卷期 %"' "'" '# 草业科学!! "#$"%" "& 植物生产层林烟草个防卫反应信号蛋白编码基因的克隆及植物表达载体的构建路子峰 " 张超 " 李彦忠草地农业生态系统国家重点实验室兰州大学草地农业科技学院甘肃兰州 " " 中国农业科学院生物技术研究所北京 % 摘要为

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行瓦杭
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1 卷期 %"' "'" '# 草业科学 "#$"%" 植物生产层林烟草个防卫反应信号蛋白编码基因的克隆及植物表达载体的构建路子峰 " 张超 " 李彦忠草地农业生态系统国家重点实验室兰州大学草地农业科技学院甘肃兰州 " " 中国农业科学院生物技术研究所北京 % 摘要为了分析林烟草基因对烟草花叶病毒 ()**+ ) *, -./ 产生抗性的信号途径培育抗 / 植物新品种选取!"# "!$" #"% &'"' #" 作为候选基因以林烟草总为模板通过反转录分别克隆上述 % 个基因的片段通过添加酶切位点以及酶切连接和转化成功构建了上述 % 个信号蛋白的载体酶切验证结果表明所构建的 % 个载体的结构正确可以用于进一步的遗传转化试验这为分析基因对 / 产生抗性所依赖的信号途径奠定了基础关键词林烟草烟草花叶病毒干扰中图分类号 0'&" 文献标识码文章编号 "' "# %!"! # $" %#&%#! " #'! 1 " 1 ) " 2)3 4)4 5 6)(-)4-6-)) 7-* ) 4-)- *.4.- * * ) 7 * 6) 3., -46) 3.") "8 4 * 6)-* *) *.4.-)* *8%) #"%# -7-4) ) )4 74()** + ) *, -. / -4) * ) 9)4 :)6 ) 7(-79) 4-4) *9 * 4 /4 *.7!"# "!$" #"% &'"' #" : -*4 7) *) 7 7)4 4) :);4-)*4 7) 4 +9)4) 74-) +4 : - *7(64-74 : 4 )99-9- )4 36+ )) 74-) -+)4, *4-44 : -.**.6* 4-.*4 7, *4- *) (.7-4 *4-) -+)4 ;9 - +4) *4.- : - * -+ 7(64 ) , *4- ) 7. 7)4 -) ) )4 7 /-4) * ) 9)4 :)6 ()**+ ) *, *! # 2)3! +) * 迄今为止从不同的寄主植物中已分离并鉴定了近百个基因分别对线虫真菌细菌等不同的病原物表现抗性根据生物信息学分析目前已克隆的大部分基因编码蛋白都属于 8 家收稿日期 " & 接受日期 " # 基金项目中央级公益性科研院所基本科研业务费 "1& 全国优秀博士学位论文资助项目 " % 教育部博士点基金 "" 国家自然科学基金 "' 第一作者路子峰 '% 男河南辉县人硕士研究方向为草地病害综合防治! +) * 通信作者李彦忠 ' ' 男甘肃会宁人教授博导博士主要研究方向为草地植物病理学! +) *

