CK2070.TA Dual

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村阎
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TA Cloning Kit 双启动子 (pcr II) 货号 K2050-01, K2050-40,

1 TA Cloning Kit 双启动子 (pcr II) 货号 K , K , K , K , K , K ,CK 和 CK

2 ii

3 目录目录... iii 重要信息...v 附属产品... viii 介绍...1 概述...1 方法...2 实验概要...2 PCR 产物制备...3 克隆到 pcr II...4 转化感受态细胞...5 转化子分析...7 故障诊断与排除...8 附录...11 进行自连反应...11 进行对照反应...12 添加 3 A 尾...14 配方...15 pcr II 图谱和特征...16 技术服务...18 购买者须知... Error! Bookmark not defined. 产品质量...20 参考文献...21 iii

4 iv

5 重要信息试剂盒种类本说明书适用于以下试剂盒试剂盒名称数量 TA Cloning 双启动子试剂盒 20 个反应 TA Cloning 双启动子试剂盒含 One Shot INVαF 化学 E. coli 感受态 TA Cloning 双启动子试剂盒含 One Shot TOP10F 化学 E. coli 感受态 40 个反应 20 个反应 40 个反应 20 个反应 40 个反应货号 K CK K CK K K K K 保存说明 TA Cloning 双启动子试剂盒用干冰运输, 包含有一盒 TA Cloning 试剂 ( 盒 1), 一盒 One Shot 化学感受态菌 ( 盒 2), 货号 K ,CK ,K 和 CK 不包括 One Shot 化学感受态菌盒 1 保存在 -20 非除霜冰箱中, 盒 2 保存在 -80 下页待续 v

6 重要信息, 续前页 TA Cloning 试剂 TA Cloning 试剂 ( 盒 1) 中的试剂列表如下注意 : 用户必须提供 Taq 聚合酶 40 个反应的试剂盒以两个 20 反应的试剂盒形式提供盒 1 需保存在 -20 组份 pcr II, 线性化的 10X PCR 缓冲液组成 25 ng/µl in 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph mm Tris-HCl, ph 8.3 (at 42 C) 500 mm KCl 数量 5 x 10 µl 100 µl 25 mm MgCl % 明胶 10X 连接缓冲液 60 mm Tris-HCl, ph 7.5 dntp Mix 60 mm MgCl 2 50 mm NaCl 1 mg/ml 牛血清白蛋白 70 mm β- 巯基乙醇 1 mm ATP 20 mm 二硫苏糖醇 10 mm 亚精胺 12.5 mm datp 12.5 mm dctp 12.5 mm dgtp 12.5 mm dttp ( 调节至 ph 8.0) 100 µl 10 µl T4 DNA 连接酶 4.0 Weiss 单位 /µl 25 µl 无菌水高压灭菌的去离子水 1 ml 对照 DNA 模板对照 PCR 引物 0.1 µg/µl 溶于 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 7.5 各 0.1 µg/µl 溶于 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph µl 10 µl 下页待续 vi

7 重要信息, 续前页 One Shot 试剂下表列出了 One Shot 感受态细胞试剂盒中包含的组份货号 K ,CK , K 和 CK 不含感受态细胞 40 个反应的试剂盒以两个 20 反应的试剂盒形式提供 TOP10F 细胞的转化效率是 1 x 10 9 cfu/µg DNA INVαF 细胞的转化效率是 1 x 10 8 cfu/µg DNA 在 -80ºC 保存感受态细胞 S.O.C. 培养基组份 2% 胰蛋白胨组成 6 ml 数量 ( 可以保存在室温或者 +4ºC) 0.5% 酵母提取物 10 mm NaCl 2.5 mm KCl 10 mm MgCl 2 10 mm MgSO 4 20 mm 葡萄糖 ( 右旋糖 ) INVαF 或 TOP10F 细胞 x 50 µl puc19 对照 DNA 10 pg/µl 溶于 5 mm Tris-HCl, 0.5 mm EDTA, ph 8 50 µl INVαF 的基因型 F enda1 reca1 hsdr17 (r k -, mk + ) supe44 thi-1 gyra96 rela1 φ80lacz M15 (laczyaargf)u169 λ - TOP10F 的基因型 F [laci q Tn10 (Tet R )] mcra (mrr-hsdrms-mcrbc) Φ80lacZ M15 lacχ74 reca1 arad139 (ara-leu)7697 galu galk rpsl (Str R ) enda1 nupg vii

8 附属产品附加产品可以单独从 Invitrogen 购买的 TA Cloning 试剂盒提供的试剂以及其他适合与该试剂盒配合使用的产品订货信息参见下表项目数量货号 Platinum Taq DNA 聚合酶 100 个反应 C 个反应 C 个反应 C 个反应 C Platinum Taq DNA 高保真聚合酶 100 单位 C 重组 Taq DNA 聚合酶 100 单位单位 PureLink HQ 质粒小量提取试剂盒 100 个反应 K IPTG 1 g X-gal 100 mg g Bluo-gal 1 g 卡那霉素 5 g g 氨苄青霉素 200 mg One Shot 感受态细胞 E. coli 感受态细胞可以从 Invitrogen 单独购买, 感受态细胞以方便使用的 One Shot 形式提供项目数量货号 One Shot INVαF 化学 E. coli 感受态 20 个反应 C 个反应 C One Shot TOP10F 化学 E. coli 感受态 20 个反应 C 个反应 C One Shot TOP10 化学 E. coli 感受态 20 个反应 C 个反应 C One Shot Mach1 -T1 R 化学 E. coli 感受态 20 个反应 C viii

