第 3 期刘连, 等 : 基于博来霉素抗性筛选的核糖体 DNA 通用基因打靶载体平台的构建 201 基因打靶是 20 世纪 80 年代发展起来的一项重要分子生物学技术, 即利用基因转移方法, 将 DNA 序列导入靶细胞后, 通过外源 DNA 序列与靶细胞内染色体上同 DNA 序列间的重组, 将外源基

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1 第 38 卷第 3 期 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) Vol.38 No 年 6 月 JournalofJinanUniversity(NaturalScience&MedicineEdition) Jun 基于博来霉素抗性筛选的核糖体 DNA 通用基因打靶载体平台的构建 刘连 1, 郭嘉亮 1,2, 孙平华 2, 刘芳 1, 韩冬婷 1 1, 唐冬生 (1. 佛山科学技术学院口腔医学院医药工程学院, 广东佛山 ;2. 暨南大学药学院, 广东广州 ) [ 摘要 ] 目的 : 构建一个基于博来霉素筛选的核糖体区基因打靶载体, 为后续的基因打靶研究奠定基础. 方法 : 首先选择含有博来霉素 (zeocin) 抗性的目的片段与载体连接, 并进行单酶切及测序鉴定, 最终构建基于博来霉素筛选核糖体基因打靶载体平台. 结果 : 构成 puc19 DS1 SV40 Zeocin polya DS2 基因打靶载体与预期一致, 测序结果与实验设计相同. 结论 : 成功构建了含有抗性基因的 puc19 DS1 SV40 Zeocin polya DS2 水牛基因通用打靶载体平台, 便于不同外源基因的插入, 为转基因动物模型的建立提供了基础工具. [ 关键词 ] 博来霉素 ; 核糖体基因区 ; 基因打靶 [ 中图分类号 ] Q785 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2017) doi: /j.jdxb ConstructionoftheribosomalDNAuniversaltargetingplatform basedonzeocinscreening LIULian 1, GUOJialiang 1,2, SUNPinghua 2, LIUFang 1, HANDongting 1, TANGDongsheng 1 (1.SchoolofStomatologyandMedicine,FoshanUniversity,Foshan528000,China; 2.PharmacyColege,JinanUniversity,Guangzhou510632,China) [Abstract] Aim:ToconstructtheribosomalDNAuniversaltargetingvectorbasedonzeocinscreening, whichisakeypreconditionforgenetargetingresearch.methods:chooseatargetfragmentofzeocin resistance.secondly,thetargetfragmentsconnectwithpuc19 DS1 DS2vector.Therecombinantswere digestedandsequenced.results:thegenetargetingvectorpuc19 DS1 SV40 Zeocin polya DS2 is consistentwiththeexpectedresults,andthesequencingidentificationisthesameasexperimental design.conclusion:thewaterbufalogenetargetingvectorpuc19 DS1 SV40 Zeocin polya DS2with zeocinresistanceissuccesfulyconstructedtofacilitatediferentexogenousgeneinsertion.thiswork providesbasictoolforthedevelopmentoftransgenicanimalmodels. [Keywords] zeocin; ribosomalgenelocus; genetargeting [ 收稿日期 ] [ 基金项目 ] 国家科技重大专项 (2014ZX B); 广东省自然科学基金项目 (2015A ); 佛山市医学类科技攻关项目 (2015AB00265); 佛山市科技创新专项 (2015AG10010); 广东省教育厅 创新强校工程 特色创新项目 (2015KTSCX154) [ 作者简介 ] 刘连 (1984-), 女, 助理研究员, 博士, 研究方向 : 基因打靶技术. 通信作者 : 唐冬生, 男, 教授, 博士, 研究方向 : 多基因干预研究 ;E mail:tangdsh@163.com