2 " " 族根据基因对基因假说在非亲和性病原物侵染后寄主植物的抗病基因 4) * 能够直接或间接识别病原菌无毒基因, -. *,- 蛋白与,- 因子的特异性互作主要存在两种模式直接作用模式与间接作用模式是超敏反应 69-4, -9 发生的必要条件反应可以诱导病程相关 )4 - )4 7 蛋白的表达激活植物抗病信号传导途径植物主要的防卫反应信号传导途径至少有两个水杨酸途径和茉莉酸乙烯! 途 & 径不论是途径还是! 途径都有很多防卫反应信号蛋白调节及! 的生成积累最终影响植物的抗病反应研究表明 &!)- 4 是调控途径的 # # 种重要信号蛋白而 )- 可以调 % 控! 途径其中 & 与三酰甘油脂肪酶基因同源是抗病基因介导植物抗性必不可少 ' 的! 是一种脂肪酶可以水解某种脂质底物介导蛋白产生抗性 )- 蛋白包含一对被称为和的个氨基酸的锌 % 指结构在植物中与直接互作为作用于下游的信号组件抑制的积累是途径一个重要的调控蛋白是茉莉酸敏感缺陷基因编码产物其突变体表现雄性不育 )- 蛋白作用于位点的下游对途径进行负调 " 控是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶作为乙烯反应的负向调节因子在乙烯受体的下游发生作用烟草花叶病毒 ()** / ) * -./ 是烟草花叶病毒属的代表种也是世界上第个被发现和确定的病毒 / 通过汁液传播寄主范围比较广可侵染十字花科茄科菊科及苋科等 & 科 # 种植物是一种重要的农业病毒林烟草基因编码蛋白是一种属 # 于 8 家族的蛋白可识别 / 的外壳蛋白产生超敏反应介导对 / 的抗性但是究竟哪些信号蛋白及防卫反应信号转导途径参与基因介导对 / 的抗性反应迄今仍然不清楚因此探讨参与基因介导对 / 的抗性反应的相关信号蛋白及防卫反应信号途径对培育植物抗 / 新品种有重要的意义干扰技术被广泛应用于基因功能的鉴定基因治疗和功能基因组的研究 ( 总的提取将林烟草的种子播种在花盆中浇适量水并用保鲜膜覆盖周后种子会长成小苗将小苗移入花盆中进行培养两周后取林烟草幼嫩的叶片按照, 说明用 - 3 法提取总所提取的总经过琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下检测其完整性并用 ) 7-9 测定 " "% 的比值 ) 引物设计引物设计包括 % 个目的基因克隆引物设计和正义片段反义片段克隆引物的设计 % 个目的基因引物设计根据所选林烟草的!"# "!$" #"% &'" ' #"% 个基因的 * 序列或其他寄主植物中的同源基因序列设计引物表克隆林烟草的上述 % 个基因片段正义片段和反义片段引物的设计测序由中国农业科学院重大工程测序中心完成根据测序结果基因 #" ' #" % & '"!" # " 表基因克隆引物 *" +$ % 引物 # & & # # # )- )- # #!! # )- )- 序列 #.* # 5!$" # 4 4

3 草业科学第卷期 " 设计引物扩增目的基因的正义片段和反义片段并在两端加上相应的酶切位点正义片段的 # 端添加酶切位点端添加 9 酶切位点反义片段 # 端添加 ) 端添加 () 添加 8)+ 酶切位点酶切位点表 ", 目的基因片段的扩增目的基因片段的扩增采用方法获得 * 的反应体系为引物 # 共 #" < 反应 # + 冰浴 " + 反应产物中加入以下试剂 "#++ 7# 表 ) 正反义片段克隆引物 *")+$ -" ". " $ #% 基因 #" ' #" % & '"!" # "!$" 引物 # & = & = # & & # = = # #= = # # )-= )-= # )- )- # = = # #!=!= #!! # )- = )- = # )- )- # 4 = 4 = # 4 4 序列 #.* # 注有下划线的碱基为酶切位点 = 代表正义片断克隆引物代表反义片断克隆引物 ()-4- *436+ *.4 4 = :)-7 -) +4* , - -) +4*

4 "% / / 反转录酶 #>8.-# 抑制剂 # 无酶 77 " 总体积 "#&" < 反应反转录合成 *" < 反应 + 灭活 $"< 保存备用扩增目的片段的反应体系为 *# 引物和引物各 # - +4)- 聚合酶 ##> 8.- "#++ $ 7 # 用双蒸水补足 # '& < 预变性 +'& < 变性 % < 每 " < 为一个梯度退火 " < 延伸 + 各 " 个循环 '& < 变性 ##< 退火 "< 延伸 +# 个循环 " < 充分延伸 + 所克隆目的基因片段与 9/% +9 载体相连所克隆的目的片段经过琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下切下目的基因片段并用 ;6 凝胶回收试剂盒进行回收然后将所回收的目的基因片段与 9/% +9 载体相连本试验所采用的 9/% +9 载体购于 )?)-) 公司连接体系如下目的片段 "9/% +9, *4- #.4 "# 共 # < 水浴过夜连接产物采用热激法转化大肠杆菌转化菌株为 # 挑取转化后的阳性菌落进行测序并保存测序正确的质粒 / 正义片段和反义片段的克隆按照体系和程序以测序正确的质粒为模板用正反义片段克隆引物分别扩增正义片段和反义片段将扩增的片段连接 9/% +9 载体并测序连接体系和反应条件同, 连接产物采用热激法转化大肠杆菌转化菌株为 # 提取测序正确的菌液质粒备用将含有正义片段的质粒命名为 = 含有反义片断的质粒命名为为相应基因的名称下同 (0 植物表达载体的构建植物表达载体的构建如图所示第步将 % 个基因的正义片段从相应的质粒上 = 用和 9 酶切下连入经过相同限制性内切酶处理过的植物中间载体 9 酶切体系为质粒 = 或者中间载体 9# 9 图载体构建流程图 - ( *" "$# %#&%#.%#

