6. 玻璃涂布棒 7. DNA 模板 ( 或 cdna) 8. DNA 聚合酶 (Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase, 诺唯赞, catalog number: P505-d1) 9. dntp 10. 引物 11. 双蒸水 12. Gene Ruler

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杆拍雍
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PCR 扩增及克隆基因 PCR Amplification and Gene Cloning 徐远涛, 徐强 * 园艺植物生物学教育部重点实验室, 园艺林学学院, 华中农业大学, 武汉 * 通讯作者邮箱 :xuqiang@mail.hzau.edu.cn 引用格式 : 徐远涛, 徐强. (2018). PCR 扩增及克隆基因. Bio-101 e1010202. Doi: 10.

1 PCR 扩增及克隆基因 PCR Amplification and Gene Cloning 徐远涛, 徐强 * 园艺植物生物学教育部重点实验室, 园艺林学学院, 华中农业大学, 武汉 * 通讯作者邮箱 :xuqiang@mail.hzau.edu.cn 引用格式 : 徐远涛, 徐强. (2018). PCR 扩增及克隆基因. Bio-101 e Doi: /BioProtoc How to cite: Xu, Y. T. and Xu, Q. (2018). PCR amplification and gene cloning. Bio-101 e Doi: /BioProtoc (in Chinese) 实验原理 :PCR (polymerase chain reaction) 的原理是在模板 DNA 引物和 4 种脱氧核糖核苷酸 (dntp) 存在的条件下, 依赖于 DNA 聚合酶的体外酶促合成反应两个引物分别位于靶序列的两端, 同两条模板的 3' 端互补, 由此限定扩增片段 PCR 反应由一系列的变性 - 退火 - 延伸反复循环构成, 即在高温下模板双链 DNA 变性解链, 然后在较低的温度下同过量的引物退火, 再在适中的温度下由 DNA 聚合酶催化进行延伸由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板, 因此扩增产物的量呈指数级增加 PCR 之后通过胶回收得到纯化的目的基因片段, 连接到克隆载体质粒中, 转入大肠杆菌细胞, 质粒随着大肠杆菌细胞的快速繁殖也快速复制, 富集大肠杆菌细胞抽提质粒即可得到大量的克隆质粒实验目的 : 通过 PCR 扩增目的基因片段, 并利用大肠杆菌转化获得单克隆质粒, 用于测序基因序列分析特异探针构建及后续表达载体构建关键词 :PCR, 大肠杆菌, 转化, 克隆, 质粒材料与试剂 1. 各种型号枪头 2. 离心管 3. PCR 用八连管 4. 矿物油 5. 封口膜 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1

2 6. 玻璃涂布棒 7. DNA 模板 ( 或 cdna) 8. DNA 聚合酶 (Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase, 诺唯赞, catalog number: P505-d1) 9. dntp 10. 引物 11. 双蒸水 12. Gene Ruler (Thermo Scientific Gene Ruler 1 kb DNA ladder, catalog number: SM0311) 13. 琼脂糖 14. 核酸染料 (GelRed) 15. 冰醋酸 16. NaCl 17. 胰蛋白胨 18. 酵母提取物 19. 琼脂粉 20. 琼脂糖胶纯化试剂盒 (Gel Extraction Kit, OMEGA, catalog number: D ) 21. 克隆质粒 (Zero-Background P-Topo-Blunt Simple Cloning Kit, Aidlab, catalog number: CV17) 22. Trans 5α E. coli 感受态细胞 ( 全式金生物科技有限公司 ) 23. 质粒提取试剂盒 (AxyPrep Plasmid Kit, AXYGEN, catalog number: 21515KA1) 24. TAE 缓冲液 ( 见溶液配方 ) 25. 氨苄霉素 ( 见溶液配方 ) 26. LB 培养基 ( 见溶液配方 ) 仪器设备 1. 涡旋仪 2. 小离心机 3. PCR 仪 4. 电泳仪 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2

