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2576 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2018, 38(12) http://lcbl.amegroups.com doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2018.12.008 View this article at: http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2095-6959.2018.12.008 CDK4 与 Ki-67 在非小细胞肺癌中的表达及其意义 尹信 1, 夏靖华 2 2, 王磊 (1. 延安大学咸阳医院放疗科, 陕西咸阳 712000;2. 空军军医大学第二附属医院胸腔外科, 西安 710038) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 CDK4 和 Ki-67 在非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,nsclc) 组织中的表达及其意义 方法 : 收集胸腔外科手术切除的 NSCLC 组织及相应正常肺组织标本 271 例, 应用免疫组织化学法检测 CDK4 和 Ki-67 在 NSCLC 中的表达并进行统计学分析 结果 :CDK4 和 Ki-67 主要表达于细胞核中, 在 NSCLC 腺癌 鳞癌组织中的总阳性表达率高于相应正常组织( 均 P<0.001); 在腺癌 鳞癌组间 CDK4 与 差异均无统计学意义 ; 在分化程度 TNM 分期及淋巴结是否转移组间,CDK4 与 差异显著 ( 均 P<0.01); 且在总 NSCLC 腺癌 鳞癌中 CDK4 与 呈正相关, 相关系数 r 分别是 0.520,0.544,0.501, 均 P<0.001;CDK4 和 强度为 /+ 的 NSCLC 患者较表达强度为 ++/+++ 的 NSCLC 患者中位生存时间长, 差异有统计学意义 ( 分别 P=0.0019, P=0.0227) Cox 单因素回归分析显示分化程度 TNM 分期 淋巴结是否转移及 CDK4 与 Ki-67 的表达是影响 NSCLC 临床预后的因素 ( 均 P<0.01); 而 Cox 多因素回归分析显示 TNM 分期和 是影响 NSCLC 预后的风险因素 ( 分别 P=0.001,P=0.033) 结论:CDK4 的过表达可能与 NSCLC 的发生 发展和转移具有一定的关系, 联合检测 CDK4 与 Ki-67 的表达可能有助于 NSCLC 的早期诊断和预后判断 [ 关键词 ] 非小细胞肺癌 ;CDK4;Ki-67 Expressions and clinical significance of CDK4 and Ki-67 in non-small cell lung cancer patients YIN Xin 1, XIA Jinghua 2, WANG Lei 2 (1. Department of Radiation Oncology, Xianyang Hospital, Yan an University, Xianyang Shaanxi 712000; 2. Department of Thoracic Surgery, Second Affiliated Hospital of Air Force Medical University, Xi an 710038, China) Abstract Objective: To explore the expressions and significances of CDK4 and Ki-67 in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods: We collected 271 cases of surgically resected NSCLC tissues and corresponding normal tissue, which admitted to Department of Thoracic Surgery. The expressions of CDK4 and Ki-67 were detected by immunohistochemistry. The correlation between CDK4 and Ki-67 expressions as well as the clinical significances were analyzed by statistical method. Results: Positive staining of CDK4 and Ki-67 were mainly in nucles. The positive expressions of CDK4 and Ki-67 in NSCLC, adenocarcinoma and squamous cell carcinoma were higher than those in the corresponding normal tissue (all P<0.001). The expressions of CDK4 and Ki-67 were no 收稿日期 (Date of reception):2018 08 24 通信作者 (Corresponding author): 夏靖华,Email: ixiaozhao@163.com; 王磊,Email: tuodi1986@126.com