5 8.-&8 用 77 " 补足 < 水浴过夜酶切酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下切下目的片段并用 ;6 凝胶试剂盒回收将 % 个基因片段的回收产物分别与中间载体 9 进行连接连接体系为载体骨架 9 目的片段 - +) & 连接酶 #)8.- 用 77 " 补足 < 过夜将连接产物命名为 9 = 连接产物通过热激法大肠杆菌转化菌株为 # 挑取阳性克隆提取质粒并用和 9 进行双酶切验证保存酶切验证正确的质粒备用第 " 步将 % 个基因的反义片段从相应的质粒上用 () #" 基因用 8)+ 和 ) 酶切下来用相同的限制性内切酶处理第步中已构建好的 9 = 质粒并将从上切下的 % 个基因片段分别与 9 = 连接酶切体系为质粒或者 9 =# () #" 基因用 8)+ ) 8.-8 用 77 " 补足 < 水浴过夜酶切酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下目的片段并用 ;6 凝胶试剂盒回收回收后将 % 个基因片段分别与中间载体 9 = 进行连接连接体系及反应条件与第步相同连接产物命名为 9 = 将连接产物通过热激法大肠杆菌转化菌株为 # 挑取阳性克隆提取质粒并用 4 和 () 进行双酶切验证保存酶切验草业科学第卷期证正确的质粒备用第步将 % 个基因的正义片段和反义片段用 4 和 ) 从 9 = 上同时切下与植物表达载体 9/" # 连接酶切体系为质粒 9 = 或者 9/" ##4 ) 8.-8 用 77 " 补足 < 水浴过夜酶切酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下切下目的片段并用 ;6 凝胶试剂盒回收将 % 个基因的回收产物分别与植物表达载体 9/" # 连接连接体系及反应条件与第步相同将连接产物命名为 9/" 连接产物通过热激法转化大肠杆菌转化菌株为 # 挑取阳性克隆提取质粒并用 4) 和 () 进行酶切验证保存酶切验证正确的质粒酶切验证正确的质粒即为本试验所要构建的载体 ) "' )( 林烟草总的提取和目的基因片段的克隆对提取的林烟草进行了电泳检测和分析结果表明完整性和纯度较好可以用于后续的以林烟草总为模板反转录制备 * 随后以获得的 * 为反应的模板用基因克隆引物扩增目的基因片段并经电泳检测图 " 回收目的片段并分别与载体连接挑取阳性克隆进行测序测序结果显示扩增获得的目的图 )*1+ 扩增的个信号蛋白编码基因片段 - ()$! %"#% " $ ##"! # *1+

9 连接连接产物命名为 9 = 用和 9 双酶切 9 = 进行酶切验证分别得到了与目的基因大小相同的片段图 & 将反义片段连入含有正义片段的中间载体 9 连接产物命名为 9 = 用 4 和 () 酶切 9 = 都分别得到了两条大小不同的片段并且两个片段大小相差 "(9 左右

6 "% 片段大小如下 (9 #"#&(9' #" "%#(9% & "' (9'" %#(9!" %(9 # "(9!$#(9 )() 载体的构建正义片段和反义片断的获得以测序正确的质粒为模板分别用正义引物和反义引物表 " 扩增 % 个基因的正义和反义目的片段图将扩增得到的目的片段分别与载体相连并进行测序测序结果显示所扩增的目的片段序列及所添加的酶切位点正确载体构建各步骤的酶切验证将 % 个目的基因的正义片段分别与中间载体 9 连接连接产物命名为 9 = 用和 9 双酶切 9 = 进行酶切验证分别得到了与目的基因大小相同的片段图 & 将反义片段连入含有正义片段的中间载体 9 连接产物命名为 9 = 用 4 和 () 酶切 9 = 都分别得到了两条大小不同的片段并且两个片段大小相差 "(9 左右正好是中间载体上正义片段和反义片段中间的内含子片段的长度图 # 将正义片段和反义片段同时连入植物表达载体 9/" # 连接产物命名为 9/" 用 () 4 和 ) 酶切 9/" 同样得到了两条大小不同的片段并且两个片段大小相差 "(9 左右图上述酶切验证结果均符合试验设计要求所构建的 % 个干扰载体可以用于后续的遗传转化试验, 植物的基因组编码了上百种基因这些基因图,+ 扩增的正义片段和反义片断 - (,$! %"#-"" $ #". " $ # + 图 /! 1 1- 的和! 的双酶切鉴定 - (/ & #%# $## %"#! 1 1- "!