9 介绍概述目的含有 pcr II 的 TA Cloning 双启动子试剂盒提供把 PCR 产物直接插入质粒载体的一步法快速克隆策略 T7 和 Sp6 启动子允许在体内或体外转录插入片段的正向和反向产物优点使用 TA Cloning 双启动子试剂盒可以 : 免除对 PCR 产物的任何酶切修饰不需要 PCR 引物中包含限制性内切酶位点可以双向转录插入片段 TA Cloning 的工作原理 Taq 聚合酶具有非模板依赖性向 PCR 产物的 3 末端加单个脱氧腺苷 (A) 的活性试剂盒中提供的线性化载体的末端具有一个 3 脱氧胸苷 (T) 残基这样就使得 PCR 产物可以有效的连接到载体上图示下图表示了 TA Cloning 方法的概念 Vector 5' 3' T 3' A 5' PCR Product 5' 3' 3' A T 5' Vector 热稳定性聚合酶具有较强的 3 到 5 核酸外切酶活性, 例如 Platinum Pfx, 它并不会在 PCR 产物的末端保留 3 A 尾因为使用 Taq 聚合酶产生的 PCR 产物的 3 A 外延残基没有被去除掉, 所以可以被高效率的连接到 TA Cloning 系统但是如果您使用保真酶或者希望克隆平末端片段, 您可以在 PCR 循环之后加入 Taq 并孵育以便在产物末端加上 3 A 尾巴参见第 14 页的步骤或者您可以尝试使用 Zero Blunt PCR 克隆试剂盒 ( 货号. K 和 K ) 这个试剂盒可以高效克隆从热稳定的保真酶得到的平末端 PCR 产物请访问我们的网站了解更多信息 ( 或者联络技术服务 ( 第 18 页 )

10 RECOMMENDATION 方法实验概要介绍为了把您感兴趣的基因克隆到 pcr II, 首先需要获得 PCR 产物 PCR 产物连接到 pcr II 之后转化感受态细胞因为 PCR 产物连接到载体上的方向有两种, 还需要分析每个单克隆的基因插入方向正确的重组质粒可以被用于后续的分析或者亚克隆流程图下表列出了把目的基因克隆到 pcr II 的主要必须步骤步骤操作 1 用 Taq 聚合酶和您自己的引物模板及参数扩增 PCR 产物 3 2 把您的 PCR 产物连接到 pcr II 4 3 用您的连接产物转化 E. coli 感受态细胞选择转化子并提取质粒 DNA 用限制性内切酶酶切或者测序的方法分析质粒 DNA 中是否插入 PCR 产物与否及其插入方向 7 页码如果您是第一次使用 TA Cloning 双启动子试剂盒, 我们建议您使用对照反应帮助评估实验结果 ( 见第页 ).

11 PCR 产物制备 PCR 指导一般 ng DNA 足够用于作为 PCR 的模板如果用 cdna 作为模板, 需要根据您感兴趣基因的相对丰度决定模板的用量为了提高连接反应效率, 我们建议扩增不要超过 30 个循环需要用户提供的材料您将要需要如下试剂和器材 PCR 所需的 DNA 模板和引物 Taq 聚合酶和合适的 10X PCR 缓冲液 ( 参见第 viii 页的订货信息 ) 热循环仪混合聚合酶如果您希望使用 Taq 聚合酶和保真酶的混合酶体系, 为了确保 PCR 产物有 3 A 尾巴,Taq 必须以 10:1 的比例过量我们推荐使用 Invitrogen 的 Platinum Taq DNA 高保真聚合酶 ( 参见第 viii 页的订货信息 ) 如果您使用的混合聚合酶中的 Taq 聚合酶不足, 保真酶, 请参见第 14 页的步骤在产物末端加上 3 A 尾 PCR 产物制备在含有如下试剂的 50µl 体系中进行 PCR 反应 : DNA 模板 ng 10X PCR 缓冲液 5 µl 50 mm dntps 0.5 µl 引物各 1 µm 无菌水加至体积为 49 µl Taq 聚合酶 1 unit 总体积 50 µl 胶纯化如果您的 PCR 没有获得单一的, 可分辨的条带, 您可能需要在进行下一步之前对您的片段进行胶纯化请小心操作, 尽量避免核酸酶的污染和长时间暴露在 UV 下另外一个办法是您可以优化 PCR 条件, 避免多条带或拖尾 (Innis et al., 1990) Invitrogen 提供的 PCR Optimizer 试剂盒可以帮您优化 PCR 反应需要更多信息请联系技术服务 ( 第 18 页 )

