內科學誌 2008;19:516-522 某醫學中心 Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii complex 1,2 彭銘業 1 詹明錦 1,2 張峰義 三軍總醫院 1 感染管制室 2 感染科 摘 要 Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex ( 簡稱 Ac-Ab complex ) 為革蘭氏陰性桿菌, 造成的感染日益增加, 近年來漸漸成為重要的院內致病菌 由於其天然的多重抗藥特性, 對其他抗生素極容易產生抗藥性, 故逐漸成為院內感染的主要菌株, 為瞭解 Ac- Ab complex 菌株於本院院內血流感染之分子生物流行病學, 以建立本院 Ac-Ab complex 院內血流感染資料庫, 作為 Ac-Ab complex 爆發流行或群聚感染調查工具, 而增加對 Ac-Ab complex 流行病學的研究將有助於防止 Ac-Ab complex 之擴散, 依據美國 CDC 定義收集 2005-2006 年院內 Ac-Ab complex 血流感染菌株進行脈衝電泳分型法 ( Pulsed-Field Gel Electrophoresis Analysis ), 資料顯示所收集 49 株院內血流 Ac-Ab complex 感染其分子分型並不相同, 也並未有明顯關聯性, 由此可見某醫學中心院內血流 Ac-Ab complex 感染並無群聚情形發生或優勢菌株存在, 探討原因應與醫護人員落實執行感染管制措施及抗生素使用管制的執行有關, 本院洗手設置的便利性及數量可謂充分, 而感控人員持續在職教育及稽核等因素亦有關, 在抗生素敏感性試驗方面可以發現 Ac-Ab complex 院內血流感染對抗生素 ampicillin cephalothin ceftriaxone flomoxef 皆呈抗藥性, 但對 ceftazidime cefepime gentamicin amikacin ciprofloxacin 及 trimethoprim-sulfamethoxazole 之抗藥性大於四成以上, 對於用來治療院內感染 Ac-Ab complex 最後一線藥物 imipenem 抗藥性則為 6.1% 關鍵詞 :Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex 院內感染脈衝電泳分型法 ( Pulsed-field gel electrophoresis analysis ) 抗生素敏感性試驗 Imipenem 聯絡人 : 彭銘業 通訊處 :114 臺北市內湖區成功路二段 325 號三軍總醫院感染科
某醫學中心 Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex 517 前言 Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex( 簡稱 Ac-Ab complex) 廣泛存在於各種物體表面及無生命的環境, 是種生長條件只需少許營養即可存活的非發酵性革蘭氏陰性球桿菌, 此特性使其得以長期存在醫院 1,2 內乾燥或潮濕的環境中, 成為伺機性致病菌, 近幾年已成為院內感染的重要病原菌 3 Ac-Ab complex 可自正常人的皮膚 喉嚨及其他部位分 4,5 離出來, 對於一般健康的人很少引起嚴重感染, 但卻容易造成住院病患伺機性的感染, 尤以加護中心及免疫不全的病患為最, 常引起重症及免疫不全病患嚴重的感染 ; 而住院天數的延長 使用廣效性抗生素及接受化學治療的病患, 則有較高的 Ac-Ab complex 菌移生率 4 在臺大醫院 2000 年的統計研究中發現, 在短短的 2 年間 Ac-Ab complex 對所有抗生素感受性試驗均呈現抗藥性的比率由 0% 迅速攀升至 6.5% 6 ; 在 1999 年 7 月至 9 月於紐約布魯克林區醫院收集 419 株 Ac-Ab complex 的研究中發現, Ac-Ab complex 對於 imipenem 或 meropenem 呈現抗藥性比例在所有臨床分離菌中高達 53%, 而對於全部測試抗生素呈抗藥性比例也達 12%, 經由核糖體分型 (ribotyping) 顯示高達 62% 為單一型別而確定多重抗藥性不動桿菌已經造成該地區的流行 7 經研究發現 Ac-Ab complex 在院內感染中混合多種分子型別 ( molecular heterogeneity) 的特性 8, 而鑑別菌株分型的方法有很多 9, 確認菌株分型可證實群突發事件, 有助於決定治療及隔離的方式, 進而阻斷群突發之繼續流行, Ac-Ab complex 分子分型方法, 