2 第 3 期刘连, 等 : 基于博来霉素抗性筛选的核糖体 DNA 通用基因打靶载体平台的构建 201 基因打靶是 20 世纪 80 年代发展起来的一项重要分子生物学技术, 即利用基因转移方法, 将 DNA 序列导入靶细胞后, 通过外源 DNA 序列与靶细胞内染色体上同 DNA 序列间的重组, 将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 或对某一预先确定的靶位点进行定点突变的技术 [1-2], 从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题, 以及提供相关的疾病治疗 新药筛选评价模型等. 近年来, 已成功利用基因打靶技术在体外培养人类细胞 水蚤 斑马鱼 鼠及牛等物种中实现了基因组定点突变 [3-7]. 病毒载体可能具有免疫原性, 容易被机体识别为异源物质, 有引起插入突变的风险, 所以病毒载体的安全性不容忽视. 核糖体 DNA 区域基因打靶载体不会引起插入突变, 没有免疫原性. 它可以利用细胞的基因同源重组系统将基因定点整合到核糖体 DNA 区域, 并使用核糖体 DNA 区域高效转录特征使之富集和使目标蛋白表达, 不会引起插入突变, 具有高度的安全性. 构建相应的基因打靶载体是基因打靶研究的首要任务, 而利用抗生素的抗性基因为筛选标记的载体是常用方法之一. 此前研究人员通过博来霉素 (zeocin) 筛选的含铁蛋白 cyb5 融合基因莱茵衣藻核转化表达载体的构建及转化 [8], 以及利用潮霉素磷酸转移酶基因 (hygromycinb photransferase, HPT) 为选择标记的质粒在毕赤酵母中高效表达抗菌肽 LL37 [9], 均获得了成功. 博来霉素作为一种对原核和真核生物均有致死作用的广谱抗生素, 其抗性基因已成功地应用于多种表达系统的载体构建中, 预示着其广泛的应用及推广价值. 目前常用的基因打靶载体大多数只能 1 次敲除 1 个目的基因, 所以构建 1 个适合多克隆位点, 方便长 短同源臂的定向插入, 载体通用性高的基因打靶平台尤为重要. 然而, 基于博来霉素筛选的水牛核糖体区基因打靶载体平台的研究还未见文献报道, 将核糖体作为打靶位点, 从打靶效率 安全性和稳定性等方面考虑, 不失为一个好的外源基因打靶位点. 因此, 本研究旨在构建水牛核糖体 DNA 打靶通用载体介导博来霉素抗性基因靶入到水牛核糖体 DNA 区域, 通过构建一个含有博来霉素抗性基因的水牛基因通用打靶载体平台, 便于不同外源基因的插入, 为相关的基因打靶研究工作提供前提条件, 也为后续的转基因动物模型的建立奠定了基础. 1 材料和方法 1.1 材料 (1) 质粒与菌株水牛 puc DS1 DS2 质粒由佛山科学技术学院实验室构建和保存,DH5α 感受态购自北京天根生化科技有限公司. (2) 试剂 KOD plus 高保真酶 NovoRec 酶 Sal I 酶 (TaKaRa 公司 );dntp 纯化试剂盒 (Cycle Pure Kit) 胶回收试剂盒 (GelExtractionKit) 质粒提取试剂盒 (PlasmidMiniKitI 试剂盒,Omega 公司 ); 西班牙琼脂糖 ( 普博生物技术有限公司 );DNA 分子标记 (DL2000DNAMarker,DL10000DNAMarker) 溴化乙锭 (Ethidiumbromide), 引物合成和测序由深圳华大基因公司完成. 1.2 实验方法构建载体如图 1 所示, 具体方法如下 : 图 1 puc19 DS1 SV40 Zeocin polya DS2 载体的构建流程 Fig.1 SchematicrepresentationoftheestablishmentofpUC19 DS1 SV40 Zeocin polya DS2vector (1) 引物设计与合成根据 NovoRec 聚合酶链式反应 (PCR)( 无缝克隆试剂盒 ) 一步定向克隆的引物设计原则, 采用 Primer5 0 软件, 并在引物上下游设计 15bp 的同源片段, 扩增目的片段 SV40 zeocin ploya. 引物参照说明书用灭菌 ddh 2 O 将引物稀释成浓度为 20μmol/L, 分装后,-20 保存. 引物序列如表 1 所示 : 表 1 SV40+zeocin+ployA 引物序列 Table1 TheprimersequenceofSV40 zeocin ploya 引物序列 (5-3 ) F ATCCTCTAGAGTCGACGTTGATGACGTCAGCGTTCG R ATGCCTGCAGGTCGACCAGACATGATAAGATACATTGATG (2)PCR 扩增目的片段 SV40 启动子 - 博来霉

