DNA 甲基化处理及测定 前言实验材料一 实验材料二 主要设备仪器实验方法一 基因组 DNA 准备 ( 天根血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 提取试剂盒 ) 二 基因组 DNA bisulfite 处理 (zymo research,ez DNA Methylation- Gold Kit) 三 PCR 扩增 (PCR amplification) 四 PCR 产物纯化 ( 天根, 普通 DNA 产物纯化试剂盒 ) 五 焦磷酸测序 Pyrosequencing 1
前言 重亚硫酸盐使 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变, 用 PCR 扩增 ( 引物设计时尽量避免有 CpG, 以免受甲基化因素的影响 ) 所需片段, 则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶 最后, 对 PCR 产物进行测序, 并且与未经处理的序列比较, 判断是否 CpG 位点发生甲基化 是一种可靠性及精确度很高的方法, 能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态 在寻找有意义的关键性 CpG 位点上, 有其他方法无法比拟的优点 实验材料 1. 实验材料 1) 细胞基因组 ; 2) EZ DNA Methylation-Gold Kit; 3) KAPA DNA 聚合酶 ; 4) DNA 产物纯化试剂盒 ; 2. 实验仪器 1)PCR 仪 ; 2) 离心机 ; 3) 移液器 ; 4) 琼脂糖凝胶电泳仪 ; 实验方法 一 基因组 DNA 准备 ( 天根血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 提取试剂盒 ) 操作步骤 : 使用前请先在缓冲液 GD 和漂洗液 PW 中加入无水乙醇, 加入体积请参照瓶上的标签 1. 处理材料 a) 如提取材料为血液, 可直接使用 200 μl 新鲜 冷冻或加入各种抗凝剂的 2
血液, 不足 200 μl 可加缓冲液 GA 补足 ; 注意 : 如需处理更大体积血液, 如 300 μl-1 ml, 应按以下步骤操作 : 在样品中加入 3 倍体积红细胞裂解液 ( 例如,300 μl 血液加入 900 μl 红细胞裂解液 ), 颠倒混匀, 室温放置 5 min, 期间再颠倒混匀几次 10000 rpm(~11,500 g) 离心 1 min( 若离心机最高转速不允许, 可 3000 rpm(~3,400 g) 离心 5 min), 吸去上清, 留下白细胞沉淀, 加 200 μl 缓冲液 GA, 振荡至彻底混匀 b) 如果处理血样为禽类 鸟类 两栖类或更低级生物的抗凝血液, 其红细胞为有核细胞, 因此处理量 5-20 μl, 可加缓冲液 GA 补足 200 μl 后进行下面的裂解步骤 c) 贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液, 然后 10,000 rpm(~11,200 g) 离心 1 min, 倒尽上清, 加 200 μl 缓冲液 GA, 振荡至彻底悬浮 ; d) 动物组织 ( 脾组织用量应少 10 mg) 应先打碎处理为细胞悬液, 然后 10,000 rpm(~11,200 g) 离心 1 min, 倒尽上清, 加 200 μl 缓冲液 GA, 振荡至彻底悬浮 注意 : 如果需要去除 RNA, 可加入 4 μl RNaseA(100 mg/ml) 溶液, 振荡 15 sec, 室温放置 5 min 2. 加入 20 μl Proteinase K 溶液, 混匀 a. 提取血液基因组时, 只需加入 Proteinase K 混匀, 即可继续进行下一步 b. 提取细胞基因组时, 只需加入 Proteinase K 混匀, 即可继续进行下一步 c. 提取组织基因组时, 加入 Proteinase K 混匀后, 在 56 放置, 直至组织溶解, 简短离心以去除管盖内壁的水珠, 再进行下一步骤 注意 : 不同组织裂解时间不同, 通常需 1-3 h 即可完成 ( 鼠尾需要消化过夜 ) 不会影响后续操作 每小时颠倒混合样品 2-3 次, 用水浴振荡器也可 3. 加入 200 μl 缓冲液 GB, 充分颠倒混匀,70 放置 10 min, 溶液应变清亮, 简短离心以去除管盖内壁的水珠 注意 : 加入缓冲液 GB 时可能会产生白色沉淀, 一般 70 放置时会消失, 不会影响 3