有脈衝式電泳 ( pulsed-field gel electrophoresis, PFGE), 核糖體基因分型 (ribotyping) 全細胞蛋白分析 ( w h o l e c e l l p r o t e i n a n a l y s i s ) 質體分析 8,10,11 ( plasmid analysis) 等, 而 PFGE 分型法近年來已成為 Salmonella, Shigella 等多種腸道致病菌的標準分型法, 其優越的再現性與敏感性已漸成為許多實驗室主要使用的分型工具 最近國內亦有利用 PFGE 作為 Ac-Ab complex 分型工具之研 究成果發表於著名期刊 12, 其分型的效力可作為 院內感控的有效佐証工具, 藉由各實驗室間所 建立之指紋資料庫的相互比對, 亦可作為追蹤 感染源的科學性証據 本文之內容主要在探討北部某醫學中心 Ac-Ab complex 院內菌血症菌株之分子流行病 學分析, 以了解其院內感染分布情形及流行趨 勢 材料與方法 研究材料 本研究依據該醫學中心專任感染管制護理 13 師依美國疾病管制中心公佈之院內感染定義進 行全院性監測, 收集 2005 至 2006 年符合院內 Ac-Ab complex 血流感染定義者相關資料並加以 統整分析, 予以收案並將菌株保留, 資料收集 包含病患年齡 性別 潛在疾病因素 侵入性 醫療措施 感染部位及抗生素敏感試驗結果, Ac-Ab complex 菌株之鑑定方式為臨床病人送 檢之血瓶經 BaT/AlerT 機器培養為陽性後, 將陽 性血瓶取出將瓶內血液混合物接種於 Columbia agar with 5%sheep blood MacConkey agar Chocolate agar Anaerobic blood agar 培養於 35 隔夜培養, 次日挑取菌落製成 0.5 McFarland 硫酸 鋇標準液, 然後以 VITEK 2 system 自動化儀器鑑 定為 Ac-Ab complex 後發出報告 研究方法 一 將收集之院內血流感染 Ac-Ab complex 菌株, 以脈衝式電泳分析法進行分子流行病學 分析, 方法敘述如下 : 1. 細菌之包埋 酵素處理與清洗 ( B a c t e r i a l Embeding, Enzyme Digesting, and Washing ) 依據 PFGE 標準操作方法進行菌體之包埋 酵素處理及清洗, 其過程簡述如下 : 第一天挑 取單一菌落接種於 MacConkey 培養基於 35 溫 箱培養 16-18 小時 ; 第二天以棉棒刮取菌體, 於 Cell Suspension Buffer (100 mm Tris-Cl, 100 mm E D TA, p H 8. 0 ) 中做成懸浮液, 以濁度計 (Turbidity Meter, Dade Microscan TM ) 測量, 調整 菌液濃度至 0.68-0.72 ( in Falcon 2054 tubes ),
518 彭銘業詹明錦張峰義 取 400 μl 菌液至 1.5 ml 微量離心管, 加 20 μl proteinase K ( 20 mg/ml ), 混合後加入 400 μl 融化後回溫至 56 的 1% SeaKem Gold agarose/1% SDS, 快速以微量吸管混均勻後注入模具中, 放置於室溫 15 min 或 4 5 min 使充份凝固, 再將膠體自模具中推入 5 ml Cell Lysis Buffer ( 50 mm Tris.Cl; 50 mm EDTA,pH 8.0; 1% Sarcosine; 0.1 mg/ml proteinase K ), 置於 56 水浴器振盪 2 小時 ; 膠體經酵素處理後, 加 15 ml 預熱至 56 的 ddh2o, 置水浴器振盪 15 min, 重覆 ddh2o 清洗一次, 再以 15 ml 預熱至 56 的 TE buffer ( 10 mm Tris-Cl,pH8.0, 1 mm EDTA,pH 8.0) 清洗四次, 膠體最後保存於 5 ml 的 TE 中, 置於 4 冷藏, 以供 PFGE 電泳分析使用 2.PFGE 電泳分析 ( PFGE Analysis ) 以刀片切取約 2-mm 寬含 chromosome DNA 的膠薄片 ( slice ), 膠薄片先置入 200μl 的指定之限制 ( ApaI ) 緩衝液, 室溫下放置 5 min, 以微量吸管吸出緩衝液, 再注入 200μl 含 20U 限制之緩衝液, 置於 35 下放置 2 小時, 以微量吸管吸出緩衝液再注入 200 μl 的 0.5X TBE buffer ( 89 mm Tris borate, 2 mm EDTA ), 放置 