利用大肠杆菌表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）

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增肴齐
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1 利用大肠杆菌表达增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 池朋亮, 杜吉阳摘要绿色荧光蛋白是近年来在生物化学和细胞生物学中应用最广泛的标记性蛋白质之一本实验设计计划通过基因工程的方法, 利用大肠杆菌表达系统表达增强型绿色荧光蛋白, 首先 pegfp-n3 和 pet-28a(+) 质粒从含有相应质粒的的 E.coli 中提取出来, 然后利用 Not I 和 BamH I 双酶切法将两种质粒切开再利用 T4 连接酶构建 pet-28a-egfp 质粒 DNA, 将重组质粒转入 E.coli DH5α 中, 最后通过 IPTG 诱导 E.coli 中的 EGFP 基因表达, 在紫外线的照射下发出绿色荧光关键词 :E.coli;EGFP; 基因工程 ; 实验设计目录 1 引言绿色荧光蛋白 GFP 与 pegfp-n3 质粒大肠杆菌表达系统实验流程目的基因 pegfp-n3 质粒和表达载体 pet-28a 质粒 DNA 的获取及检测实验原理实验目的实验材料实验方法琼脂糖凝胶电泳检测实验结果预测...6 3pET-28a-EGFP 重组质粒的构建实验原理实验目的实验材料实验方法实验结果预测用 CaCl 2 制备感受态大肠杆菌和 pet-28a-egfp 重组质粒的转化及筛选实验原理实验目的实验材料实验步骤实验结果预测用 IPTG 诱导表达转入 E.coli 中 pet-28a-egfp 重组基因实验原理实验目的实验用品实验步骤结果预测与讨论参考文献 13 1

2 1 引言 1.1 绿色荧光蛋白 GFP 与 pegfp-n3 质粒绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein GFP, 如图 1) 来源于海洋生物水母, 在蓝光或紫光下可发出荧光, 近年来在生物化学和细胞生物学中成为应用最广泛的标记性蛋白质之一, 目前应用最多的是 GFP 的突变体增强型绿的荧光蛋白 (EGFP)(64 位苯丙亮 ), 发射出的荧光强度比 GFP 大 6 倍以上, 因此, 比 GFP 更适合作为一种报告基因来研究基因表达调控细胞分化及蛋白质在生物体内定位和运转等 EGFP 与其它标记物相比具有明显的优点 :1 分子量小, 在细菌及真核细胞中表达无明显毒性作用 2 可以在细胞内表达后自发产生荧光的蛋白, 可进行活细胞实时定位观察, 更能接近自然真实的状态如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核内质网运动的状态, 还可以实时观察蛋白在外界信号刺激下, 目的蛋白的变化过程, 借助荧光显微镜观察, 使图像效果会更佳, 细胞中任何局部的变化, 在很短时间能就能检测到 3 不需要添加任何底物, 荧光性稳定总的来说 EGFP 是一种稳定的可溶性的蛋白, 对光稳定, 对抗原或抗体的标记效率为 100% 它无需再加任何酶和底物, 在紫外或蓝光激发下能发荧光, 且不易淬灭图 1.GFP 的结构 pegfp-n3 质粒 pegfp-n3 质粒 ( 图 2) 是一个用于在哺乳动物细胞系中表达 EGFP 融合蛋白的质粒, 它编码了 EGFP 蛋白, 是野生型绿色荧光蛋白 (wtgfp) 经技术改造而成的遗传突变体 2