12 克隆到 pcr II RECOMMENDATION 为了提高连接效率, 我们建议使用新鲜 ( 小于 1 天 ) 的 PCR 产物 PCR 产物末端单个 3 A 尾会随这时间的延长而降解, 从而降低连接效率操作 pcr II 时需要小心, 因为丢掉 3 T 外延残基将导致载体平末端自连, 从而降低连接效率 PCR 产物用量的计算用下面的公式计算与 50 ng (20 fmoles) pcr II 载体连接的 PCR 产物的用量 : X ng PCR 产物 = (Y bp PCR 产物 )(50 ng pcr II 载体 ) (pcr II 载体的片段长度 bp: ~3900) X ng 是长度为 Y 个碱基对的 PCR 产物与载体以 1:1 ( 载体 : 插入片段 ) 的摩尔比连接时的用量一般 0.5 到 1.0 µl 平均长度 ( bp) 的常规 PCR 样品可以满足 1:1( 载体 : 插入片段 ) 的比例 1:1( 载体 : 插入片段 ) 的比例可以得到最好的连接效率如果您担心您的 DNA 浓度的准确性, 可以用 1:3( 载体 : 插入片段 ) 的比例进行第二次连接反应不要使用超过 2-3 µlpcr 样品进行连接反应, 因为 PCR 样品中的盐会抑制 T4 DNA 连接酶连接反应温度低于或者超过 14 C 可能会降低连接效率步骤 1. 根据 PCR 产物的用量 ( 参照上述方法 ) 确定 PCR 样品的用量如有必要可以用无菌水稀释 PCR 样品 2. 建立如下 10 µl 连接反应体系 : 新鲜 PCR 产物 X µl 10X 连接缓冲液 1 µl pcr II 载体 (25 ng/µl) 2 µl 无菌水加至体积为 9 µl T4 DNA 连接酶 (4.0 Weiss 单位 ) 1 µl 终体积 10 µl 3. 连接反应体系在 14 C 孵育至少 4 小时 ( 过夜更好 ) 进行下一步, 转化感受态细胞, 见下一页注释 : -20 C 保存您的连接反应体系, 直到准备好进行转化实验

13 RECOMMENDATION 转化感受态细胞介绍当您已经把插入片段连接到 pcr II, 您就已经可以把载体转化进感受态 E. coli 了为了方便转化, 货号是 K , K , K , 和 K 的试剂盒提供了 One Shot 细胞本节提供了 One Shot 细胞的转化步骤如果要转化其它感受态菌株, 请参见厂家的说明 INVαF 不表达 lac 抑制子由于 pcr II 有 lac 启动子, 您可以在不加 IPTG 的条件下表达您的产物 IPTG 不会对 INVαF 发挥任何作用 TOP10F 表达 lac 抑制子 (laci q ), 该抑制子将抑制 lac 启动子的转录如果要进行插入子的蓝白斑筛选, 您必须在平板中加入 IPTG 以表达 LacZα E. coli 宿主菌株您可以使用任何 reca, enda E. coli 菌株, 包括 TOP10, TOP10F, INVαF, DH5α 或者其他相类似的菌株进行转化其它的菌株也适合请参见第 viii 页中的列表了解 Invitrogen 可以提供的感受态 E. coli 使用感受态细胞感受态细胞对温度和移液器造成的机械裂解很敏感在操作感受态细胞的时候需要非常温和在冰上溶解细胞以后立即开始转化样品加入细胞以后用移液器枪尖温和搅拌混匀所有操作步骤尽可能保持细胞处于低温状态操作转化产物和铺板的时候使用无菌操作如果您的 PCR 产物扩增于具有氨苄青霉素抗性的质粒, 请使用卡那霉素筛选 pcr II 转化子使用卡那霉素筛选可以避免原始的带有氨苄青霉素抗性的质粒造成的污染需要用户提供的材料除了常规微生物学实验所需材料 ( 例如平板和涂菌器 ), 您还需要提供以下试剂和仪器适合转化的化学 E. coli 感受态细胞 S.O.C. 培养基 ( 预热到室温 ) 阳性对照, 可选 ( 例如 puc19) LB 平板, 含有 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素 ( 每个转化给两个 ) 42 C 水浴锅 37 C 摇床和非摇动孵育箱下页待续

14 转化感受态细胞, 续前页准备转化水浴锅预热平衡至 42 C S.O.C. 培养基置于室温如果您使用 INVαF 细胞, 把带有抗生素的 LB 培养基置于 37 C 30 分钟每板涂布 40 mg/ml 的 X - Gal 40 µl 让液体被平板吸收如果您使用 TOP10F 细胞, 把带有抗生素的 LB 培养基置于 37 C30 分钟每板涂布 100 mm IPTG 和 40 mg/ml X-Gal 各 40 µl 让液体被平板吸收 One Shot 转化步骤按照以下步骤转化 One Shot 感受态细胞转化其他菌株, 请按照其生产厂家的说明进行 1. 离心装有连接产物的管子并置于冰上 2. 在冰中化冻 50 µl One Shot 感受态细胞, 每个转化化冻一管 3. 每个转化用移液器取 2 µl 连接产物直接加入到感受态细胞中, 用枪头温和搅拌混匀 4. 在冰中放置 30 分钟剩余的连接体系可在 -20 C 中保存 5. 在 42 C 非振荡条件下热激细胞 30 秒, 之后把反应管立即置于冰中 6. 每管加入室温的 S.O.C. 培养基 250 µl 7. 在 37 C 摇床中, 以 225 rpm 的速度水平振荡 1 小时 8. 从转化反应管中取 10µl 至 200 µl, 涂布于含有 X-Gal 和 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板如果您使用的是 TOP10F 细胞, 确保平板含有 IPTG 我们建议如果使用 TOP10F 细胞, 涂布 µl; 如果使用 INVαF 细胞涂布 µl N 注释 : 确保涂布两个不同的体积, 以保证至少有一个平板有可以分辨的菌落如果需要涂布较小的体积, 在菌液中加入 20 µl S.O.C. 培养基以便均匀的涂布 9. 37ºC 过夜培养平板把平板放置到 +4 C 显色 2-3 小时 Important 相对于其他 E. coli 菌株, 转化的 INVαF 过夜培养后菌落看起来很小在挑克隆分析以前需要额外培养 2-3 小时期望的结果对于 bp 的插入片段, 根据涂布的菌液量, 您将得到每板个菌落这些在 X-Gal 平板 (INVαF ) 或 X-Gal/IPTG 平板 (TOP10F ) 上的菌落有 80% 是白色的菌落需要注意的是, 连接效率与插入片段的大小有关, 片段越大效率越低