CDK4 与 Ki-67 在非小细胞肺癌中的表达及其意义尹信, 等 2577 Keywords significant differences respectively between in the groups of adenocarcinoma and squamous cell lung cancer (all P>0.05), but there were significant differences in the groups of grades, clinical stages and lymph node metastasis or not of NSCLC (all P<0.01). The CDK4 expression showed positive correlation with Ki-67 expression in NSCLC, adenocarcinoma and squamous cell carcinoma respectively (r=0.520, 0.544, 0.501, all P<0.001). The patients with ++/+++ expression CDK4 and Ki-67 have shorter survival time compared with those with /+ expression, P=0.0019, P=0.0227 respectively. In univariate analysis, factors including CDK4 and Ki-67 expression, grade of differentiation, TNM stage and lymph node metastasis showed a significantly higher hazard ration for a poor prognosis (all P<0.01). Moreover, in multivariate analysis, the factors including TNM stage and CDK4 expression were independent prognostic factor (P=0.001, P=0.033). Conclusion: The higher expression of CDK4 may be correlate with the occurrence, development, and metastasis of NSCLC. Combined detection of CDK4 and Ki-67 proteins expressions may be valuable for early diagnosis and prognosis of NSCLC. non-small cell lung cancer; CDK4; Ki-67 肺癌是全球致死率最高的恶性肿瘤 [1], 非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,nsclc) 占所有肺癌的 75%~80%, 其 5 年生存率低于 15% [2] CDK4 作为一种细胞周期正向调节因子已被证实是一种癌基因, 在多种常见肿瘤中出现基因扩增和过表达 [3] Ki-67 是与细胞增殖相关的核蛋白, 与肿瘤增殖 侵袭性密切相关 [4] NSCLC 中 CDK4 和 Ki-67 的表达及临床意义的研究相对较少, 本文通过免疫组织化学法检测 NSCLC 组织及相应正常组织中 CDK4 和 Ki-67 蛋白的表达, 并结合临床病理学特征进行分析, 旨在探讨二者在 NSCLC 中的表达及临床意义 1 对象与方法 1.1 对象收集 2006 年 3 月至 2011 年 12 月空军军医大学第二附属医院胸腔外科手术切除的 NSCLC 组织及相应正常肺组织标本 271 例 患者术前均未接受化 放疗及其他抗癌治疗 其中男 204 例, 女 67 例 ; 年龄 36~78( 中位 61) 岁 ; 腺癌 115 例, 鳞癌 156 例 ; 高分化 15 例, 中分化 185 例, 低分化 71 例 ;I 期 69 例,II 期 101 例,III 期 98 例,IV 期 3 例 ; 淋巴结转移 150 例, 淋巴结未转移 121 例 本研究通过空军军医大学第二附属医院医学伦理委员会批准, 患者或其家属均已签署知情同意书 1.2 免疫组织化学法及结果判断 EnVision 二步法免疫组织化学试剂盒购自西安基因公司的 DAKO 产品 CDK4 蛋白抗体为 GeneTex 商品化兔源性抗体,Ki-67 为 Thermo 商品化兔源性 抗体 组织经中性甲醛溶液固定, 脱水 透明 包埋后, 切成 4 μm 厚切片 二甲苯脱蜡, 梯度乙醇水化 ;3 mol/l 尿素消化 ; 柠檬酸缓冲液微波修复, 冷却至室温 ;3%H 2 O 2 溶液阻断内源性过氧化物酶 ;10% 山羊血清封闭 ; 加一抗 4 孵育过夜 ; 37 复温 ; 加二抗,37 恒温反应 ( 除血清封闭外, 其余各步均需用 PBS 漂洗 3 min 3); DAB 显色 苏木精复染,1% 