3 1.2 大肠杆菌表达系统图 2. pegfp-n3 质粒大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌, 它不仅具有遗传背景清楚培养操作简单转化和转导效率高生长繁殖快成本低廉可以快速大规模的生产目的蛋白等优点, 而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统 pet- 28a 质粒要把一个有用的外源基因通过基因工程手段, 转化到细胞中去外源基因进入受体进行繁殖和表达, 需要运载工具, 携带细胞的这种工具就叫载体 (Vector) 理想的大肠杆菌表达载体应该具有以下特征 :a 稳定的遗传复制传代能力, 无选择压力下能存在大肠杆菌内 ;b 具有显性转化筛选标记 ;c 启动子的转录水平可以调控 ;d 启动子的转录 mrna 能在适合的位置终止, 转录过程不会影响表达载体的复制 ;e 具有外源基因插入的酶切位点 pet 原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一目的基因被克隆到 pet 质粒载体 ( 如图 3) 上, 受噬菌体 T7 强转录及翻译信号控制 ; 表达由宿主细胞提供的 T7RNA 聚合酶诱导宿主菌带有受 lacuv5 控制的 T7RNA 聚合酶基因, 可以通过 IPTG 来启动表达充分诱导时, 几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白 ; 诱导表达后仅几小时, 目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50% 以上 3

4 1.3 实验流程图 3. pet-28a 质粒 ( 载体 ) 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达, 可以通过质粒重组将存储在质粒 pegfp-n3 的 EGFP 基因连接到载体质粒 pet-28a 的启动子下游, 形成所需要的重组质粒 pet-28-egfp, 将重组质粒导入大肠杆菌体内, 最后在表达菌种完成 EGFP 基因的表达本实验流程图如图 4 所示目的基因 pegfp-n3 质粒和表达载体 pet-28a 质粒 DNA 的获取及检测 pet-28a-egfp 重组质粒的构建用 CaCl 2 制备感受态大肠杆菌和 pet-28a-egfp 重组质粒的转化及筛选用 IPTG 诱导表达转入 E.coli 中 pet-28a-egfp 重组基因图 4. 实验总流程图 2 目的基因 pegfp-n3 质粒和表达载体 pet-28a 质粒 DNA 的获取及检测 4

5 2.1 实验原理 I. 碱裂解法抽提质粒 DNA 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子, 大小从 1-200kb 不等, 为双链闭环的 DNA 分子, 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中质粒主要发现于细菌放线菌和真菌细胞中, 常常编码一些对宿主有利的酶的基因, 包括抗生素限制酶修饰酶等碱裂解法抽提质粒 DNA 的基本原理是根据染色体 DNA 和质粒 DNA 分子量的巨大差异而达到分离的十二烷基磺酸钠 (SDS) 是一种阴离子表面活性剂, 它既能使细菌细胞裂解, 又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好, 收得率高, 获得的 DNA 可用于酶切连接与转化, 因而被各实验室广泛采用抽提过程中在加入碱裂解液 II 后, 碱性条件使 DNA 的氢键断裂, 宿主染色体双螺旋结构解开而变性, 而闭合环状的质粒 DNA 的两条链不会完全分离, 当加入碱裂解液 III 中和后, 宿主 DNA 相对分子质量大, 还没来得及复性, 就在冰冷的条件下与 SDS 蛋白质高分子量的 RNA 等缠绕在一起而沉淀下来, 而质粒 DNA 由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在 TE 溶液中 II. 琼脂糖凝胶电泳电泳 : 带电荷的物质, 在电场中的趋向运动称为电泳 DNA 的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为 200bp 至近 50kb 的 DNA 分子 DNA 的迁移率 (U) 的对数与凝胶浓度 (T) 之间存在反平行线性关系因此, 要有效地分离不同大小的 DNA 片段, 选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的在质粒提取的过程中, 由于操作原因, 提取的质粒可能有三种 : 线性 DNA 开环 DNA 闭环超螺旋 DNA 当提取的质粒 DNA 电泳时, 同一质粒 DNA 泳动速度 : 闭环超螺旋线状开环但有时也有也会出现相反情况, 因为与琼脂糖浓度电流强度离子强度及核酸染料含量有关 2.2 实验目的掌握碱裂解法抽提质粒 DNA 的原理和方法学习 DNA 琼脂糖凝胶电泳的原理和方法 2.3 实验用品材料 : 含 pegfp-n3 质粒的 E.coli 菌液, 含有 pet-28a 质粒的 E.coli 菌液,1.5ml 塑料离心管,EP 管架, 微量取液器和取液器吸头, 常用玻璃器皿 ( 三角瓶量筒试剂瓶等 ) 试剂 : 1) 溶液 Ⅰ:50 ml, 葡萄糖, 50 mmol/l, 25 mmol/l Tris-HCl (ph 8.0), 10 mmol/l EDTA (ph 8.0), 用前加溶菌酶 4mg/L.121 高压灭菌 15 min 后置于 0~4 贮存 ; 2) 溶液 Ⅱ:100 ml 0.2 mol/l NaOH, 2% SDS (W/V), 临用前 1:1 现配 ; 3) 溶液 Ⅲ:100 ml, 60 ml KAc (5 mol/l), 11.5 ml 冰乙酸, 28.5 mldd H 2 O. 该溶液钾离子浓度为 3 mol/l, 醋酸根离子浓度为 5mol/L; 4) 抽提液 ( 饱和酚 : 氯仿 : 异戊醇 =25:24:1) 5)ddH 2 O 6)70% 乙醇, 无水乙醇 ; 7) 液体 LB 培养基 (ph7.0):10 g/l 胰蛋白胨, 5 g/l 酵母提取物, 5g/L NaCl, 1 ml/l NaOH(1 mol/l) 调 PH7.5; 8) 卡那霉素 :50mg/mL 贮备液仪器设备 : 恒温摇床, 高压灭菌锅, 超净工作台, μL 微量移液器各一支, 5