15 转化子分析分析阳性克隆 1. 挑取至少 10 个白色单菌落进行质粒的提取和酶切分析 2. 在 2-5 ml 含有 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中过夜培养菌落 3. 提取质粒, 用酶切图谱或测序的方法分析片段的插入方向我们建议使用 PureLink HQ 质粒小量纯化试剂盒纯化您的质粒 DNA( 请参见第 viii 页的订货信息 ) 插入片段测序如果您需要对 pcr II 中的插入片段测序, 可以用 Sp6 启动子引物或 M13 反向引物从 lac 启动子方向测定插入片段序列如果需要从 laczα 片段方向测定插入片段的序列, 可以使用 Τ7 启动子引物或者 M13(-20) 正向引物引物序列和引物结合位点请参见第 16 页的图谱为了您的方便,Invitrogen 提供引物合成服务更多信息请浏览我们的网站 ( 或联系技术服务 ( 第 18 页 ) Important 如果您没有获得转化子或者没有正确插入的克隆, 请按照第页进行对照反应这些反应将帮助您诊断和排除实验中的故障参见第 8 页的故障诊断与排除故障诊断与排除部分了解更多技巧长期保存当您鉴定得到了正确的克隆, 请纯化菌落并制备甘油菌以便长期保存我们建议您在 -20 C 保存一份质粒 DNA 1. 用原始菌落在含有 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上划线 2. 分离单菌落接种到含有 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中 3. 培养至平台期 4. 混合 0.85 ml 培养物和 0.15 ml 无菌甘油, 加入到冻存管中 5. 在 -80 C 中保存

16 故障诊断与排除介绍如果您没有获得预期的结果, 用下表诊断和排除您实验中的问题我们推荐进行对照反应 ( 第页 ) 帮助您评估您的实验结果问题原因解决办法转化没有获得菌落细菌不是感受态菌使用 One Shot 试剂盒中的 puc19 对照载体检测转化效率平板的抗生素浓度不正确或者平板太老使用 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素使用新鲜的氨苄青霉素平板 (<1 个月 ) 白色菌落不含有插入片段载体上的单 3 T 外延残基被降解使用另外一管载体避免保存载体超过 6 个月, 避免反复冻融用自连反应检测载体, 见第 11 页大多数菌落为蓝色或浅蓝色, 白色菌落很少插入片段没有破坏 lacz 基因的读码框如果您的插入片段较小 (< 500 bp), 您可能得到浅蓝色菌落分析蓝色的菌落, 它们可能含有插入片段使用的聚合酶不能加 3 A 尾不要使用保真酶, 例如 Platinum 连接以前用胶纯化了 PCR 产物连接反应以前 PCR 产物已经保存了较长时间连接体系中加入了过多扩增反应样品连接反应中使用错误的载体 : 插入片段摩尔比 Pfx, 因为它们不能加 3 A 尾使用 Taq 聚合酶胶纯化可以去除 3 A 尾如果需要胶纯化, 使用无核酸酶活性的试剂或者优化您的 PCR 反应条件使用新鲜的 PCR 产物就算保存 1 天也会减低反应效率 PCR 反应体系中的盐会抑制连接反应在连接反应中使用不超过 2-3 µlpcr 反应样品估计 PCR 产物的浓度建立载体 : 插入片段摩尔比为 1:1 或 1:3 的连接反应体系下页待续

17 故障诊断与排除, 续前页问题原因解决办法一些菌落为浅蓝色或外周白色中间蓝色白色菌落或者蓝色菌落大小正常, 但是围绕着一些小的白色克隆白色菌落在液体培养基中不生长 lacz 的残留表达或者插入片段只部分破坏了 lacz 小克隆是氨苄青霉素敏感的卫星菌落不要挑小菌落因为它们不含有质粒氨苄青霉素敏感的卫星菌落如果您需要小的插入片段,500bp 或者更小, 分析这些菌落, 它们可能含有插入片段使用卡那霉素筛选确保您的氨苄青霉素的储液和平板都是新鲜的请挑取大的白色菌落确保氨苄青霉素新鲜使用卡那霉素以避免这个问题仅得到白色菌落平板上没有 IPTG 或 X-Gal 蓝白斑筛选时确保加入 X-Gal, 如果使用 TOP10F 确保加入 IPTG 和 X- Gal 测序得不到结果没有 PCR 产物不小心使用了试剂盒中的扩增引物进行测序它们是用于制备对照 PCR 产物的引物使用的 T7 引物序列不正确 Taq 聚合酶失活或者您的 PCR 反应条件不佳使用 M13 正向 (-20) 和反向引物测序您也可以用 T7 或 Sp6 启动子引物测定插入片段的序列检查 T7 启动子引物, 确保其序列和 pcr II 上的引物结合位点匹配按照第页进行对照反应, 测试 Taq 聚合酶的活性如果 Taq 聚合酶活性正常, 您将需要优化 PCR 反应条件质粒产量低细胞在 LB 中生长不良尝试使用含有适当抗生素的 S.O.C. 培养基下页待续