5 min 後, 將膠薄片取出, 用吸水紙儘量吸乾附著於膠薄片之緩衝液, 再將膠薄片依序平貼於孔梳 (coomb) 上,15 孔之膠片於第 1 5 10 15 孔位置,10 孔之膠片於第 1 5 10 孔位置放置以 XbaI 切割之 S. enterica serovar Braendrap H9812 基因體 DNA 片斷做為標準量測標織 ( reference size markers ), 之後將孔梳放置於鑄膠台上, 倒入融化回溫至 56 的 1 % SeaKem Gold agarose, 放置室溫 20-30 min, 待瓊膠凝固後, 即可進行電泳 PFGE 電泳使用 Bio-Rad CHEF Mapper 脈衝式電泳儀 (Bio-Rad Laboratories Inc.), 使用指定之跑膠條件完成跑膠後, 膠片以 0.5 μg/ml 的 ethidium bromide 染色 15 min, 再以 ddh2o 退染 2 h( 過程更換水 3-4 次 ),DNA 圖譜影像再以數位影像處理系統 A l p h a E a s e TM (Alpha Innotech Corporation,San Leandro, CA) 拍照貯存成數位檔案, 以供後續比對分析 3. 脈衝式電泳法圖譜解讀 ( Intepretation of PFGE Patterns ) 菌株間任何一 DNA 片斷的差異皆可能具有 流行病學上的意義, 菌株 PFGE 圖譜只要與既有 之圖譜存有一 DNA 片斷的差異, 即視為不同的 PFGE 圖譜, 給與 PFGE 圖譜編號 有關判讀標 準與菌株間相關性之綜合判定依 Tenover 所發表 14 之 PFGE 判定準則判定之 4. 電腦輔助式電泳帶模式分析 ( Banding pattern Analysis and Dendrogram Construction by Computer-aided Method ) 脈衝場電泳法產出之電泳帶模式以電腦 軟體 AlphaEaseTM ( Applied Math, Kortrijk, Belgium) 數位化後以 Tiff 檔儲存, 電泳帶模 式隨後可利用 BioNumerics software(applied Math, Kortrijk, Belgium) 進行菌株間相似度 之分析與比對 以 Jaccard-complete linkage 法將欲分析菌株群組化 (clustering), 並以樹 狀圖 (dendrogram) 呈現 二 抗生素敏感性試驗 依據美國臨床實驗室標準機構 (Clinical and Laboratory Standards Institute; CLSI) 之操作指 引, 以抗生素紙錠擴散法 (disk diffusion) 針對 鑑定為 Ac-Ab complex 操作敏感性試驗, 其測試 方法簡要說明如下 : 挑取 Ac-Ab complex 菌株 2-3 個菌落, 種入含 2 ml TSB 之試管, 培養在 35 直至渾濁度相當於 0.5 McFarland 硫酸鋇標準液, 平均塗抹在 Mueller-Hinton agar 培養基的表 面, 再分別貼上 ampicillin(am) cephalothin ( C F ) g e n t a m i c i n ( G M ) a m i k a c i n (AN) trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT) ceftazidime(caz) ceftriaxone (CRO) imipenem(ipm) ciprofloxacin (CIP) cefepime(fep) flomoxef(flx) 抗生素紙綻於瓊脂的表面, 置於 35, 一般培 養箱隔夜培養後判讀, 觀察並測量抑制環的直 徑大小 ( mm ) 21 結果 本研究共計收集 2005 至 2006 年符合院內 Ac-Ab complex 血流感染定義之菌株共 50 株, 經
某醫學中心 Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex 519 表一 :Acinetobacter calcoacetica-acinetobacter baumannii complex 院內血流感染統計表 (n=49) 性別 年齡 病房別 男性 女性 <65 65 一般病房 加護病房 35 14 24 25 38 11 50 60 70 80 90 100 47 11 14 15 3 5 2 13 10 20 35 8 9 7 6 27 29 18 37 38 28 31 36 22 24 21 1 4 25 30 34 17 23 32 19 16 12 26 42 50 43 44 45 41 46 40 48 49 39 圖一 :Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex 院內血流感染菌株脈衝電泳 (PFGE) 分析圖