6 高速离心机, 制冰机, 漩涡振荡器 2.4 实验方法培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分离和纯化质粒 DNA 图 5. 分离质粒 DNA 的一般方法 1) 将带有质粒 pet-28a 和 pegfp-n3 的大肠杆菌接种在液体培养基中 ( 加卡那 50μg/mL),37 C 培养过夜 2) 用灭菌吸头挑取单菌落, 浸没于 2 ml 含有抗生素的 LB 液体培养基中,37, 180 r/min 振荡培养过夜 3) 取 1.5 ml 培养物倒入微量离心管中, 用微量离心机于 r/min 离心 2 分钟, 吸弃上清 4) 向离心管中加入 100 l 用冰预冷的溶液 Ⅰ, 用微量移液器吹打重悬沉淀 5) 加入 200 l 新配制的溶液 Ⅱ, 盖紧管口, 快速颠倒离心管 5 次, 冰上放置 5 分钟 6) 加入 150 l 用冰预冷的溶液 Ⅲ, 轻轻颠倒混匀, 冰上放置 3~5 分钟, 产生白色絮状物, 冰上放置 15min 7) 用微量离心机于 r/min 离心 5 分钟, 吸取上清转移到另一离心管 8) 向上清液中加等体积抽提液 ( 约 400 l) 抽提, 振荡混匀, 用微量离心机于 rpm 离心 10 分钟, 将上清转移到另一离心管中 9) 加入等体积 ( 约 370uL) 氯仿 / 异戊醇 (24:1), 混匀, 离心 2min, 取上清液与新的离心管中 10) 向上清中加入 2 倍体积的无水乙醇, 混匀后, 于室温放置 2 分钟 ; 向上清液加入 2 倍体积无水乙醇, 混匀, -20 C 放置 1h 11) 12000rpm 5 min, 倒去上清液, 把离心管倒扣在吸水纸上, 吸干液体 12) 加 0.8mL70% 乙醇, 离心 1 min, 倒去上清液, 真空抽干或室温自然干燥 30min 13) 加 30μL ddh2o,-20 C 保存备用 2.5 琼脂糖凝胶电泳检测实验用品仪器电泳仪, 电泳槽, 样品槽模板 ( 梳子 ), 有机玻璃内槽, 水平仪, 取液器, 微波炉, 凝胶成像系统材料提取的质粒溶液, 琼脂糖, 锥形瓶, 一次性手套, 胶铲, 封口膜, 剪刀, 取液器吸头试剂 Gold view(dna 染料 ) 0.5 TBE 缓冲液上样缓冲液 (6 ) 6