18 故障诊断与排除, 续前页解读对照反应下表说明了为了诊断和排除 TA Cloning 实验中的问题进行的对照反应和如果解释对照反应的结果自连反应对照反应解释这个对照反应显示 pcr II 是否丢失了 3 T 外延残基丢失 T 外延残基导致平末端连接, 破坏 laczα 的读码框导致产生假白色菌落一般情况下小于 5% 的菌落是白色菌落转化对照检测 One Shot 感受态细胞的转化效率 PCR 产物对照连接反应对照 INVαF 的转化效率应该为 1 x 10 8 cfu/µg DNA, TOP10F 的转化效率应该为 1 x 10 9 cfu/µg DNA 检测包括 Taq 聚合酶在内的 PCR 试剂检测连接反应试剂和 pcr II 白色菌落应大于 80%, 并且含有插入克隆

19 附录进行自连反应介绍 TA Cloning 载体如果没有经过反复冻融在 6 个月内是稳定的载体储存超过这个时间或者经过反复冻融将丢失 3 T 外延碱基, 导致产生假阳性白色菌落按照下面的步骤操作进行自连反应并转化 One Shot 感受态细胞如果您使用其他 E. coli 菌株, 请参见其生产厂家的说明步骤 1. 如下建立 10 µl 自连反应体系 : 无菌水 6 µl 10X 连接缓冲液 1 µl pcr II 载体 (25 ng/µl) 2 µl T4 DNA 连接酶 (4.0 Weiss 单位 ) 1 µl 总体积 10 µl C 孵育过夜短暂离心连接反应管, 置于冰中 3. 在冰中化冻 50 µl One Shot 感受态细胞, 每个转化反应化冻一管 4. 从上述第一步的对照连接体系中用移液器吸取 1 µl 连接产物直接加入到感受态细胞中, 用枪尖温和搅拌混匀 5. 在冰中放置 30 分钟剩余的连接体系可在 -20 C 中保存 6. 在 42 C 非振荡条件下热激细胞 30 秒, 之后把反应管立即置于冰中 7. 反应管中加入室温的 S.O.C. 培养基 250 µl 8. 反应管在 37 C 摇床中, 以 225 rpm 的速度水平振荡 1 小时 9. 转化反应管中取 50 µl, 涂布于含有 X-Gal 和 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板如果您使用的是 TOP10F 细胞, 确保平板含有 IPTG ºC 过夜培养平板期望的结果您将从涂布 50µl 的平板上得到 5-25 个蓝色菌落由超螺旋 pcr II 载体得到的白色菌落少于 5% 随着时间的增加,3 T 外延残基将降解, 导致载体平末端自连这将导致 lacz 的移码突变, 从而产生假白色或者浅蓝色不含插入片段的菌落

20 进行对照反应介绍我们推荐您在第一次使用本试剂盒的时候进行对照反应以评估您的结果进行对照反应包括用试剂盒提供的试剂制备 PCR 产物并用该产物进行连接反应制备对照 PCR 产物使用 Taq 聚合酶和如下步骤扩增对照 PCR 产物 1. 建立如下 50 µl PCR 反应体系 : 对照 DNA 模板 (100 ng) 1 µl 10X PCR 缓冲液 5 µl 50 mm dntps 0.5 µl 对照 PCR 引物 1 µl 无菌水 41.5 µl Taq 聚合酶 (1 单位 /µl) 1 µl 总体积 50 µl 2. 用 70 µl 矿物油覆盖 3. 按照下表的参数循环扩增 : 步骤时间温度循环变性 1 分钟 94 C 退火 1 分钟 55 C 25X 延伸 1 分钟 72 C 终延伸 7 分钟 72 C 1X 4. 从反应体系中取 10 µl 用琼脂糖凝胶电泳分析应该得到清晰的 700bp 条带继续按照下一页进行对照连接反应对照连接反应下页待续