3 202 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 38 卷 素 Zeocin 抗性片段 polya 尾 (SV40 Zeocin polya) 以 zeocin 抗性的 SV40 Zeocin polya( 大小为 1070 bp) 为模板, 采用高保真 PCR 试剂 KOD Plus 法扩增片段, 产物经质量分数为 1% 琼脂糖凝胶电泳, 电泳 25min, 电压 100V, 在凝胶成像系统中观察, 照相记录结果. (3) 水牛 puc19 DS1 DS2 质粒单酶切及回收对含有 puc19 DS1 DS2 质粒的菌液进行培养, 培养方法为 :10μL 菌液及 5μL 氨苄青霉素 (Ampicilin) 加入溶菌肉汤 (LB) 培养基中, 恒温培养摇床 220r/ min 培养 12h; 按照 PlasmidMiniKitI 试剂盒的方法对菌液抽提质粒, 然后根据 GelExtractionKit 试剂盒的方法对提取的质粒进行纯化. (4)SV40 Zeocin ploya 片段与线性载体 puc DS1 DS2 连接连接产物转化至感受态细胞 DH5α. (5)pUC19 DS1 SV40 Zeocin polya DS2 质粒菌液 PCR 鉴定阳性重组体菌液 PCR 后同样采用电泳跑胶, 并在凝胶成像系统中观察, 照相记录结果. 单酶切 (SalI 酶 )puc19 DS1 SV40 Zeocin polya DS2 质粒 ( 大小为 6250bp) 及测序验证酶切成功. 2 结果与讨论 2.1 PCR 扩增目的片段以 SV40 Zeocin polya 片段模板, 利用设计的引物, 加入 KOD Plus 高保真 双蒸水 (ddh 2 O) 10 buferforkod plus 硫酸镁以进行 PCR 扩增.PCR 产物经质量分数为 1% 琼脂糖核酸凝胶电泳,PCR 产物产生一条大小约为 1070bp 的带, 符合预期的大小. 2.2 puc19 DS1 DS2 质粒 酶切及切胶回收对大肠杆菌培养液进行质粒抽提, 抽提的质粒洗脱液经质量分数为 1% 琼脂糖核酸凝胶电泳, 抽提的质粒产生两条带, 其中质粒条带大小约为 5000 bp, 大小符合. 将 puc19 DS1 DS2 质粒进行 Sal 酶切, 酶切产物经质量分数为 1% 琼脂糖核酸凝胶电泳,pUC19 DS1 DS2 质粒的酶切产物产生一条大小约为 5000bp 的带. 凝胶回收试剂盒 GelExtraction Kit 说明书进行操作, 进行 PUC19 DS1 DS2 质粒切胶回收, 切胶回收产物经 1% 琼脂糖核酸凝胶电泳, 产生两条带, 其中 PUC19 DS1 DS2 质粒的切胶回收产物产生一条大小约为 5000bp 的带. M1:DL10000DNA 标记物 ;M2:SupercoiledDNA 标记物 ;3,4: 酶切后质粒 ;5,6:pUC19 DS1 DS2 质粒. M1:DL10000DNA Marker;M2:SupercoiledDNA Marker;3,4: puc19 DS1 DS2 plasmid digested by Sal; 5,6: puc19 DS1 DS2 plasmid. 图 3 puc19 DS1 DS2 酶切图 Fig.3 Restriction identification ofrecombinantvectorof puc19 DS1 DS2 M:DL10000DNA 标记物 ;1:pUC19 DS1 DS2 质粒的切胶回收产物. M:DL10000DNA Marker;1:pUC19 DS1 DS2plasmidgelextraction products. 图 4 puc19 DS1 DS2 质粒的切胶回收图 Fig.4 puc19 DS1 DS2plasmidgelextraction M:DL2000DNA 分子量 ;1:SV40 Zeocin polya 片段 PCR 扩增. M:DL2000DNAMarker;1:SV40 Zeocin polyapcrproducts. 图 2 PCR 扩增目的片段图 Fig.2 PCRamplificationoftheSV40 Zeocin polya 2.3 puc19 DS1 SV40 Zeocin polya DS2 质粒菌液 PCR 以菌液作为模板, 利用设计的引物, 加入 KOD Plus 高保真 双蒸水 (ddh 2 O) 10 buferforkod plus 硫酸镁以进行 PCR 鉴定.PCR 鉴定产物经质量分数为 1% 琼脂糖核酸凝胶电泳,PCR 鉴定产物产生一条大小约为 5000bp 的带, 符合预期.

