆体系中三个目的基因片段在该缓冲液中酶切连接成功成功组装的 pegfp N1 me1 HR 和 pegfp N1

3 重组靶向载体菌落 PCR 鉴定用 B1LF/B1RR 引物, 扩增目的片段 B1L Red1 和 B1R 片段连接产物 3103bp, 阳性对照用 pt mexon1 质粒 ; 用 B8LF/B8RR 引物, 扩增目的片段 B8L Red8 B8R 连接产物 2617bp, 阳性对照用 pt mexon8 质粒由图 5a 可知, 检测 20 个单克隆, 其中 2 3 5 14 15 17

4 114 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No me8 HR 线形载体, 理论序列大小分别为 7735bp 和 7 249bp 图 4 第 1 泳道在 4000~7000bp 之间有一条暗带, 应为成功组装的 pegfp N1 me1 HR 线形载体 ; 第 3 泳道在 4000~7000bp 之间有一条暗带, 应为成功组装的 pegfp N1 me8 HR 线形载体 2.3 重组靶向载体菌落 PCR 鉴定用 B1LF/B1RR 引物, 扩增目的片段 B1L Red1 和 B1R 片段连接产物 3103bp, 阳性对照用 pt mexon1 质粒 ; 用 B8LF/B8RR 引物, 扩增目的片段 B8L Red8 B8R 连接产物 2617bp, 阳性对照用 pt mexon8 质粒由图 5a 可知, 检测 20 个单克隆, 其中及 19 号样品 PCR 扩增片段大小与理论大小相符, 阳性率 40%; 由图 5b 可知, 检测 20 个单克隆, 其中及 16 号样品 PCR 扩增片段大小与理论大小相符, 阳性率 25% 段大小是 226bp 497bp 1208bp 和 5318bp 图 6 重组质粒酶切鉴定 Fig.6 Recombinantproductsof enzymerestrictionanalysis (a)m1:dl2000marker;1:bgli/hind Ienzymeresult;2:Bgl I/NcoIenzymeresult 3:Bgl I/EcoRIenzymeresult; M2: DL10000marker (b)m1:dl10000marker;m2:dl2000marke; 1:plasmid;2:BglIenzymeresults 图 5 菌落 PCR 筛选阳性克隆 Fig.5 Positivecloneselectionfrom singlecoloniespcr (a)m:dl10000marker;1~20:themonoclonalpcrofpegfp N1 me1 HR;21:ThemonoclonalPCR ofpegfp N1 BsmBI;22: Positivecontrol;23:Negativecontrol (b)m:dl10000marker;1 ~20:The monoclonalpcr ofpegfp N1 me8 HR; 21:The monoclonalcolonyofpegfp N1 BsmBI;22:Positivecontrol;23: Negativecontrol 2.4 重组靶向载体 pegfp N1 me1 HR 和 pegfp N1 me8 HR 的酶切鉴定针对 pegfp N1 me1 HR 质粒, 选择以下酶切组合鉴定 :1 BglI/Hind I, 酶切片段大小是 700bp 和 7 035bp;2BglI/NcoI, 酶切片段大小是 249bp 360bp 420bp 703bp 1133bp 1517bp 和 1544bp;3BglI/Eco RI, 酶切片段大小是 3022bp 和 4713bp 针对 pegfp N1 me8 HR 质粒, 选择 BglI 进行单酶切鉴定, 酶切片从图 6a 和图 6b 可知, 重组真核表达质粒 pegfp N1 me1 HR 和 pegfp N1 me8 HR 酶切验证正确 2.5 重组靶向载体测序结果 DNA 测序结果显示,BsmBI 酶切产生的粘性末端连接正确, 目的片段之间实现无缝连接 pegfp N1 me1 HR 和 pegfp N1 me8 HR 载体目的基因的理论序列与测序结果比对, 同源率分别是 99.87% 和 % 红色荧光蛋白报告基因序列同理论序列完全一致, 突变位点都不在编码区 pegfp N1 me8 HR 载体在 B8RF 引物处缺失一个碱基 C( 图 7d), 可能是引物造成 3 讨论 [9] 1972 年,Gof 等首次在体外实现了两种 DNA 分子的重组伴随基因工程发展, 生物学家建立了多种 DNA 体外重组方法 [1] GoldenGate 克隆法能够高效实现 DNA 片段间无缝连接, 自 2008 年报道后, 已经在合成生物学 [10] 人 [4,6 8] 工核酸酶和人工转录因子构建方面被采用 GoldenGate 克隆方案实施过程中, 需要注意以下几点第一,DNA 片段之间连接的粘性末端序列设计理论上 4 个碱基的粘性末端有 256 种碱基排列, 其中回文序列有 16 种排列, 为防粘性末端自连而降低克隆效率, 设计者应该选用其他 240 种非回文排列序列 [3] 第二, 选择合适的缓冲液内切酶和连接酶同

2013,33(3) 梁龙等 : GoldenGate 克隆法构建靶向载体 115 因片段, 连接效率分别是 25% 和 40%, 而且阴性对照酶切连接反应转化涂板后, 产生大量单克隆菌落, 说明中间载体自连率较高若要提高最终构建载体克隆阳性率, 设计时可在中间载体替换序列中再引入一个 BsmBI 酶切位点, 能够降低中间载体的自连率, 提高 GoldenGate