21 进行对照反应, 续前页对照连接反应使用前页获得的对照 PCR 产物, 按照下面的体系建立连接反应体系一般 1 µl 对照 PCR 产物足够连接反应或者您可以参见第 4 页的公式估计与 50 ng pcr II 连接所需的 PCR 产物的量 1. 如下建立 10 µl 对照连接反应体系 : 无菌水 5 µl 10X 连接缓冲液 1 µl pcr II 载体 (25 ng/µl) 2 µl 对照 PCR 产物 1 µl T4 DNA 连接酶 1 µl 总体积 10 µl 2. 连接反应体系在 14 C 孵育至少 4 小时 ( 过夜更好 ) 3. 转化 1 µl 对照反应到一管 One Shot 感受态细胞或者其他适合的感受态 E. coli 菌株 4. 每个转化取混合物 µl 涂布到含有 50 µg/ml 卡那霉素和 X-Gal 的平板 ( 如果使用 TOP10F 细胞还要包含 IPTG) 5. 37ºC 过夜培养平板转化对照含有 One Shot 感受态细胞的 TA Cloning 试剂盒自带 puc19 质粒作为转化对照按照第 6 页的步骤, 用 10 pg puc19 转化一管 One Shot 感受态细胞在含有 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板涂布 10 µl 到 50 µl 转化混合物 TOP10F 的转化效率应该为 1 x 10 9 cfu/µg DNA,INVαF 的转化效率应该为 1 x 10 8 cfu/µg DNA 期望的结果对照连接反应应该获得 >80% 的白色菌落随着时间的增加,3 T 外延残基的降解将导致背景白色菌落 ( 没有插入片段 ) 的增加背景白色菌落的数量应该不超过 10%( 参见第 11 页的进行自连反应 ) 如果产生这种结果, 使用另外一管 pcr II 并避免反复冻融

22 添加 3 A 尾介绍一般直接连接保真酶扩增的 DNA 与 pcr II 非常困难, 因为其连接效率非常低这是由于保真酶具有 3 到 5 核酸外切酶活性, 该活性可以去除 TA Cloning 所必需的 3 A 尾 Invitrogen 开发了一种克隆平末端片段的简单方法如果您经常克隆平末端 PCR 产物, 我们推荐使用 Zero Blunt PCR 克隆试剂盒 ( 货号 K 和 K ) 克隆平末端产物需要用户提供的材料您将需要提供以下试剂和仪器 Taq 聚合酶平衡到 72 C 的加热板酚 - 氯仿 3 M 醋酸钠 100% 乙醇 80% 乙醇 TE 缓冲液步骤 1. 使用保真酶扩增以后, 把反应管至于冰中, 每管加入单位 Taq 聚合酶混匀不必更换缓冲液 C 孵育 8-10 分钟 ( 不要循环 ) 3. 立即用等体积酚 - 氯仿抽提 4. 加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠和 2X 体积的 100% 乙醇 5. 最大速度室温离心 5 分钟沉淀 DNA 6. 去除乙醇, 用 80% 乙醇洗涤沉淀, 空气中晾干 7. 用与起始 DNA 扩增反应的等体积 TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀现在 DNA 扩增产物可以用于与 pcr II 连接

23 配方 LB (Luria- Bertani) 培养基和平板配方 : 1.0% 胰蛋白胨 0.5% 酵母提取物 1.0% NaCl ph 配制 1 升培养基 :10 g 胰蛋白胨,5 g 酵母提取物和 10 g NaCl, 用 950 ml 去离子水溶解 2. 用 NaOH 调节 ph 至 7.0, 补齐体积至 1 升 lbs./sq. inch. 高压灭菌 20 分钟, 如果需要可以待冷却到 55 C 加入适当的抗生素 4. 室温或者 +4 C 保存 LB 琼脂平板 1. 如上制备 LB 培养基, 不同的是高压灭菌以前加入 15 g/l 琼脂 lbs./sq. in. 高压灭菌 20 分钟 3. 高压灭菌以后, 冷却到约 ~55 C, 加入抗生素 (100 µg/ml 氨苄青霉素或 50 µg/ml 卡那霉素 ), 倒 10 cm 平板 4. 等待平板凝固,+4 C 倒置保存

24 pcr II 图谱和特征 pcr II 图谱线性化的 pcr II 载体如下图所示箭头指示 T7 和 Sp6 RNA 聚合酶的转录起始位点 pcr II 的全序列可以从我们的网站获得 ( 您也可以联系技术服务 ( 第 18 页 ) lacza ATG M13 Reverse Primer Sp6 Promoter CAG GAA ACA GCT ATG AC C ATG ATT ACG CCA AGC T AT TTA GGT GAC ACT ATA GAA GTC CTT TGT CGA TAC TG G TAC TAA TGC GGT TCG A TA AAT CCA CTG TGA TAT CTT Nsi I Hind III Kpn I Sac I BamH I Spe I TAC TCA AGC TAT GCA TCA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA GTA ACG GCC ATG AGT TCG ATA CGT AGT TCG AAC CAT GGC TCG AGC CTA GGT GAT CAT TGC CGG BstX I EcoR I GCC AGT GTG CTG GAA TTC GGC T T CGG TCA CAC GAC CTT AAG CCG AA PCR Product EcoR I EcoR V A A GCC GAA TTC TGC AGA TAT T T CGG CTT AAG ACG TCT ATA BstX I Not I Xho I Nsi I Xba I Apa I CCA TCA CAC TGG CGG CCG CTC GAG CAT GCA TCT AGA GGG CCC AAT TCG CCC TAT GGT AGT GTG ACC GCC GGC GAG CTC GTA CGT AGA TCT CCC GGG TTA AGC GGG ATA T7 Promoter M13 Forward (-20) Primer AGT GAG TCG TAT TA C AAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA C AA CG T CGT GAC TGG GAA AAC TCA CTC AGC ATA AT G TTA AGT GAC CGG CAG CAA AAT G TT GC A GCA CTG ACC CTT TTG +1 P lac lacz f1 ori Comments for pcr II 3971 nucleotides puc ori Ampicillin pcr II 4.0 kb Kanamycin LacZa gene: bases M13 Reverse priming site: bases Sp6 promoter: bases T7 promoter: bases M13 (-20) Forward priming site: bases f1 origin: bases Kanamycin resistance ORF: bases Ampicillin resistance ORF: bases puc origin: bases 下页待续