后续实验 如溶液未变清亮, 说明细胞裂解不彻底, 可能导致提取 DNA 量少和提取出的 DNA 不纯 当血液体积 200 μl 且没有采用红细胞裂解处理, 或是样本储存条件不佳, 水浴后颜色可能为深褐色, 注意溶液中没有团块等沉淀 4. 加人 200 μl 无水乙醇, 充分振荡混匀 15 sec, 此时可能会出现絮状沉淀, 简短离心以去除管盖内壁的水珠 5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中 ( 吸附柱放入收集管中 ),12,000 rpm (~13,400 g) 离心 30 sec, 倒掉废液, 将吸附柱 CB3 放回收集管中 6. 向吸附柱 CB3 中加入 500 μl 缓冲液 GD ( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇 ),12,000rpm (~13,400 g) 离心 30 sec, 倒掉废液, 将吸附柱 CB3 放入收集管中 7. 向吸附柱 CB3 中加入 600 μl 漂洗液 PW( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇 ),12,000 rpm (~13,400 g) 离心 30 sec, 倒掉废液, 将吸附柱 CB3 放入收集管中 8. 重复操作步骤 7 9. 将吸附柱 CB3 放回收集管中,12,000 rpm(~13,400 g) 离心 2 min, 倒掉废液 将吸附柱 CB3 置于室温放置数分钟, 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液 注意 : 这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除, 漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应 ( 酶切 PCR 等 ) 实验 10. 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中, 向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200 μl 洗脱缓冲液 TE, 室温放置 2-5 min,12,000 rpm (~13,400 g) 离心 2 min, 将溶液收集到离心管中 注意 : 洗脱缓冲液体积不应少于 50 μl, 体积过小影响回收效率 洗脱液的 ph 值对于洗脱效率有很大影响 若用 ddh 2 O 做洗脱液应保证其 ph 值在 7.0-8.5 范围内,pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率 ; 且 DNA 产物应保存在 -20, 以防 DNA 降解 为增加基因组 DNA 的得率, 可将离心得到的溶液再加入吸附柱 CB3 中, 室温放置 2 min,12,000 rpm(~13,400 g ) 离心 2 min 二 基因组 DNA bisulfite 处理 (zymo research,ez DNA Methylation-Gold 4
Kit) 1. 在盛有 20ulDNA 样品的小管中加入 130ul CT 转换试剂 (CT Conversion Reagent) ( 如果 DNA 样品不足 20ul, 用 ddh2o 补足 ) 混匀, 瞬离 2. 将瞬离后的样品放入 PCR 仪, 设定反应程序如下 : 1) 98,10min; 2) 64,2.5h; 3) 4, ; 注意 : 对于某些特殊样品, 设定与上不同的参数亦有良好效果 ( 见附录 ); 如果你在使用本试剂盒时已采用与上不同的其他程序, 且已取得良好效果, 可以继续使用已用程序 3. 将 Zymo 柱 ( Zymo-Spin(TM)IC Column) 放入收集管 (Collection Tube) 中, 在其中加入 600ul M- 结合液 (M-Binding Buffer); 4. 在其中加入步骤 2 反应后的样品, 盖紧, 颠倒混匀 ; 5. 12,000rpm(<10,000g) 离心 30s, 弃下清 ; 6. 加入 100ul M- 清洗液 (M-Wash Buffer),12,000rpm 离心 30s, 弃下清 ; 7. 加入 200ul M- 脱磺化液 (M-Desulphonation Buffer), 室温 (20~30 ) 静置 15~20min,12,000rpm 离心 30s, 弃下清 ; 8. 加入 200ul M- 清洗液 (M-Wash Buffer),12,000rpm 离心 30s, 弃下清 ; 重复清洗一次 ; 9. 将柱子移入干净的 1.5ml EP 管中, 在柱子底部加入 10ul M- 溶解液 (M- Elution Buffer),12,000rpm 离心 30s 洗脱 DNA; 10. 收集的 DNA 可以直接进行后续实验也可以短期保存于 -20 ; 如果需要长期保存, 应保存于低于 -70 处 ; 进行后续 PCR 反应时, 我们建议每个反应用 1~4ul 溶解的 DNA, 但是, 如果需要可以每个反应用 10ul; 溶解体积根据后续实验需要可以 <10ul, 但是较小的溶解体积会使收集的 DNA 浓度升高 注意 : 括号内黑体字为试剂盒中试剂英文名称! 三 PCR 扩增 (PCR amplification) 5