3 5. 凝胶成像系统 6. 切胶仪 7. 离心机 ( 配备 1.5 ml 转头 ) 8. 恒温水浴锅 9. 恒温摇床 10. 恒温培养箱 11. 酒精灯 12. 制胶槽 13. 梳子 14. 手术刀 15. 超净工作台 16. 细胞培养平板实验步骤 1. PCR 引物设计 1.1 引物长度约为 bp, 太短会降低退火温度影响引物与模板配对, 从而使非特异性增高 ; 太长则比较浪费, 且难以合成 1.2 引物中 G+C 含量通常为 40%-60%, 可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T) 1.3 引物 Tm 值控制在 C 之间 1.4 四种碱基应随机分布, 在 3' 端不存在连续 3 个 G 或 C, 因这样易导致错误引发 1.5 在引物内, 尤其在 3' 端应不存在二级结构 1.6 两引物之间尤其在 3' 端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量两引物间最好不存在 4 个连续碱基的同源性或互补性 1.7 引物 5' 端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点核糖体结合位点起始密码子缺失或插入突变位点以及标记生物素荧光素地高辛等通常应在 5' 端限制酶位点外再加 1-2 个保护碱基 1.8 正反向引物的 Tm 值以及 GC 含量应尽量一致 ; 引物额外附加序列, 即与模板非配对序列, 不应参与 Tm 值计算 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 3

4 1.9 推荐引物设计软件 :Primer PCR 反应 2.1. 严格按照 DNA 聚合酶产品说明书在 PCR 仪上设置 PCR 反应程序, 一般程序为 : Step 1: 95 C 3 min 预变性 Step 2: 95 C 30 s 变性 Step 3: 55 C 30 s 退火 Step 4: 72 C s/kb 延伸, 时间依据 PCR 产物长度而定 Step 5: goto Step 2-4,34 个循环循环扩增 Step 6: 72 C 10 min 充分延伸 Step 7: 12 C 30 min 反应种植, 低温保存 2.2. PCR 反应体系 : 严格按照 DNA 聚合酶产品说明书配比一般体系 (50 μl) 为 : 2x PCR Buffer dntp (10 mm) Primer F (10 mm) Primer R (10 mm) 模板 DNA (100 ng/μl) 25 μl 1 μl 2.5 μl 2.5 μl 2 μl Phanta DNA 聚合酶 (2.5 U) 1 μl 双蒸水 16 μl 2.3. PCR 体系配好后轻微涡旋混匀, 分装到八连管中, 稍离心, 每管滴入一滴矿物油 2.4. 将配好体系的八连管放入 PCR 仪中, 运行程序 3. 琼脂糖凝胶电泳检测 3.1. 用 1x TAE 配制 1.5% 浓度琼脂糖胶 (60 ml TAE 加 0.9 g 琼脂糖 ), 微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解, 自来水冷却至约 C ( 体感可承受 ), 滴入一滴核酸染料, 摇匀后倒入放有制胶托板的制胶槽 ( 中号,13x50 μl 孔 ) 中, 插入梳子 (50 μl), 冷却凝固 15 min 3.2. 将 PCR 反应液全部加入到制好的琼脂糖胶孔中, 加入适当大小的 Marker ( 一般为 1 kb Gene Ruler),100 V 电泳 30 min Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 4

5 3.3. 取出琼脂糖胶放入凝胶成像系统中拍照, 检查扩增产物目标条带 4. 目的条带回收纯化 : 参照 Marker 条带分子量大小, 判断目的片段条带, 用手术刀在紫外发光仪上切取目的条带胶块, 参照胶回收试剂盒说明书回收纯化目的基因片段, 并用 NanoDrop1000 检测胶回收产物浓度 5. 目的片段与克隆载体连接 : 依据克隆载体说明书建立连接体系以 P-Topo-Blunt 载体为例 : P-Topo Vector 1 μl Enhancer Buffer 1 μl 目的片段回收产物 20 ng/kb ( 依据产物长度而定 ) 双蒸水补齐至 5 μl 将以上试剂按顺序加入到 200 μl 带盖 PCR 管中, 然后在 PCR 仪上 25 C 孵育连接, 孵育时间根据目的基因片段长度而定,15 min/kb 6. 转化感受态细胞 : 6.1. 开启超净工作台风机, 紫外灯灭菌 15 min 6.2. 超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞 ( 每管 100 μl) 放冰上融化, 在超净工作台上用无菌的 1.5 ml 离心管将大肠杆菌感受态细胞分装为两管, 每管 50 μl 6.3. 在超净工作台上将连接产物全部加入到大肠杆菌感受态细胞中, 轻轻吸打混匀, 冰上孵育 30 min 此间打开恒温水浴锅, 设置温度为 42 C 6.4. 将孵育后的感受态细胞放入 42 C 水浴锅中热激 90 s, 迅速取出放冰上静置 2 min 6.5. 热激后的感受态细胞中加入 400 μl 液体 LB 培养基,37 C 恒温摇床上 220 rpm 转速培养活化 1 h 6.6. 取一瓶 150 ml 固体 LB 培养基在微波炉中加热融化后自来水降温至 C, 加入 150 μl 氨苄霉素, 摇匀后倒皿, 制成细胞培养平板, 冷却晾干 6.7. 酒精灯外焰烧玻璃涂布棒, 冷却待用 6.8. 从活化 1 h 后的 400 μl 菌液中吸取 200 μl 到制好的细胞培养平板上, 用烧过的玻璃涂布棒均匀涂皿至不能看到菌液, 稍吹干 6.9. 将涂好的细胞培养皿用封口膜封口, 倒置放入 37 C 恒温培养箱培养 h Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 5