25 pcr II 图谱和特征, 续前页 pcr II 的特征下表描述了 pcr II 的特征所有特征都经过功能验证 lac 启动子 laczα 片段特征卡那霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因 puc 复制起始子优点让细菌表达 laczα 片段, 用于 α 互补 ( 蓝白斑筛选 ) 编码 β 半乳糖苷酶的前 146 个氨基酸与 Ω 片段顺势互补可以用于 β 半乳糖苷酶的蓝白斑筛选用于质粒在 E. coli 的筛选和保存, 克隆具有氨苄青霉素抗性的质粒作为模板的扩增产物时使用用于质粒在 E. coli 的筛选和保存用于质粒在 E. coli 中的复制, 保持和高拷贝数 Sp6 启动子和引物结合位点用于体内或体外转录正义 RNA 用于插入片段的测序 T7 启动子和引物结合位点用于体内或体外转录反义 RNA M13 正向 (-20) 和 M13 反向引物结合位点 f1 复制起始子用于插入片段的测序用于插入片段的测序用于突变或单链测序中单链的获得

26 技术服务国际互联网用您的国际互联网浏览器浏览 Invitrogen 网络资源在我们的网站, 您可以 : 获得关于热门新产品和产品特惠信息的独家新闻浏览和下载载体图谱和序列下载 Adobe Acrobat (PDF) 格式的说明书浏览我们带有彩图的目录获取 Invitrogen 产品的引用文献索取目录和产品文献建立 Internet 连接以后, 打开网页浏览器 (Internet Explorer 5.0 或更新版本或者 Netscape 4.0 或更新版本 ), 输入如下地址 ( 或 URL): 程序将直接连接到我们的网页点击有下划线的文字或概要图片浏览别忘了把我们的网页加入收藏夹以便参考! 联系我们如需更多信息或技术帮助, 请电话, 信件, 传真或者联系我们更多的国际办事处信息请参见我们的网站 ( Corporate Headquarters: Invitrogen Corporation 1600 Faraday Avenue Carlsbad, CA USA Tel: Tel (Toll Free): Fax: tech_service@invitrogen.com 中国 : 上海英骏生物技术有限公司北京经济技术开发区荣昌东街 7 号隆盛工业园 203 邮编 : 传真 : 技术支持热线 : ; cntechsupport@invitrogen.com 网址 :cnservice.invitrogen.com European Headquarters: Invitrogen Ltd Inchinnan Business Park 3 Fountain Drive Paisley PA4 9RF, UK Tel: +44 (0) Tech Fax: +44 (0) eurotech@invitrogen.com 材料安全数据表 (MSDS) 获取如需获取 MSDS, 浏览我们的网站在主页点击技术资源 (Technical Resources), 选择 MSDS, 根据说明下载您需要的产品的 MSDS 下页待续

27 技术服务, 续前页有限质保 Invitrogen 致力于为我们的客户提供高品质的产品和服务我们的目标是用我们的产品和服务保证每个客户的 100% 满意如果您对 Invitrogen 的产品或服务有任何疑虑, 请联系我们的技术服务代表 Invitrogen 保证我们所有的产品符合产品分析报告 (COA) 上的指标公司将免费更换任何不符合这些指标的产品 Invitrogen 这一保证仅限于相关产品的费用保证不适于超过效期的产品保证不应用于未按照说明书上的保存条件正确保存的产品 Invitrogen 保留选择产品分析方法的权利, 除非 Invitrogen 在接受订单之前书面同意使用特定的方法 Invitrogen 尽全力保证其出版物的正确, 但是认识到不可避免的偶尔会出现打字错误或其它错误所以 Invitrogen 不对其出版物或文档的内容及其相关事宜提供保证如果您发现我们的出版物有错误, 请报告给我们技术服务代表 Invitrogen 不承担任何形式的连带损失包括但不限于特殊的, 偶然的, 间接的连带损失以上有限保证具有独立性和排他性以上有限保证具有独立性和排他性我们不做任何其他的保证, 无论是直接表达的, 暗示的保证还是任何商业利益的, 特殊目的的保证