4 第 3期 刘 连 等 基于博来霉素抗性筛选的核糖体 DNA通用基因打靶载体平台的构建 203 M1 u DNA标记物 M2 DL10 0 00DNA标记物 1 M1 u DNA 标 记 物 5 6 Z 2质粒 2 酶切后的质粒 Z 2质粒 M1 u DNAM k M2 DL1 0 00 0DNAM k 2 P m u DNA M k 5 6 Z M1 2 m Z 2 3 P m Z 2 b 图5 Z 2质粒菌液 PCR图 F 5 C PCR 图 6 单酶切 Z 2结果图 F 6 Z 2 2 4 单酶切 Z 2 将重组质粒进行 酶切 重组酶切产物经质 2 5 测序验证 量分数为 1 琼脂糖核酸凝胶电泳 与酶切前质粒 对比 产生两条带 其中一条带大小约为 50 00b R v 测序验证发现 没有碱基发生变化 与预期设计 相符 另一条带约为 1000b 大小符合预期 图 7 部分序列 F 7 q u

5 204 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 38 卷 3 讨论 转基因表达效率在水牛中的文献报道太低且难以稳定遗传, 症结在于外源基因的定点整合较难. 以核糖体 RNA(rRNA) 作为打靶位点, 无论从基因打靶效率 表达效率, 还是稳定遗传和基因安全等方面, 应该是一个很好的外源基因打靶位点. 本课题以 28S 核糖 RNA(28SrRNA) 为打靶位点, 寻找水牛核糖体 RNA 基因中序列合适的靶位点, 并针对靶位点设计同源重组左右臂, 构建一个带有基因打靶同源引导序列 DS1 和 DS2 及 zeocin 为筛选标记的多位点基因打靶载体, 设计含有多个酶切位点, 适于不同外源基因插入, 通用性高, 这是水牛转基因方法上的创新, 不涉及骨架载体的选择和同源臂插入等过程. 基因打靶技术是利用 DNA 可与外源性 DNA 同源序列发生同源重组的性质而定向改造生物遗传信息的实验手段. 本载体的优点是通用型载体, 含有多个酶切位点, 构建方法简便可行. 对于不同的基因打靶位点打靶时, 如果分别构建打靶载体, 必定会涉及到骨架载体的选择 多克隆的设计 同源臂的插入等烦琐的过程, 因此有针对性地选择靶位点, 是基因打靶的核心, 因为它直接影响到同源重组的效率和安全性. 而该通用基因打靶载体以核糖体 DNA 区作为外源基因的打靶位点, 不会引起插入突变或激活沉默基因, 且没有免疫原性. 通过构建水牛核糖体 DNA 打靶通用载体, 介导博来霉素抗性基因靶入到水牛核糖体 DNA 区域, 可以为基因打靶研究工作提供方便, 为后续的转基因动物模型提供基础. 然而, 还需面对一些潜在的挑战, 如自发同源重组介导基因打靶的低效性等. 总之, 构建水牛核糖体 DNA 打靶通用载体, 介导博来霉素抗性基因靶入到水牛核糖体 DNA 区域, 该通用打靶平台具有多克隆位点, 便于不同外源基因的插入, 安全性高, 通用性高, 不涉及骨架载体的选择 多克隆的设计及同源臂的插入等烦琐过程, 为相关的基因打靶研究工作提供快捷便利条件, 也为后续的转基因动物模型的建立奠定了基础. [ 参考文献 ] [1] SILVAG,POIFOTL,GALETTOR,etal.Meganucleases and other tools for targeted genome engineering: Perspectivesandchalengesforgenetherapy[J].Curent GeneTher,2011,l1(1): [2] KATSUYAMAT,AKMAMMEDOVA,SEIMIYAM,et al.an eficientstrategyfortalen mediated genome engineeringindrosophila[j].nucleicacidsres,2013, 41(17):e163-e163. [3] BIFFIA.ClinicaltranslationofTALENS:TreatingSCID X1bygeneeditinginiPSCs[J].CelStemCel,2015, 16(4): [4] NAITOU A, KATO Y, NAKANISHI T, et al. HeterodimericTALENsinducetargetedheritablemutations inthecrustaceandaphniamagna[j].biolopen,2015, 4(3): [5] SHIAU CE,KAUFMAN Z,MEIRELESA M,etal. Diferentialrequirementforirf8informationofembryonic andadultmacrophagesin zebrafish[j]. PLoS One, 2015,10(1):el7513. [6] SOMMERD,PETERSAE,BAUMGARTAK,etal. TALEN Mediatedgenomeengineeringtogeneratetargeted mice[j].chromosomeres,2015,23(1): [7] WU H,WANG Y,ZHANG Y,etal.TALEnickase mediated SPl0 knockin endowscatle with inereased resistancetotuberculosis[j].pnatlacadsciusa, 2015,112(13):E [8] 李明泽, 程奇. 含铁蛋白 cyb5 融合基因莱茵衣藻核转化表达载体的构建及转化 [J]. 中国农学通报, 2013,29(30): LIM Z,CHENG Q. Construction ofcytochrome b5 nuclear expresion vectors and transformation in ChlamydomonasReinhardti[J]. Chinese Agricultural ScienceBuletin,2013,29(30): [9] 徐义兵, 刘娜, 黄毓茂. 潮霉素抗性基因筛选标记质粒的构建及 LL37 的表达 [J]. 中国畜牧兽医, 2012,39(4): XU Y B, LIU N,HUANG Y M. Construction ofa hygromycin phosphotranferase as a selectable marker plasmidandtheexpresionofll37[j].chinaanimal HusbandryandVeterinary,2012,39(4): [ 责任编辑 : 陈咏梅 ]

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