盐酸乙醇分化, 水洗返蓝, 梯度乙醇脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 光镜下观察 用已知阳性表达的组织作为阳性对照, 以 PBS 代替一抗作为空白对照 切片均经 2 位有经验的病理医师采用双盲法阅片, 用阳性细胞染色强度和阳性细胞在癌细胞中的比例来判定染色结果 [5] 染色强度评分: 无显色为 0 分, 浅黄色或黄色为 1 分, 棕黄色为 2 分, 棕褐色为 3 分 以染色细胞的阳性比例评分 <5% 为 0 分, 6%~25% 为 1 分,26%~50% 为 2 分,51%~75% 为 3 分,>75% 为 4 分 上述 2 项积分相乘, 积分 0 分为阴性 ( ),1~4 分为弱阳性 (+),5~8 分为阳性 (++), 9~12 分为强阳性 (+++) 1.3 统计学处理采用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分析 : CDK4,Ki-67 在 NSCLC 组织和正常组织中表达的差异性及在腺癌与鳞癌 淋巴结是否转移组间差异性用 Mann-Whitney U 秩和检验 ; 在组织病理分级 临床 TNM 分期组间表达的差异性用 Kruskal- Wallis H 检验 ; 两蛋白表达的相互关系用 Spearman 秩相关检验, 秩相关系数用 r 表示 ; 应用 GraphPad Prism 分析软件 log-rank(mantel-cox) 检验进行生存分析 P<0.05 为差异有统计学意义

2578 临床与病理杂志, 2018, 38(12) http://lcbl.amegroups.com 2 结果 P<0.01, 表 2) 2.1 CDK4 与 Ki-67 在 NSCLC 组织中的定位及表达 CDK4 与 Ki-67 在 NSCLC 中主要表达于细胞核中 ( 图 1); 在 NSCLC 腺癌 鳞癌组织中 CDK4 的阳性表达率分别为 91.9%(249/271), 89.6%(103/115),93.6%(146/156), 而在相应正常组织中的阳性表达率分别为 15.5%(42/271), 20.0%(23/115), 12.2%(19/156), 癌组织中 明显高于正常组织, 差异均有统计学意义 ( P<0.001); Ki-67 在 NSCLC 腺癌 鳞癌组织中的阳性表达率分别为 95.6%(259/271), 96.5%(111/115),94.9%(148/156), 而在相应正常组织中的阳性表达率分别为 4.8%(13/271), 5.2%(6/115),4.5%(7/156), 差异均有统计学意义 (P<0.001, 表 1) 2.2 CDK4 和 Ki-67 在 NSCLC 临床病理分组中表达的差异性在腺癌 鳞癌组间 CDK4 与 差异无统计学意义 ( P=0.431, P=0.460); 在 NSCLC 分化程度 临床 TNM 分期及淋巴结是否转移组间 CDK4 与 Ki-67 的表达差异性均有统计学意义 ( 均 2.3 CDK4 与 Ki-67 蛋白在 NSCLC 组织中表达的 相关性 经 Spearman 秩相关检验, 在总 NSCLC 腺 癌 鳞癌组织中 CDK4 和 Ki-67 蛋白表达秩相关系数 r 分别是 0.520,0.544,0.501, 均 P<0.001, 即二者 存在正相关 ( 表 3) 2.4 CDK4 和 程度与 NSCLC 患者生存 分析 144 例 强度为 ++/+++ 的 NSCLC 患者, 中位生存时间为 19 个月,127 例 强度为 /+ 的 NSCLC 患者, 中位生存时间为 39 个月,CDK4 表 达强度为 /+ 的 NSCLC 患者较表达强度为 ++/+++ 的 NSCLC 患者的生存时间明显延长, 差异有统计学意 义 (P=0.0019);95 例 强度为 /+ 的 NSCLC 患 者, 中位生存时间为 40 个月,176 例 强度为 ++/+++ 的 NSCLC 患者, 中位生存时间为 21.5 个月, 强度为 /+ 的 NSCLC 患者较表达强度为 /+ 的 NSCLC 患者的生存时间明显延长, 差异有统计学 意义 (P=0.0227);242 例 CDK4 与 Ki-67 同时为阳性的 患者中位生存时间为 24 个月 ( 图 2) A B C 100 μm 100 μm 100 μm D E F 100 μm 100 μm 图 1 CDK4 和 Ki-67 在 NSCLC 中的表达 Figure 1 Expression of CDK4 and Ki-67 in NSCLC (A)CDK4 在腺癌中表达 ;(B)CDK4 在鳞癌中表达 ;(C) 空白对照 ;(D)Ki-67 在腺癌中表达 ;(E)Ki-67 在鳞癌中表达 ;(F) CDK4 在正常组织中未表达 (EnVision,F: 100, 其余为 200) (A) CDK4 expression in adenocarcinoma; (B) CDK4 expression in squamous caner; (C) Negative control; (D) Ki-67 expression in adenocarcinoma; (E) Ki-67 expression in squamous caner; (F) Blank (EnVision, F: 100; the others were 200).