28 产品质量限制性酶切为了进行质量鉴定, 酶切起始的超螺旋 pcr II 质粒 TA 接头之前的限制性酶切位点酶切后用琼脂糖凝胶电泳分析, 条带必须正确克隆效率载体制备好之后, 用试剂盒提供的对照试剂进行批次质量分析用第页的方法, 把 750bp 的对照 PCR 产物连接到 pcr II, 转化试剂盒中的 One Shot 化学感受态为了满足质量要求, 必须符合以下质量标准 : 自连 :< 5% 白色转化子 PCR 产物连接 :> 80% 白色转化子克隆效率 : > 90% 白色转化子含有插入正确 PCR 产物的 pcr II 引物两个引物都已经通过批次质量鉴定, 质量鉴定使用二缩酚酸链终止技术 DNA 测序的方法 One Shot 化学感受态 E. coli 所有的感受态细胞按照以下内容进行质量鉴定 : 用试剂盒中提供的质粒检测感受态细胞的转化效率转化产物涂布到含有 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板, 计算感受态效率测试重复进行转化效率需要达到以下标准 : INVαF 1 x 10 8 cfu/µg DNA TOP10F 1 x 10 9 cfu/µg DNA 为了验证没有噬菌体污染, 在 LB 顶层琼脂中加入 ml 感受态细胞, 铺到 LB 平板上过夜培养之后, 应该检测不到空斑未转化的细胞铺到含有 100 µg/ml 氨苄青霉素,25 µg/ml 链霉素,50 µg/ml 卡那霉素或 15 µg/ml 氯霉素的 LB 平板, 验证细胞不含有抗生素抗性污染

29 参考文献 PCR 技术的一般参考文献 Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., and White, T. J. (eds) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, Inc., San Diego, CA. 一般分子生物学技术 Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., eds (1990) Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York. TA Cloning Andres, D. A., Seabra, M. C., Brown, M. S., Armstrong, S. A., Smeland, T. E., Cremers, F. P. M., and Goldstein, J. L. (1993) cdna Cloning of Component A of Rab Geranylgeranyl Transferase and Demonstration of Its Role as a Rab Escort Protein. Cell 73: Bates, M. D., Olsen, C. L., Becker, B. N., Albers, F. J., Middleton, J. P., Mulheron, J. G., Jin, S.-L. C., Conti, M., and Raymond, J. R. (1993) Elevation of camp Is Required for Down-regulation, but not Agonist-induced Desensitization, of Endogenous Dopamine D1 Receptors in Opossum Kidney Cells. J. Biol. Chem 268: Chen, Y., Weeks, J., Mortin, M. A., and Greenleaf, A. L. (1993) Mapping Mutations in Genes Encoding the Two Large Subunits of Drosophila RNA Polymerase II Defines Domains Essential for Basic Transcription Functions and for Proper Expression of Developmental Genes. Molec. Cell. Biol. 13: Clark, J. M. (1988) Novel Non-Templated Nucleotide Addition Reactions Catalyzed by Procaryotic and Eucaryotic DNA Polymerases. Nucleic Acids Res. 16: Falls, D. L., Rosen, K. M., Corfas, G., Lane, W. S., and Fischbach, G. D. (1993) ARIA, a Protein that Stimulates Acetylcholine Receptor Synthesis, is a Member of the Neu Ligand Family. Cell 72: Hake, L. E. and Hecht, N. B. (1993) Utilization of an Alternative Transcription Initiation Site of Somatic Cytochrome c in the Mouse Produces a Testis-Specific Cytochrome c mrna. J. Biol. Chem. 268: Liang, P. and Pardee, A. B. (1992) Differential Display of Eukaryotic Messenger RNA by Means of the Polymerase Chain Reaction. Science 257: Lin, X.-L., Lin, Y.-Z., Koelsch, G., Gustchina, A., Wlodawer, A., and Tang, J. (1992) Enzymic Activities of Twochain Pepsinogen, Two-chain Pepsin, and the Amino-terminal Lobe of Pepsinogen. J. Biol. Chem. 267: 下页待续

30 参考文献, 续前页 Mahendroo, M. S., Mendelson, C. R., and Simpson, E. R. (1993) Tissue-specific and Hormonally Controlled Alternative Promoters Regulate Aromatase Cytochrome P450 Gene Expression in Human Adipose Tissue. J. Biol. Chem. 268: Mallick, C. A., Dudley, E. C., Viney, J. L., Owen, M. J., and Hayday, A. C. (1993) Rearrangement and Diversity of T Cell Receptor β Chain Genes in Thymocytes: A Critical Role for the β Chain in Development. Cell 73: Mead, D. A., Pey, N. K., Herrnstadt, C., Marcil, R. A., and Smith, L. M. (1991) A Universal Method for the Direct Cloning of PCR Amplified Nucleic Acid. Bio/Technology 9: Miller, W. H., Kakizuka, A., Frankel, S. Warrell, R. P., DeBlasio, A., Levine, K., Evans, R. M., and Dmitrovsky, E. (1992) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Rearranged Retinoic Acid Receptor α Clarifies Diagnosis and Detects Minimal Residual Disease in Acute Promyelocytic Leukemia. Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: Invitrogen Corporation. All rights reserved. For research use only. Not intended for any animal or human therapeutic or diagnostic use. 仅限于科研使用, 请勿用于动物或人类的疾病诊断及治疗企业名称 : 上海立菲生物技术有限公司 ( 原上海英骏生物技术有限公司 ) 工厂地址 : 北京经济技术开发区荣昌东街 7 号隆盛工业园 203 邮编 : 技术支持热线 : 或技术支持邮箱 :cntechsupport@lifetech.com

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分子生物学实验专题手册.ai >> 2002 Piscataway CRO OptimumGene TM CloneEZ ONE-HOUR Western TM THE TM Epitope Tag 36 36 39 40 41 41 41 45........................ 47 47 47 47 48............... 19 19 20 21 22............... 23 23 24