5 2013,33(3) 梁龙等 : GoldenGate 克隆法构建靶向载体 115 因片段, 连接效率分别是 25% 和 40%, 而且阴性对照酶切连接反应转化涂板后, 产生大量单克隆菌落, 说明中间载体自连率较高若要提高最终构建载体克隆阳性率, 设计时可在中间载体替换序列中再引入一个 BsmBI 酶切位点, 能够降低中间载体的自连率, 提高 GoldenGate 克隆法连接目的基因的效率由于该构建方案采用了 PCR 扩增, 载体最终构建结果必需通过测序证实为降低 PCR 的突变率, 应该用高保真 DNA 聚合酶参考文献 [1] Marsischky G, LaBaerJ. Many paths to many clones: a comparativelookathigh throughputcloningmethods.genome Research,2004,14: [2] EnglerC,KandziaR,MarilonnetS.A onepot,onestep, precisioncloningmethodwithhighthroughputcapability.plos ONE,2008,3(11):e3647. [3]EnglerC,GruetznerR,KandziaR,etal.Goldengateshufling:a one potdna shufling method based on type IS restriction enzymes.plosone,2009,4(5):e5553. [4]MorbitzerR,ElsaeserJ,HausnerJ,etal.Asemblyofcustom TALE typedna bindingdomainsbymodularcloning.nucleic AcidsRes,2011,39(13): 图 7 重组靶向载体测序 Fig.7 SequenceofHomologous recombinationtargetingvector Thejointsbetweentheinterestinggenefragmentswereunderlinedto confirmthevalidityofthemethod.(a)thejointsbetweenred1and B1L (b) ThejointsbetweenRed1andB1R (c) Thejoints betweenred8andb8l (d)thejointsbetweenred8andb8r 时存在于同一反应体系, 缓冲液的选择尤为重要而 NEB 公司关于 T4DNA 连接酶使用说明显示, 在限制性核酸内切酶 4 种 NEBufer 中,T4DNA 连接酶都具有有效活性 1 据此能够推断, 多数情况下, Golden Gate 克隆法的反应体系可以考虑首选限制性内切酶的缓冲液第三, 控制反应体系中目的片段及载体的浓度在内切酶含量一定的情况下, 若目的片段及载体浓度过高, 可能会造成不完全酶切本实验反应体系中, 三个目的片段终浓度为 4.5ng/μL, 载体为 10ng/ [6] μl 第四, 中间载体酶切位点设计 Weber 等用 GoldenGate 克隆法组装人工转录激活样效应子, 连接目的片段达 9 个时, 连接效率降低本实验连接 3 个基 [5] SzybalskiW,Kim SC,HasanN,etal.Clas ISrestriction enzymes areview.gene,1991,100: [6]WeberE,GruetznerR,WernerS,etal.Asemblyofdesigner TALefectorsbygoldengate.PLoSOne,2011,6(5):e [7]CermakT,DoyleEL,ChristianM,etal.Eficientdesignand asembly ofcustom TALEN and other TAL efector based constructsfordna targeting. NucleicAcidsRes,2011,39 (12):e82. [8]SanjanaNE,CongL,ZhouY,etal.Atranscriptionactivator like efectortoolboxforgenomeengineering.natprotoc,2012,7 (1): [9]GofSP,BergP.ConstructionofhybridvirusescontainingSV40 and lambda phage DNA segmentsand theirpropagation in culturedmonkeycels.cel,1976,9:695. [10] WeberE,EnglerC,GruetznerR,etal.A modularcloning systemforstandardizedasemblyofmultigeneconstructs.plos One,2011,6(2):e htp:// asp

6 116 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No AsemblyofTargetingVectorbyGoldenGateCloning LIANGLong 1 YANGHua 2,3 YANGYong lin 2,3 LIUShou ren 2,3 PIWen hui 2,3 (1ColegeofAnimalScience&Technology,ShiheziUniversity,Shihezi ,China) (2AnimalHusbandryandVeterinaryInstitution,XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationScience,Shihezi ,China) (3KeyLabofSheepBreedingandReproduction,XinjiangAgroreclamationAcademyofSciences,Shihezi,Xinjiang ,China) Abstract The GoldenGate cloningisbasedontheabilityoftype ISrestrictionenzymesandDNA ligaseenzymestoasemblemultipledna fragmentsinadefinedlinearorderinonetubeandonestep.the methodiseficientandyieldsrecombinantvectorsthatdonotcontainunwantedsequencesinthefinalconstruct afterjustashorttimerestriction ligation.toeditmouseβcaseingene,recombinationtargetingvectorsofthe mouseβcaseingenetargetinglocuswereconstructedbythe GoldenGate cloning. Keywords DNArecombination GoldenGate cloning Mouseβcaseingene

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

112 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No DH5α pdsred2 1 载体 pegfp N1 载体 包含小鼠 β 酪蛋白基因第一和第八外显子两端同源臂序列的 T 载体 限公司 ;Esp3I(BsmBI) 购自 Fermentas;T4DNALig

112 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No DH5α pdsred2 1 载体 pegfp N1 载体包含小鼠 β 酪蛋白基因第一和第八外显子两端同源臂序列的 T 载体限公司 ;Esp3I(BsmBI) 购自 Fermentas;T4DNALig