CDK4 与 Ki-67 在非小细胞肺癌中的表达及其意义尹信, 等 2579 表 1 CDK4 和 Ki-67 在肺癌组织和相应正常组织中表达的差异性 Table 1 Difference expressions of CDK4 and Ki-67 in lung cancer and corresponding normal tissue 组织来源 n + ++ +++ 阳性率 /% Z P NSCLC vs 正常肺组织 271 22/229 105/41 130/1 14/0 91.9/15.5 18.237 <0.001 腺癌 vs 正常肺组织 115 12/92 45/22 51/1 7/0 89.6/20.0 11.082 <0.001 鳞癌 vs 正常肺组织 156 10/137 60/19 79/0 7/0 93.6/12.2 14.488 <0.001 组织来源 + ++ +++ 阳性率 /% Z P NSCLC vs 正常肺组织 12/258 83/13 159/0 17/0 95.6/4.8 20.568 <0.001 腺癌 vs 正常肺组织 4/109 40/6 64/0 7/0 96.5/5.2 13.422 <0.001 鳞癌 vs 正常肺组织 8/149 43/7 95/0 10/0 94.9/4.5 15.563 <0.001 表 2 CDK4 和 Ki-67 在 NSCLC 不同分组中表达的差异性 Table 2 Difference expression of CDK4 and Ki-67 in every groups of NSCLC 临床病理特征 n + ++ +++ Z P + ++ +++ Z P 病理类型 0.788 0.431 0.739 0.460 腺癌 115 12 45 51 7 4 40 64 7 鳞癌 156 10 60 79 7 8 43 95 10 分化程度 33.936 <0.001 50.394 <0.001 高 15 4 11 0 0 2 13 0 0 中 185 15 78 88 4 9 65 103 8 低 71 3 16 42 10 1 5 56 9 TNM 分期 16.629 0.001 24.337 <0.001 I 69 10 32 26 4 6 29 31 3 II 101 8 44 43 6 6 36 52 7 III 98 4 29 60 5 0 18 75 5 IV 3 0 0 1 2 0 0 1 2 淋巴结是否转移 3.032 0.002 4.053 <0.001 转移 150 7 53 79 11 5 32 100 13 未转移 121 15 52 51 3 7 51 59 4 2.5 Cox 比例风险回归模型分析影响 NSCLC 临床预后的因素 Cox 比例风险回归模型中分析了 NSCLC 的几个临床病理因素和 CDK4 与 Ki-67 的表达对 NSCLC 临床预后的影响 单因素回归分析显示 : 分化程度 TNM 分期 淋巴结是否转移及 CDK4 与 Ki-67 的表达是影响 NSCLC 临床预后的 因素 ( 均 P<0.01); 对以上影响 NSCLC 预后的因 素进行多因素回归分析, 结果显示 TNM 分期和 是影响 NSCLC 预后的风险因素 ( 分别 P=0.001,P=0.033; 表 4)

2580 临床与病理杂志, 2018, 38(12) http://lcbl.amegroups.com 表 3 CDK4 和 Ki-67 在 NSCLC 腺癌 鳞癌中表达的相关性 Table 3 Correlation of CDK4 expression with Ki-67 expression in NSCLC, lung adenocarcinoma and squamous cell cancer Ki-67 CDK4 NSCLC 腺癌鳞癌 + ++ +++ r P + ++ +++ r P + ++ +++ r P 5 13 4 0 3 6 3 0 2 7 1 0 + 7 59 39 0 1 27 17 0 6 32 22 0 0.631 <0.001 0.615 <0.001 ++ 0 11 113 6 0 7 42 2 0 4 71 4 +++ 0 0 18 3 0 0 2 5 0 0 1 6 0.711 <0.001 Percent survival 100 80 60 40 All patients All patients All patients 100 100 CDK4 与 Ki-67 同时阳性 /+ (n=127) 80 /+ (n=95) 80 表达 (n=242) ++/+++ (n=144) 60 ++/+++(n=176) 60 Percent survival 40 20 20 20 P=0.0019 P=0.0227 0 0 0 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 Months after surgery Months after surgery Months after surgery 图 2 CDK4 及 Ki-67 的表达程度与 