520 彭銘業詹明錦張峰義 表二 :Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex 院內血流感染抗生素感受性統計表 抗生素感受性 % (N=49) AM CF GM AN SXT CAZ FLX CRO IPM CIP FEP 0.0 0.0 57.1 67.3 49.0 65.3 2.0 4.3 93.9 61.2 59.2 ampicillin(am) cephalothin(cf) gentamicin(gm) amikacin(an) trimethoprim-sulfamethoxazole(sxt) ceftazidime(caz) ceftriaxone(cro) imipenem(ipm) flomoxef(flx) ciprofloxacin(cip) cefepime(fep) 進一步實驗分析時發現編號第 33 號菌株有雜菌汙染故予以剔除, 其餘 49 株細菌之病人性別 年齡與住院病房分布 ( 如表一 ); 以 PFGE 進行分析所得結果 ( 如圖一 ), 資料顯示所收集 49 株院內血流 Ac-Ab complex 感染其分子分型並不相同也並未有明顯關聯性, 其中菌株編號 41 與 46 在圖譜上可見具有 100% 相似度, 進一步分析抗生素敏感性試驗相同, 但是病人分屬不同病房, 編號 41 來自內科加護病房 ( 位於 4 樓 ) 收集時間為 2006 年 9 月 19 日, 編號 46 來自 61 病房 ( 位於 6 樓 ) 收集時間為 2006 年 10 月 22 日, 照顧醫護人員也不相同, 排除直接關聯性, 除此之外, 編號 8 9 及編號 1 4 雖分別具有 90% 以上相似度但其抗生素敏感性並不相同, 由此可見某醫學中心院內血流 Ac-Ab complex 感染並無群聚情形發生或優勢菌株存在, 雖然病人得到院內血流感染可能與病人本身免疫能力及身上管路等諸多因素有關, 醫護人員照顧病人是否嚴格執行感控措施對於減少病人得到院內感染的機會有一定的相關, 由此次研究結果推測經由醫護人員而導致院內血流 Ac-Ab complex 交互感染的機會相對不高, 與該院醫護人員照護病人落實執行院內感染管制措施有關聯 在抗生素敏感試驗方面可以發現 Ac-Ab complex 院內血流感染對抗生素 ampicillin cephalothin ceftriaxone flomoxef 皆呈抗藥性, 但對 ceftazidime cefepime gentamicin amikacin ciprofloxacin 及 trimethoprimsulfamethoxazole 之抗藥性大於四成以上, 對於用來治療院內感染 Ac-Ab complex 最後一線藥物 imipenem 抗藥性則為 6.1%, 如表二 討論 早期利用 Ac-Ab complex 是否於 44 生長來 鑑定 Acinetobacter baumannii, 後來發現即使是 44 仍無法分辨 Acinetobacter baumannii 及 Acinetobacter genomic species 13TU 15, 近年來 Ac-Ab complex 感染已廣泛增加, 尤其對於住院病患所造成的威脅日益嚴重, 多篇文獻報告 Ac-Ab complex 易造成加護中心病患伺機性的感 16,17 染及群突發, 文獻報導醫院中常同時存在多種分子型之 Ac-Ab complex, 都有可能造成院內 18 感染,PFGE 分型法的優點, 即為其單一基因 14 的變異具有解釋的標準,PFGE 分型法具有四種單一的基因變異, 會分別造成 PFGE 型別的微小 (1-3 個 band) 差異, 分別為 :1. 產生限制切割位 (gain of restriction site);2. 失去限制切割位 (loss of restriction site);3. 插入一段 DNA 片段 (insertion of a DNA fragment); 與 4. 刪除一段 DNA 片段 (deletion of a DNA fragment) 此外,PFGE 分型法亦有與流行病學資料結合的四種判定準則 (The criteria for interpreting PFGE patterns):1. 