7 2.5.2 实验步骤 1) 琼脂糖凝胶板的制备称取 0.3g 琼脂糖, 置于锥形瓶中, 加入 30mL 0.5 TBE 缓冲液, 微波炉加热直至琼脂糖溶解待胶液冷却到 65 ( 不烫手为宜 ), 加入 1μL Gold view 混匀, 搅拌器上搅拌排除气泡, 缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽 ( 插入样品槽模板梳子 ) 内静置 30min 左右, 轻轻晃动拔出梳子 2) 加样胶板放入电泳槽中 ( 样品孔位于负极 ), 注入 0.5 TBE 缓冲液淹没过胶板 1mm, 用取液器将提取的质粒 DNA5μL 与 1μL Loading Buffer(6 ) 混匀, 加入胶板的样品小槽内 3) 电泳将电泳槽与电泳仪接通, 调节电压为 100V 左右, 直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约 1~2cm 处, 停止电泳 4) 观察和拍照将胶板小心取出, 放入凝胶成像系统中, 调节位置居中, 波长为 254nm 的紫外灯下, 观察凝胶中 DNA 存在处显示出荧光条带 2.6 实验结果预测碱法提取质粒的过程中, 加入碱裂解液 Ⅰ 后混合液呈现乳白色浑浊 ; 加入碱裂解液 Ⅱ 后 EP 管中出现上层变澄清, 下层沉淀 ; 加入碱裂解液 Ⅲ 后有絮状沉淀生成 ; 加入氯仿离心后溶液分层电泳后可看到很多条带, 分别为不同状态的 DNA 分子, 如 : 超螺旋 DNA, 线性 DNA, 开环 DNA 及其混合物注意事项! 1) 饱和酚 ( 取下层 ) 单独吸 200μL, 氯仿 : 异戊醇 (24:1) 吸 200μL 2) 制备质粒过程中, 所有操作必须缓和, 不要剧烈振荡 ( 特别是加入溶液 II 和 III ), 以避免机械剪切力对 DNA 的断裂作用 3) 在取各种试剂的过程中, 一定注意移液器吸头的更换, 避免污染 3 pet-28a-egfp 重组质粒的构建 3.1 实验原理生物体内能识别并切割特异的双链 DNA 序列的一种核酸内切酶由于这种切割作用是在 DNA 分子内部进行的, 故名限制性内切酶 ( 简称限制酶 ) 迄今已发现了 3000 多种限制性内切酶传统上将限制性内切酶按照亚基组成酶切位置识别位点辅助因子等因素划分为三大类 II 型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开 DNA 链它们产生确定的限制片段, 因此是三类限制性内切酶中唯一用于 DNA 分析和克隆的一类 II 型限制性内切酶中最普遍的是像 EcoR I Hind III BamH I 和 Not I 这样在识别序列中进行切割的酶这一类酶是构成商业化酶的主要部分大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到 DNA 上, 因而识别的是对称序列 ; 但有极少的酶作为单聚体结合到 DNA 上, 识别非对称序列一些酶识别连续的序列 ( 如 EcoR I 识别 GAATTC;Hind III 识别 AAGCTT;Bam HI 识别 G GATCC; Not I 识别 GC GGCCGC); 而另一些识别不连续的序列 ( 如 BgL I 识别 GCCNNNNNGGC) 限制性内切酶酶切 DNA 后形成两种类型的末端 :(i) 两条链断裂的位置是交错地, 产生粘性末端, 如 EcoR I 酶切后产生末端 ;(ii) 两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心, 产生平 7