NSCLC 患者生存时间的相关性 Figure 2 Expression of CDK4 and Ki-67 relevance to NSCLC patients survival time Percent survival 40 表 4 Cox 比例风险回归模型分析 NSCLC 临床预后的因素 Table 4 Cox proportional hazards model analysis of variables affecting survival in NSCLC patients 变量 单因素分析多因素分析 HR (95% CI) P HR (95% CI) P 性别 ( 男 / 女 ) 0.922 (0.667 1.274) 0.622 年龄 ( 61 岁 />61 岁 ) 0.901 (0.681 1.192) 0.465 组织学类型 ( 腺癌 / 鳞癌 ) 0.994 (0.749 1.319) 0.965 分化程度 ( 高 - 中 / 低 ) 0.567 (0.416 0.771) <0.001 0.744 (0.537 1.031) 0.076 TNM 分期 (I~II/III~IV) 0.424 (0.319 0.564) <0.001 0.564 (0.397 0.802) 0.001 淋巴转移 ( 是 / 否 ) 1.991 (1.485 2.669) <0.001 1.399 (0.981 1.995) 0.064 ( ~+/++~+++) 0.662 (0.490 0.895) 0.007 1.150 (0.774 1.706) 0.489 ( ~+/++~+++) 0.599 (0.449 0.799) <0.001 0.674 (0.468 0.969) 0.033 3 讨论 NSCLC 的发生发展涉及多种分子机制, 其中 细胞周期紊乱是引发 NSCLC 发生的重要因素 [6] CDK4 是细胞周期 G 1 期的正调控因子 [7], 它与细 胞周期素 (cyclin D) 结合, 形成 CDK-cyclin D 复合 物, 促进细胞周期从 G 1 期进入 S 期 [8] CDK4 在多种肿瘤中表达失调 [9], 其异常表达可促进肿瘤的发展 [10] 本研究结果显示:CDK4 蛋白主要表达于细胞核内, 在 NSCLC 组织中的表达水平高于正常肺组织中的表达水平 在肺癌细胞系 A549 中抑制 可引起细胞周期阻滞, 抑制肿瘤细胞增

CDK4 与 Ki-67 在非小细胞肺癌中的表达及其意义尹信, 等 2581 殖 [11], 说明 CDK4 的高表达可能会促进 NSCLC 细 胞的增殖, 提示 CDK4 过表达可能对 NSCLC 的发 生 发展具有促进作用 CDK4 的表达在腺癌 鳞 癌组间无差异性, 说明 与 NSCLC 病理类 型不相关 ; 在分化程度 TNM 分期及淋巴结是否 转移组间差异有统计学意义, 即 与上述 NSCLC 的临床病理特点相关,水平高, NSCLC 分化程度低 TNM 分期高 淋巴结转移, 提示 CDK4 的过表达可能会加速细胞增殖, 从而促 进 NSCLC 病程进展, 使肿瘤恶性程度增高, 侵袭 和转移能力增强 Ki-67 分布于细胞核内, 属于 IgG 家族, 是一 种可能与细胞周期蛋白密切相关的核增殖标志基 因, 能可靠而迅速反映恶性肿瘤的增殖, 通常 作为肿瘤细胞增殖的标志物 [12-13] [14] 研究表明 : 水平与肿瘤恶性程度基本一致, 随着恶 性程度的发展而增高, 与恶性肿瘤的发展 转移 和预后高度相关 本研究结果显示 : 在 NSCLC 组 织中 Ki-67 主要表达于细胞核, 其在癌组织中的表 达明显高于相应正常组织, 呈过表达状态 ; 在腺 癌与鳞癌组间,差异无统计学意义 ; 在 分化程度 TNM 分期及淋巴结是否转移组间, 差异有统计学意义, 即 高低与 NSCLC 的分化程度 TNM 分期及淋巴转移有关 NSCLC 分化程度低,TNM 分期高, 淋巴结转移 时,程度高, 即 与 NSCLC 分化 程度呈负相关, 与 TNM 分期呈正相关, 提示 Ki-67 的高表达与 NSCLC 细胞增殖活跃 侵袭性强 易 发生转移 预后不良等特点相关 因此,Ki-67 能 客观反映 NSCLC 的增殖活性, 可作为评价 NSCLC 发生 发展的重要指标之一 本研究发现 :CDK4 和 Ki-67 在总 NSCLC 腺癌和鳞癌组织中的表达 进行相关性分析, 二者表达的秩相关系数 r 分别为 0.520,0.544,0.501( 均 P<0.001), 即存在正相关 性, 进一步说明 CDK4 过表达可能促进 NSCLC 细胞 增殖,可作为评价 NSCLC 发生发展进程 的指标 生存分析结果显示 :CDK4 和 强 度为 /+ 的 NSCLC 患者中位生存期较表达强度为 ++/+++ 的患者明显延长, 差异有统计学意义 提 示 CDK4 过表达可能降低 NSCLC 肺癌患者的生存 期, 很可能是 NSCLC 发生发展的风险因子 Cox 比例风险回归分析显示 是影响 NSCLC 预 后的风险因子, 说明 能促进 NSCLC 发生 发展 综上所述,CDK4 在 NSCLC 中的过表达可促进 NSCLC 的发生发展, 降低 NSCLC 肺癌患者的生存期, 联合监测 CDK4 和 Ki-67 的表达, 对评价 NSCLC 的发生发展有一定的临床价值 参考文献 1. Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[ J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2): 87-108. 2. Torre LA, Siegel RL, Jemal A. Lung cancer statistics[ J]. Adv Exp Med Biol, 2016, 893: 1-19. 3. 陈衍, 麦春平, 姚开泰, 等. CDK4 mrna 在鼻咽癌的表达及临床意义 [ J]. 广东药学院学报, 2013, 29(1): 89-92. CHEN Yan, MAI Chunping, YAO Kaitai, et al. Correlation of CDK4 mrna expression with the clinicopathologic feature of nasopharyngeal carcinoma[ J]. Academic Journal of Guangdong College of Pharmacy, 2013, 29(1): 89-92. 4. Tan QX, Qin QH, Yang WP, et al. Prognostic value of Ki-67 expression in HR-negative breast cancer before and after neoadjuvant chemotherapy[ J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(10): 6862-6870. 5. Yang G, Wang XJ, Huang LJ, et al. Hi ABCG4 expression is associated with poor prognosis in non-small-cell lung cancer patients treated with cisplatin-based chemotherapy[ J]. PLoS One, 2015, 10(8): e0135576. 6. Papay J, Krenacs T, Moldyay J, et al. Immunophenotypic profiling of nonsmall cell lung cancer progression using the tissue microarray approach[ J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2007, 15(1): 19-30. 7. Wu A, Wu B, Guo J, et al. Elevated expression of CDK4 in lung cancer[ J]. J Transl Med, 2011, 9(38): 1-9. 8. Lu D, Wu Y, Wang Y, et al. CREPT accelerates tumorigenesis by regulating the transcription of cell-cycle- related genes[ J]. Cancer Cell, 2012, 21(1): 92-104. 9. Chen TJ, Lee SW, Lin LC, et al. Cyclin-dependent kinase 4 overexpression is mostly independent of gene amplification and constitutes an independent prognosticator for nasopharyngeal carcinoma[ J]. Tumour Biol, 2014, 35(7): 7209-7216. 10. 宋吉, 李玛琳. CyclinD1 P16 及 CDK4 基因与胃癌相关性的研究进展 [ J]. 昆明医科大学学报, 2013, 34(10): 148-151. SONG Ji, LI Malin. Research progression of CyclinD1, P16 and CDK4 in gastric cancer[ J]. Journal of Kunming Medical University, 2013, 34(10): 148-151. 11. 贾文芝, 赵小平, 赵丽, 等. CDK4 基因沉默对非小细胞肺癌 A549 增殖和代谢的影响 [ J]. 现代生物医学进展, 2016, 16(24): 4609-4614. JIA Wenzhi, ZHAO Xiaoping, ZHAO Li, et al. The effects of CDK4

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