7 草业科学第卷期 "% 图 0! 1 1- 的 +# 和 " 双酶切鉴定 - (0 & #%# $## %"#! 1 1-+# "" 图!2),331 的 +# " 和 " 酶切鉴定 - ( #%# $## %"#!2),331 +# " "" 使植物对一系列的病原微生物包括病毒产生了抗性基因编码 8 蛋白细胞内的蛋白介导了成对的 8 蛋白和,- 蛋白的识别基因的下游基因突变后某些基因产物介导的植物抗病性会发生变化暗示基因介导了某些特定 & 抗性但是那些下游基因参与了基因介导的抗性目前尚未见报道干扰是由与生物内源 + 同源的双链介导的一种典型的转录后基因沉默现 % 象 ''# 年技术由. 和 ' " 在研究反义技术时发现 ''% 年 = - 等第次将该技术应用于实践本研究选用了 % 个下游基因并成功构建了其相应的植物表达载体为下一步遗传转化和深入研究基因介导的抗性所依赖的信号途径奠定了坚实基础植物表达载体的构建需要一系列的酶切连接和转化其中酶切效率是重要的影响因素针对酶切所回收对象的不同本试验中采取了以下策略如果酶切后回收载体骨架尽可能的少加质粒目的是为了保证所加质粒被完全切开如果回收目的片段那么应该尽可能的多加质粒使酶的效率达到最大通常所回收的目的片段与载体大小相差很大经过电泳后很容易在紫外灯下将两者分开这样可以保证得到很纯并且最大量的目的片段大载体骨架酶切产物回收后取进行电泳后如果在紫外灯下能用肉眼观察到就可以用于连接如果连接产物经过转化后平板上没有长出阳性克隆那么应该重点考虑载体

8 "%" 骨架是否酶切彻底本研究的不足之处是由于时间的限制没有将所构建的载体转化林烟草尚未明确哪些基因影响了基因介导的抗性需进一步研究参考文献 /4 / * ) +- * 47+) 4#+ 7 )4 7-4) * 7,) * -. )-* "'# " = )4.4- * * 94.)-,: 9 649)46''"# "' 何锋王长春王锋青杨玲植物抗病基因 # 与病原物无毒基因相互作用机制的研究进展中国细胞生物学学报 "' && & 贾燕涛植物抗病信号转导途径植物学通报 ""# "% # -)4.( - =- 4 = 6 8)-? -!..( = / )3 (-?()* &*7) 9)? 4 )4 +9-4) 4 - ) *6 *)* 7) -*74)4) *)7 +6 * * )4+ - *)'''' "#% #%% *)-7 )4 *?9-4 ')* ) ) 7-.)4.)-) 7 / *.)- * *"" #' &&% 刘士旺吴学龙郭泽建拟南芥的抗病信号传导途径植物病理学报 " %)-?5)-8@) )* )4 4 ())??): 4 4!) 7! * 94- -*7 4)4) *)7 +6 * * )4+ - *)''%'#' #& #& ' = 6 8 /) :+) / )-? -!- *44 -)*4( 4: 4 ()7 )-4) * ) 9-4! ) 7 &!/8.- )""'#& #& =)? = 6 8 =- 4 ) / )-? -!! )4 )* )4 7-4) *-)( 79)+ 64.?)-64 * 9) -*7 4)4) *)7 +6 * * )4+ - *)''''"'" "' ) 8: -7)-)*4-3)4 )()+.4) 44 )4-9, 47.* *)* ) * ) 4''& #% #'" " 5( - 4 ( - / +) = 7+) 5!*? - ) )4, -.) )4 :)6 ()*7)+ +( - 4 )) ?)''" && - )- * 45 84,?6* 4 8 ()**+ ) *, )-*-)4.-6 ) 4''' % & 陈启建欧阳明安吴祖建谢联辉林奇英金鸡菊 ')( +,,( 的抗 / 活性物质应用与环境生物学报 "'## ""# #? 5 + 4))?.* 4.+) 4 / () 2)+)?).*/? *2 5()6) 5=. *4)7-4 )44.*- * - 9 )47+)*6- )4 79) 4, -.-4) * 9-44 )4- * 3 *++ ),-9-4 / *.)- ) 4 / *-( 4 -)*4"""#'"' ""'., 4+.4)4 4*)49-44()**+ ) *, -. 7.*69-4, 46* 4 ) ) 6,4- / *.)- ) 4 / *-( 4 -)*4'%'"' " 陈贵元谭德勇干扰的研究现状与应用前景大理学院学报 ""#" ## % 马丽张春庆干扰机制及应用研究进展北方园艺 ""' ' ' )(9)- 46'$ +(-6 *7)9.4)4,--?) 4 )4) *)674- (.4 7 ''#& " " = -./ / 55 4) -, -!/44) 7 9 * *4 *4 --* (67.( 4-) 7 7 )- )(7 4 ) )4.- ''%' '%% 责任编辑王芳

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