8 末端, 如 Hae III 酶切后产生 DNA 连接酶能够催化在两条 DNA 链之间形成磷酸二酯键, 这种酶需要在一条 DNA 链的 3 - 末端具有一个游离的羟基 (-OH), 和在另一条 DNA 链的 5 - 末端具有一个磷酸基团 (-P) 本实验利用 Bam HⅠ 与 Not I 双酶切 BamH I 切割识别序列后产生的粘性末端 5'- G GATCC -3' 5'-G GATCC-3' 3'- CCTAG G -5' 3'-CCTAG G-5' Not I 切割识别序列后产生的粘性末端 5' GC GGCCGC 3' 5' GC GGCCGC 3' 3' CGCCGG CG 5' 3' CGCCGG CG 5' 连接的 DNA 分子具备的条件 : 具有相同粘性末端 ( 同种酶切的片段 ) 的 DNA 分子比较容易连接在一起, 因为相同的粘性末端容易通过碱基配对形成一个相对稳定的结构连接反应温度 : 理论上讲, 连接反应的最佳温度是 37, 此时连接酶的活性最高但 37 粘性末端分子形成的配对结构极不稳定, 因此, 人们找到了一个最适温度, 即 12~16, 连接 3.2 实验目的获得重组质粒并检验是否是目的质粒 3.3 实验材料图 6.pET-28a-EGFP 重组质粒的构建原理图材料和仪器提取的 pet-28a 和 pegfp-n3 质粒,0.2mlEP 管, 取液器吸头, 一次性手套, 移液器, 台式高速离心机, 凝胶电泳系统, 凝胶成像系统, 恒温培养箱,PCR 仪试剂 Not I 限制性内切酶, BamH I 限制性内切酶, ddh 2 O, 10 buffer:0.5mol/ltris- Cl(pH8.0) 0.1mol/LMgCl2 0.5mol/LNaCl 等 ( 可以从公司购买 ), 琼脂糖,Gold view, DNA marker,0.5 TBE 缓冲液 :Tris10.88g 硼酸 5.52g EDTA Na 2 2H 2 O 0.74g, 定容至 200ml, 使用时稀释 10 倍 ;6 上样缓冲液 : 溴酚蓝 0.25% 蔗糖 40%;T 4 DNA 连接酶,T 4 DNA 连接酶 buffer 3.4 试验方法 : 分别取两支 0.2mlEP 管做上记号 : 两个 EP 管中分别配置下列的 30uL 体系 1EP 管 2EP 管 8

9 ddh 2 O 9μL ddh 2 O 9μL 10 buffer 3 μl 10 buffer 3μL NotⅠ 1μL NotⅠ 1μL Bam HⅠ 2μL Bam HⅠ 2μL pet-28a 15μL pegfp-n3 15μL 将两只 EP 管分别混匀后瞬时离心, 放入恒温培养箱 37 酶切 1h 取 5μL EP 管 1 的酶切反应液, 同时取 5μL 原质粒 pet-28a 溶液作对照, 取 5μL EP 管 2 的酶切反应液, 同时取 5μL 原质粒 pegfp-n3 溶液作对照, 进行电泳检测 ( 具体的实验材料方法参照实验 2.5 琼脂糖凝胶电泳检测 ), 剩下的溶液用做连接, 按照回收试剂和步骤切胶回收所需酶切产物片段在 0.2ml EP 管中配置下列的体系 0.2ml EP 管 10 buffer 酶切后的 pet-28a 酶切后的 EGFP T4DNA 连接酶 ( 考虑连接效率 ) 2.5 μl 7.5(X) μl 13(Y) μl 2 μl X : Y = 1 : 10~30, 用水补足 25 μl 离心管中液体混匀后瞬时离心, 放入培养箱 22 温育 20min 后, 即得到重组质粒,- 20 下保存用于转化 3.5 实验结果预测 : 电泳检测时, 酶切质粒的泳道上有多于 2 条的条带电泳检测时, 酶切质粒的泳道上有清晰的两条带 4 pet-28a-egfp 重组质粒转入 DH5α 扩增及菌落 PCR 鉴定阳性克隆 4.1 实验原理重组 DNA 分子的转化原理细菌处于容易吸收外源 DNA 的生理状态叫感受态 Cohen 等于 1972 年发表了可以用于批量制备感受态细菌的方法, 其转化效率可达 5*10 6 ~2*10 7 个转化克隆 /ug 超螺旋质粒 DNA 用此方法制备的感受态细胞可以保存在-70 C 冻存转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组 DNA 分子导入细菌的过程其原理是细菌处于 0 C, 在有 CaCl 2 存在的低渗溶液中, 菌细胞膨胀成球形转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面, 经 42 C 短时间热击处理, 促进细胞吸收 DNA 复合物将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间, 促使在转化过程中获得的新的表型 ( 如 Kana r 等 ) 得到表达在选择性培养基上进行重组子的鉴定 PCR 是在生物体外进行的由引物介导的酶促 DNA 扩增反应, 主要有变性退火延伸三个步骤组成 : 9