當此菌株之 PFGE 型別與群突發菌株 (outbreak strain) 之 P F G E 型別完全相同時, 則判定為無差異 (indistinguishable), 而應將此菌株歸為群突發菌株 (isolate is part of the outbreak);2. 當此菌株之 PFGE 型別與群突發菌株 (outbreak strain) 之 PFGE 型別相差 2-3 個 bands 時, 則判定為與群突發菌株極相似 (closely related), 而應視此菌株極可能為群突發菌株 (isolate is probably part of the outbreak);3. 當此菌株之 PFGE 型別與群突發菌株 (outbreak strain) 之 PFGE 型別相差 4-6 個 bands 時, 則判定為與群突發菌株可能相似 (possibly related), 而應視此菌株為可能是群突發菌株 (isolate is possibly part of the outbreak);4. 當此菌株之 PFGE 型別與爆發流行菌株 (outbreak strain) 之 PFGE 型別相差
某醫學中心 Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex 521 6 個 bands 以上時, 則判定為與群突發菌株不同 (different), 而應視此菌株不是群突發菌株 (isolate is not part of the outbreak) 因此, 基 因變異的解釋標準與流行病學結合的判讀準則 構成了 PFGE 分型法被廣泛使用的重要因素 此 次研究發現本院 Ac-Ab complex 對 imipenem 抗藥 性比例僅為 6.1%, 與 Landman 等人 1999 年的調查 發現 12%Ac-Ab complex 對所有測試抗生素感受 19 性試驗均呈現抗藥性結果相對要好, 推測與本 院 2 0 0 4 年起即施行一旦發現病患有 A c - A b complex 對所有測試抗生素感受性試驗均呈現抗 藥性的感染或移生時, 為避免接觸感染需嚴格 執行感染管制措施, 病患單獨隔離, 並掛上警 示牌, 提醒醫護人員注意, 進入病室前先洗手 穿隔離衣, 離開病室脫去隔離衣也需確實洗手, 而 2005 年臺北榮總陳孟娟等人亦發表類似之 感染管制措施 20 ; 除此之外, 本院對於二線以上 之抗生素開立需經會診感染專科醫師, 也大大 降低抗生素不適當使用率, 減少抗藥性細菌發 生, 不過臨床上 Ac-Ab complex 對所有測試抗生 素感受性試驗均呈現抗藥性日益增加帶來的治 療窘境已值得大家省思及重視 此次調查發現 Ac-Ab complex 院內血流感染 其基因型並未有集中趨勢亦無優勢菌株存在, 雖然病人得到院內血流感染可能與病人本身免 疫能力與因素很多, 由此次研究結果推測經由 醫護人員而導致院內血流 Ac-Ab complex 交互感 染的機會相對不高, 探討原因應與醫護人員落 實執行感染控制措施及抗生素使用管制的執行 有關, 而在該院洗手設備設置的便利性及數量 可謂充分, 除此之外與感控人員持續在職教育 及感控措施稽核等因素亦有關 誌謝 本研究由三軍總醫院民診研究計畫 ( 計畫 編號 TSGH-C96-56) 經費補助 參考文獻 1.Bergogne-Berezin E, Towner KJ. Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features. Clin Microbiol Rev 1996; 9: 148-65. 2. Wendt C, Dietze B, Dietz E, Rüden H. Survival of Acinetobacter baumannii on dry surfaces. J Clin Microbiol 1997; 35: 1394-7. 3. 嚴小燕 彭銘業 楊美紅 陳依雯 張靜美 張峰義 某醫學中心 Acinetobacter baumannii 院內感染調查 感控雜誌 2001; 11: 216-25. 4. Karlowsky JA, Draghi DC, Jones ME, Thornsberry C, Friedland IR, Sahm DF. Surveillance for antimicrobial susceptibility among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii from hospitalized patients in the United States, 1998 to 2001. Antimicrob Agents Ch 2003; 47: 1681-8. 