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1 HB Hieff Mut TM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit Cat No 产品说明书本产品仅作科研用途!

2 产品信息产品名称货号规格 Hieff Mut TM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit 多点突变试剂盒 11004ES10 10 T 产品描述 Hieff Mut TM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit 是基于 Hieff Clone 快速克隆技术的定点突变系统使用本试剂盒, 可一次性向目标质粒上三至五个不连续位点 ( 相距超过 50 bp) 同时引入定点突变该试剂盒由两个模块组成 :Hieff II Pfu DNA Polymerase 扩增模块和 Hieff Clone 快速克隆模块 Hieff II Pfu DNA Polymerase 超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性, 其卓越的长片段扩增能力, 广泛适用于长度小于 20 kb 的任何质粒扩增 Hieff Clone 快速克隆系统利用高效的同源重组反应替代传统的退火成环反应因此使用 Hieff Mut TM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit 进行 DNA 定点突变时, 引物设计更加灵活, 且扩增反应以指数方式进行, 极大减少了模板使用量, 有利于原始甲基化模板的彻底降解 Hieff Mut TM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit 中的重组酶 Exnase MultiS 经过优化, 专门针对多碱基进行定点突变此外, 如扩增产物特异, 其 DpnI 消化产物可不进行 DNA 纯化而直接用于重组反应高度优化的反应缓冲液快捷的操作流程以及极高的成功率, 使得 Hieff Mut TM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit 成为 DNA 多点突变首选试剂盒应用范围 DNA 定点突变注 : 如使用本品对质粒进行定点突变, 请使用甲基化酶无缺陷的宿主菌 ( 例如 Top10 DH5α JM109) 扩增原始质粒! 产品组成产品编号 / 规格编号组分 11004ES10 (10 T) A 2 Hieff II PCR buffer 1.25 ml B dntp Mix (10 mm each) 50 μl C Hieff II Pfu DNA Polymerase (1 U/μL) 50 μl D Dpn I (10 U/μL) 50 μl E 2 Hieff Clone MultiS Enzyme Premix 100 μl 运输与保存方法冰袋运输产品 -20 保存有效期 1 年第 1 页, 共 5 页

不连续多碱基 ( 相距超过 50bp) 定点突变实验流程 ( 以不连续三碱基为例 ) 实验流程概览 ( 图一 ) 以待突变位点 A B C 为界, 将质粒分为 AB BC 和 CA 三段在每个待突变位点处设计部分反向互补的引物 ; 以原始质粒为模板, 分别扩增 AB 段 (A Forward Primer 和 B Reverse Primer) BC 段 (B Forward Primer

3 不连续多碱基 ( 相距超过 50bp) 定点突变实验流程 ( 以不连续三碱基为例 ) 实验流程概览 ( 图一 ) 以待突变位点 A B C 为界, 将质粒分为 AB BC 和 CA 三段在每个待突变位点处设计部分反向互补的引物 ; 以原始质粒为模板, 分别扩增 AB 段 (A Forward Primer 和 B Reverse Primer) BC 段 (B Forward Primer 和 C Reverse Primer) 和 CA 段 (C Forward Primer 和 A Reverse Primer); 扩增产物经 DpnI 消化, 去除甲基化模板进行重组环化反应重组产物直接转化到感受态细胞中图一 : 使用 Hieff Mut TM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit 进行不连续三碱基定点突变实验流程第 2 页, 共 5 页

1. 引物设计向质粒三个不连续位点引入定点突变, 只需设计三对引物将质粒分段扩增即可引物设计基本原则为 : 在每个待突变位点处设计部分反向互补的扩增引物对每对正反向引物 5 端包含 15-21 bp 反向互补区域 (GC 含量 40%-60% 为佳 ), 各引物待突变位点至引物 3 端区域 Tm 值高于 60 为佳所需引入突变可以包含在互补区域内 ( 需要两条引物上均引入点突变 ),