高温变性 -94 下 DNA 双链解旋为单链 ; 低温退火 -55 左右时, 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合 ; 中温延伸 -72 时,Taq 酶以 4 种 dntp 为原料, 引物为复制起点, 按 5 3 方向, 复制模板的互补链按此循环 ( 变性复性延伸 ), 一般重复 25~30 次, 短时间内, 使目的基因片段扩增 2n (n 代表循环次数 ) 绿色荧光蛋白基因引物

10 高温变性 -94 下 DNA 双链解旋为单链 ; 低温退火 -55 左右时, 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合 ; 中温延伸 -72 时,Taq 酶以 4 种 dntp 为原料, 引物为复制起点, 按 5 3 方向, 复制模板的互补链按此循环 ( 变性复性延伸 ), 一般重复 25~30 次, 短时间内, 使目的基因片段扩增 2n (n 代表循环次数 ) 绿色荧光蛋白基因引物 :p1ndel/p2xhol 正向引物 -P1:5 -ggg cat atg gtg agc aag ggc gag gag-3 反向引物 -P2:5 -ggg ctc gag tta ctt gta cag ctc gtc catg-3 图 7. 重组 DNA 筛选原理 4.2 实验目的图 8. 菌落 PCR 的原理图将 pet-28a-gfp 重组质粒转化到表达菌 DH5α 上 10

11 提取质粒后, 酶切鉴定 EGFP 菌落 PCR 技术扩增目的基因片段 EGFP 4.3 实验材料取出感受态细胞 E.coli DH5α 重组质粒 pet-28a-egfp 37 C 培养箱,37 C 空气振荡仪, 微型离心机, 灭菌离心管, 基本培养基,LB 液体培养基四支 EP 管, 抗 Kana 的 LB 抗性平板涂布器平板等 DNA 模板,4 dntp,t7 正反引物,Taq 酶, 琼脂糖,Marker DNA, 吸头 10 buffer,15 mmol/l MgCl2 T7 启动子正向引物 :5 -taatacgactcactataggg-3 T7 启动子反向引物 :5 -tgctagttattgctcagcgg-3 胰蛋白胨酵母提取物 NaCl 液体 LB 培养基 (ph7.0) 配方 10 g/l 5 g/l 10 g/l NaOH(1 mol/l) 4.4 实验步骤 4.4.1pET-28a-EGFP 重组质粒通过转化进入感受态细胞 pet-28a-egfp 重组质粒转化实验按照下表操作 : 1 ml/l 试剂 1- 实验组 /ul 2- 阳性管 /ul 3- 阴性管 /ul 取出 DH5α 让其在冰上自然解冻 pet-28a-egfp 重组质粒 (100~500ng) 已知 DNA(10ng) 无菌水 C 热冲击, 立即冰浴 5min LB 培养基 h 后,6000r/min 离心 3min, 去掉上清 ( 约留 200μL 的培养液 ), 摇匀菌块用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含 Kana 的 LB 固体培养基上, 正置培养皿半小时后,37 C 培养箱中倒置培养皿过夜第二天早上观察结果菌落 PCR 1) 在 0.2mL EP 管内配制 25μL PCR 反应体系 1 个反应物 ddh2o Buffer 2.5 MgCl dntp 1 引物体积 (μl) 11