5. Jain R, Danziger LH. Multidrug-resistant Acinetobacter infections: an emerging challenge to clinicians. Ann Pharmacother 2004; 38: 1449-59. 6. Hsueh PR, Teng LJ, Chen CY, et al. Pandrugresistance Acinetobacter baumannii causing nosocomialinfection in a university hospital, Taiwan. Emerg Infect Dis 2002; 8: 827-32. 7. Landman D, Quale JM, Mavorqa D, et al. Citywide clonal outbreak of multiresistant Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa in Brooklyn, NY: the preantibiotic era has returned. Arch Intern Med 2002; 162: 1515-20. 8. 鄭舒倖 莊意芬 朱芳業 彭成立 某醫院加護病房 Acinetobacter baumannii 群突發調查 感控雜誌 2001; 11: 205-15. 9. Noppe-Leclercq I, Wallet F, Haentjens S, Courcol R, Simonet M. PCR detection of aminoglycoside resistance genes: a rapid molecular typing method for Acinetobacter baumannii. Res Microbiol 1999; 150: 317-22. 10.Villers D, Espaze E, Coste-Burel M, et al. Nosocomial Acinetobacter baumannii infections: microbiological and clinical epidemiology. Ann Intern Med 1998; 129: 182-9. 11.Debast SB, Meis J, Melchers WJ, Hoogkamp-Korstanje JA, Voss Aet. Use of interrepeat PCR ingerprinting to investigate an Acinetobacter baumannii outbreak in an intensive care unit. Scand J Infect Dis 1996; 28: 577-81. 12.Kuo LC, Teng LJ, Yu CJ, Ho SW, Hsueh PR. Dissemination of a clone of unusual phenotype of Pandrug-Resistant Acinetobacter baumanii at a University hospital in Taiwan. J Clin Microbiol 2004; 42: 1759-63. 13.Garner JS, Jarvis WR, Emori TG, Horan TC, Hughes JM. CDC definitions for nosocomial infections,1988. Am J Infect Control 1988; 16: 128-40. 14.Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsedfield gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33: 2233-9. 15.Higgins PG, Wisplinghoff H, Krut O, Seifert H. A PCR-based method to differentiate between Acinetobacter baumannii and Acinetobacter genomic species 13TU. Clin Microbiol Infect 2007: 13: 1199-201. 16. 曾寶慧 蘇玲慧 黃玉成 呂學重 邱月璧 兒科加護病房 Acinetobacter baumannii 院內血流感染群突發的調查及處理 感控雜誌 2002; 12: 1-8
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