4 1. 引物设计向质粒三个不连续位点引入定点突变, 只需设计三对引物将质粒分段扩增即可引物设计基本原则为 : 在每个待突变位点处设计部分反向互补的扩增引物对每对正反向引物 5 端包含 bp 反向互补区域 (GC 含量 40%-60% 为佳 ), 各引物待突变位点至引物 3 端区域 Tm 值高于 60 为佳所需引入突变可以包含在互补区域内 ( 需要两条引物上均引入点突变 ), 也可以包含在任一条引物的非互补区域 ( 只需在一条引物上引入点突变 ), 请勿将突变位点置于引物末端以向 puc18 引入三碱基突变为例, 引物设计具体方案如图二所示图二 : 向质粒引入不连续多碱基定点突变引物设计示意图注 : 待突变位点 B C 处的正反向扩增引物设计方式与位点 A 处的引物设计方式一致计算引物 Tm 值时, 应计算待突变位点至引物 3 端这一区域内的碱基, 待突变位点至引物 5 端区域内的碱基不应参与计算 2. 目标质粒分段扩增以待突变位点 A B C 为界, 将质粒分为 AB BC 段和 CA 段使用 Hieff II Pfu DNA Polymerase 对各段分别进行扩增 AB 段扩增引物对为 : 待突变位点 A 正向扩增引物和待突变位点 B 反向扩增引物 ;BC 段扩增引物对为 : 待突变位点 B 正向扩增引物和待突变位点 C 反向扩增引物 ;CA 段扩增引物对为 : 待突变位点 C 正向扩增引物和待突变位点 A 反向扩增引物 2.1 配制 PCR 反应体系反应各组分解冻后请充分摇匀, 使用完毕后及时放回 Hieff II PCR buffer 请勿长时间敞口放置为了增加扩增特异性, 反应体系配制过程请于冰水浴中进行为了防止 Hieff II Pfu DNA Polymerase 的校对活性降解引物, 请将聚合酶最后加入反应体系中推荐反应体系如下 : ddh2o Up to 50 μl 2 Hieff II PCR buffer 25 μl dntp Mix (10 mm each) a 1 μl 模板 DNA b Optional 引物 1 (10 μm) 2 μl 引物 2 (10 μm) 2 μl Hieff II Pfu DNA Polymerase (1 U/μL) c 1 μl a. 请勿使用 dutp 和带有尿嘧啶的引物或模板 b 在各片段能正常扩增的前提下, 应尽量减少质粒模板使用量, 推荐 1 ng 待扩增质粒长期放置反复冻融会导致模板质粒断裂开环或降解, 因此推荐使用新鲜制备的质粒作为模板 c. 推荐的酶的终浓度为 1 U/50 μl 反应可将 Hieff II Pfu DNA Polymerase 在 U/50 μl 之间进行优化, 但不要超过 2 U/50 μl, 尤其当扩增子长度大于 5 kb 时第 3 页, 共 5 页