6 7. 挑取单克隆 7.1. 取一瓶 50 ml 液体 LB 培养基, 超净工作台上加入 50 μl 氨苄霉素摇匀, 分装到无菌的 1.5 ml 中, 每管 500 μl 7.2. 用 10 μl 枪头在细胞培养平板上挑取单克隆斑点, 在装有液体 LB 培养基的离心管中吸打 2-3 下, 将菌斑接种到液体 LB 培养基中每个平板挑取 8 个单克隆斑点 7.3. 接种后的液体 LB 培养基在 37 C 恒温摇床上 220 rpm 转速培养 5-8 h 7.4. 菌液 PCR 检测阳性 : 吸取 0.5 μl 菌液作为模板进行 PCR 反应扩增目的基因 7.5. 根据菌液 PCR 检测结果, 挑取 3-4 个阳性克隆菌液送公司测序一般吸 200 μl 菌液送测序公司检测, 剩余菌液暂时放 4 C 冰箱保存 8. 单克隆质粒提取 : 根据测序结果, 选取序列正确无误的阳性克隆菌液接种到 ml 含氨苄霉素的液体 LB 培养基中,37 C 恒温摇床上 220 rpm 转速培养 12 h, 用质粒提取试剂盒提取质粒注意事项 1. PCR 试剂应放在冰上融化, 用完后及时放回 -20 C 冰箱 2. PCR 是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的, 因此, 在进行 PCR 前, 模板的纯化和引物设计尤为重要 3. 进行 PCR 实验时为了保证实验的可靠性, 需要设置阴性对照 ( 不加 DNA, 以双蒸水为模板 ) 和阳性对照 ( 确定一定可以扩出目的条带的模板 ) 4. 切胶回收时尽量只切取目的条带, 切下胶块尽量薄, 减少杂质污染 5. 大肠杆菌转化过程均应在超净工作台操作, 所用的离心管枪头培养基均需要 121 C 15 min 灭菌 6. 本实验所用的克隆载体 Topo-Blunt 为平末端克隆载体, 高保真酶 PCR 产物一般均为平末端产物, 所以可以直接连接转化若用 Pmd18-T 载体 ( 粘性末端 ) 做 TA 克隆, 用高保真酶 PCR 产物需要加 1 μl Taq 酶 72 C 孵育 5 min, 在 PCR 产物 3 端加一个 A 碱基使之成为粘性末端 (Taq 酶 PCR 产物 3 端会多出一个 A 碱基 ) Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 6

7 溶液配方 1. TAE 缓冲液先配制 50x TAE, 称取 242 g Tris 37.2 g Na2EDTA 2H2O 倒入 1 L 蓝盖瓶中, 然后加入 800 ml 的双蒸水, 充分搅拌溶解, 加入 57.1 ml 的冰醋酸, 充分混匀加双蒸水定容至 1 L, 室温保存需要使用的时候, 稀释为 1x TAE 作为工作液一般使用 10 L 的带嘴塑料壶, 倒入 200 ml 50x TAE, 再用双蒸水定容至 10 L, 混匀备用 2. 氨苄霉素 5 g 氨苄霉素粉末溶解于 100 ml 双蒸水中, 配成浓度为 50 mg/ml 的氨苄霉素溶液, 0.22 μm 微孔滤膜过滤灭菌后分装为 1 ml 每管,-20 C 冻存使用时以 1:1,000 的比例加入到 LB 培养基中, 终浓度为 50 μg/ml 3. LB 培养基 1 L 固体 LB 培养基成分为 10 g NaCl 10 g 胰蛋白胨 5 g 酵母提取物 15 g 琼脂粉, 加水定容至 1 L,121 C 15 min 灭菌液体 LB 不加琼脂粉 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 7

实验室常用培养基的配制方法

实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin( 氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 配制方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 ; 2. 加入 40 ml 灭菌水, 充分混合溶解后, 定容至 50 ml; 3. 用 0.22 µm 过滤膜过滤除菌 ; 4. 小份分装 (1 ml/ 份 ) 后,-20 保存 IPTG(