12 引物 Taq 酶 0.5 菌落挑 1 个 2) 用灭菌枪头挑单菌落接触 EP 管内, 混匀瞬时离心 3) 放入 PCR 仪中, 设置反应程序 : 1 94 预变性 5min; 2 94 变性 30S; 3 55 退火 30S; 4 72 延伸 60S; 5 重复步骤 2~ 4 30 次 ; 6 72 延伸 10min 4) 取 9 μl 反应液加 1 μl10 loading Buffer 做电泳检测, 分析所得目的片段的大小 4.5 实验结果预测 1) 转化实验的实验组与阳性对照组将会出现单菌落克隆, 而阴性对照组则不会, 而且实验组的转化率应该比阳性对照组的转化率低 1~2 个数量级 2) 菌落 PCR 后通过琼脂糖电泳将会发现一条 1kbp 左右的电泳条带, 即为扩增产物注意! 1 感受态细胞对外界处理与高温特别敏感, 操作时要温 2 获得感受态细胞应使用对数生长期细胞, 因此 OD 600 值不应超过用 IPTG 诱导表达转入 E.coli 中 pet-28a-egfp 重组基因 5.1 实验原理 pet-28a-egfp 重组基因可以用 IPTG 诱导表达带有 IPTG( 异丙基 -β-d- 硫代半乳糖苷 ) 诱导启动子的质粒表达外源蛋白的总量可以达到全菌蛋白的 30% 以上这些质粒非常适用于小规模的实验室操作, 而 IPTG 价格昂贵, 不宜用于制备大量外源蛋白 5.2 实验目的利用 IPTG 诱导重组细胞表达绿色荧光蛋白 5.3 实验材料与试剂转化成功的 E.coli DH5α,IPTG(1M) 1xSDS 凝胶加样缓冲液体含 Kana 的 LB 琼脂平板, 含 Kana 的 LB 培养基离心机, 冰箱, 小型混合器, 移液器, 恒温培养箱, 手持式紫外灯, 超净工作台 5.4 实验步骤 1. 从选择平板上挑取单菌落接种于 4 ml LB 培养液 ( 含 Kan 100 μg/ml) 中, 37 过夜摇床培养 12 小时 2. 取 4 支无菌带盖试管, 加入新鲜 LB 液体培养基 ( 含有 Kan+) 5ml, 按 1: 20 稀释比例加入过夜菌,37 培养至生长期, 约 2-3 小时 12

13 3. 加入 IPTG(1:1000) 至终浓度 1mmol/L, 分别诱导 0h,1h,2h,4h 4. 分别取 1.5ml,10000rpm 离心 5min, 去除上清, 收集沉淀, 再重复一次收集沉淀 5. 分别取 IPTG 诱导培养液 20μl 涂布在含 Kan+ 的固体培养基上,37 培养 20 小时 6. 观察 EGFP 蛋白表达 : 用紫外线照射菌体沉淀及培养平板, 可以看到绿色荧光分别对均匀涂布的平板以及表达蛋白的样品管照相, 保存照片 5.5 结果预测与讨论用紫外线照射菌体沉淀, 将发出荧光参考文献图 9. 预计实验结果 [1] 马文丽李凌. 生物化学与分子生物学实验指导. 北京 : 人民军医出版社, [2] 李学礼周晓霞生物化学与分子生物学实验技术教程.. 上海 : 同济大学出版社, [3]J.sambrook,D.W.Russell 著, 黄培堂等译, 分子克隆实验指南 ( 第三版 ). 北京 : 科学出版社, [4] 谭树华. 分子生物学实验与指导. 北京 : 中国医药科技出版社, [5] 张吉林, 宋玉国. 医学分子生物学实验. 北京 : 中国医药科技出版社,

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