5 2.2 PCR 扩增反应推荐 PCR 反应条件 : 循环步骤温度时间循环数预变性 sec 1 变性 a 退火 b 延伸 c ~ sec 15 sec sec/kb 彻底延伸 72 5 min 1 a. 对于大多数质粒, 变性温度使用 95 即可 30 d b. Hieff II Pfu DNA Polymerase 能够促进模板和引物高效退火一般来说, 退火温度设置为引物 Tm 值即可如果需要, 可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状 c. 对于大多数扩增反应, 延伸过程可在 72 进行长的延伸时间有助于提高扩增产量 d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变, 强烈建议扩增循环数 35 如果扩增效率良好的话, 推荐扩增循环数应 30 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测如目标质粒正确扩增, 则可进行下步实验 3. 扩增产物 DpnI 消化, 去除甲基化模板质粒因上述扩增产物中包含原始模板质粒, 为防止其在转化后形成假阳性转化子, 必须在进行重组环化之前进行 DpnI 消化推荐反应体系如下 : DpnI 扩增产物 1 μl 40~50 μl 将上述反应体系置于 37 恒温反应 1~2 小时如产物扩增特异, 产物条带单一,DpnI 消化产物无需纯化, 可直接用于后续重组反应如扩增不特异,DpnI 消化结束后应胶回收纯化目标扩增产物 4. 重组反应 4.1 配制重组反应体系质粒 AB BC 和 CA 段扩增产物末端分别包含相对应的完全一致的一段序列, 因此在 Exnase MultiS 催化下三扩增产物末端可以发生同源重组, 完成扩增产物环化过程于冰水浴中, 将下列组分依次加到无菌的 1.5 ml Eppendorf 管或 PCR 管的管底如果不慎将液体粘在管壁, 请务必通过短暂离心使其沉入管底体系配制完成后, 用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分, 避免产生气泡 ( 请勿剧烈震荡或者涡旋混匀 ) ddh2o AB 段 DpnI 消化产物 BC 段 DpnI 消化产物 CA 段 DpnI 消化产物 Up to 20 μl x ng x ng x ng 2 Hieff Clone MultiS Enzyme Premix 10 μl Exnase MultiS 多点突变重组反应体系最适 DNA 使用量为每片段 0.03 pmol 该摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得 : DpnI 消化产物最适使用量 = [0.02 目标质粒碱基对数 ] ng (0.03 pmol) 例如,AB 段长度为 1 kb,bc 段长度为 2 kb,ca 段长度为 5 kb 则 DpnI 消化产物最适使用量为 :AB 段 = 20 ng; BC 段 = 40 ng;ca 段 = 100 ng 注 :DNA 量太多或者太少都将降低环化效率常用的吸光度测量法极易受 DNA 纯度 DNA 稀释液 ph 等因素影响, 测定值和 DNA 实际浓度往往偏差较大因此, 请务必通过琼脂糖电泳预先确认 DNA 浓度, 尽量严格按照推荐量配制反应体系当 DpnI 消化产物最适使用量计算值不足 10 ng 或者超过 200 ng 时, 加入 10ng 或 200 ng 即可 DpnI 消化产物不纯化直接用于重组反应时, 使用量不应超过反应总体积的 1/5, 即 4μL 4.2 重组反应 1) 将上述体系置于 50 反应 min 2) 待反应完成后, 立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min 第 4 页, 共 5 页

6 3) 之后, 反应产物可直接进行转化 ; 也可储存于 -20, 待需要时解冻转化 5. 反应产物转化涂板克隆鉴定 1) 取 10 μl 冷却反应液, 加入到 100 μl 感受态细胞中, 轻弹管壁数下混匀, 在冰上放置 30 min 2)42 热激 45~90 秒, 冰水浴孵育 2 min 3) 加入 900 μl SOC 或 LB 培养基,37 孵育 10min 充分复苏 4)37 摇菌 45 min 5) 取 100 μl 菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上将平板倒置, 于 37 过夜培养注 : 我们推荐您使用转化效率 >10 8 cfu/μg 的感受态细胞如果感受态转化效率 <10 8 cfu/μg ( 例如用 CaCl2 法新鲜制备的感受态转化效率通常在 cfu/μg 之间 ), 请将培养菌液在 5,000 rpm 离心 3 min 收集菌体, 用 100 μl LB 培养基重悬后全部涂板注意事项 1) 引物设计时 5 端反向互补区尽量选择无重复序列, 且 GC 含量比较均匀的区域当这一区域内 GC 含量在 40%~60% 范围之内时, 重组环化效率将达到最大如这部分区域 GC 含量高于 70% 或者低于 30%, 重组环化效率会受到较大影响 2) 当两突变位点相距小于 50bp 时, 应将其视为一个突变位点, 将两突变引入同一条 / 对引物进行实验 3)DpnI 只能识别甲基化 DNA, 请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为 PCR 模板 4) 质粒 PCR 扩增结果需高度特异, 杂带较多会影响实验结果 5) 重组反应体系中应尽量避免金属络合剂 ( 如 EDTA) 的带入因此, 建议将 DNA 纯化产物溶解在 ph8.0 的 ddh2o 中保存 ( 常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用 ph8.0 的 ddh2o 替代 ), 请勿使用 TE 进行 DNA 保存 6) 冷却后的反应产物应在 1h 内进行转化, 且转化前保持在冰水浴中如需储存, 于 -20 冻存尽量避免室温较长时间放置或 4 长期储存 7) 反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的 1/10, 否则会降低转化效率另外, 当转化的 DNA 浓度太高时, 会抑制转化反应将重组反应产物稀释 5 倍后取 1/5 进行转化 8) 为了您的安全和健康, 请穿实验服并戴一次性手套操作本产品仅作科研用途! 第 5 页, 共 5 页

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