Round 1: ( 外围引物 ) 体系 :2x KAPA mix DNA Primer F Primer R H2O 10ul 1ul 0.5ul 0.5ul up to 20ul 反应条件 : 98 30s 98 10s 52 30s 30cycle 72 45s 72 3min Round 2: ( 内围引物 ) 体系 :2x KAPA mix DNA Primer F Primer R H2O 10ul 1ul 0.5ul 0.5ul up to 20ul 反应条件 : 98 30s 98 10s 52 30s 30cycle 72 45s 72 3min 注意 : 由于后续实验需要较多的 DNA 模板, 可根据需要扩大 PCR 体系 四 PCR 产物纯化 ( 天根, 普通 DNA 产物纯化试剂盒 ) 1. 柱平衡步骤 : 向吸附柱 CB2 中 ( 吸附柱放入收集管中 ) 加入 500 μl 的平衡 6
液 BL,12,000 rpm(~13,400 g ) 离心 1 min, 倒掉收集管中的废液, 将吸附柱 CB2 重新放回收集管中 ( 请使用当天处理过的柱子 ); 2. 估计 PCR 反应液或酶切反应液的体积, 向其中加入 5 倍体积的结合液 PB, 充分混匀 ( 无需去除石蜡油或矿物油 ) 注意 : 如 PCR 反应体系为 50 μl( 不包括石蜡油体积 ), 则加入 250 μl 结合液 PB 3. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱 CB2 中 ( 吸附柱放入收集管中 ), 室温放置 2 min,12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 30-60 sec, 倒掉收集管中的废液, 将吸附柱 CB2 放入收集管中 注意 : 吸附柱容积为 800 μl, 若样品体积大于 800 μl 可分批加入 4. 向吸附柱 CB2 中加入 600 μl 漂洗液 PW( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇 ),12,000 rpm(~13,400 g ) 离心 30-60 sec, 倒掉收集管中的废液, 将吸附柱 CB2 放入收集管中 注意 : 如果纯化的 DNA 是用于盐敏感的实验, 例如平末端连接实验或直接测序, 建议 PW 加入后静置 2-5 min 再离心 5. 重复操作步骤 4 6. 将吸附柱 CB2 放回收集管中,12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 2 min, 尽量除去漂洗液 将吸附柱 CB2 置于室温放置数分钟, 彻底地晾干, 以防止残留的漂洗液影响下一步的实验 注意 : 漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应 ( 酶切 PCR 等 ) 实验 7. 将吸附柱 CB2 放入一个干净的离心管中, 向吸附膜中间位置悬空滴加 30-50 μl 洗脱缓冲液 EB, 室温放置 2 min 12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 2 min 收集 DNA 溶液 注意 : 洗脱液的体积不应少于 30 μl, 体积过少会影响回收的效率 洗脱液的 ph 值对于洗脱效率有很大影响 若后续做测序, 需使用 ddh 2 O 做洗脱液, 并保证其 ph 值在 7.0-8.5 范围内,pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率 ; 且 DNA 产物应保存在 -20, 以防 DNA 降解 DNA 也可以用缓冲液 (10 mm Tris-Cl, ph8.0) 洗脱 为了提高 DNA 的回收量, 可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中, 室温放置 2 min,12,000 rpm(~13,400 g) 离心 2 min, 将 DNA 溶液收集到离心管中 7
五 焦磷酸测序 Pyrosequencing PCR 产物用 QIAGEN 的焦磷酸测序仪 (PyroMark Q96ID) 进行测序, 获得该 基因的甲基化程度数据 8