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漂铜通
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1 第 32 卷第 12 期 Vol.32, No 年 12 月 Dec 临床研究生殖与避孕 Reproduction & Contraception 卵胞质内单精子显微注射后异常受精的影响因素分析张媛媛向卉芬谢鑫章师平周平 ( 安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心, 合肥, ) 摘要目的: 探讨卵胞质内单精子显微注射 (ICSI) 后异常受精发生的影响因素方法 : 回顾性分析 299 个 ICSI 周期, 按照是否有异常受精分为异常受精组 (n=118) 和正常对照组 (n=181), 异常受精组至少发生 1 个非 2 原核 (2N) 的受精卵比较分析异常受精组和对照组临床和实验室资料结果 : 异常受精组 hcg 注射日 E2 水平 ( ± pmol/l) 高于对照组 ( ± pmol/l), 差异有统计学意义 (<0.05); 异常受精组获卵数及成熟卵数分别为 17.8 ± 7.2 个 15.3 ± 6.1 个, 多于对照组的 13.6 ± 7.0 个 10.2 ± 5.3 个, 差异均有统计学意义 (<0.01); 卵子成熟率 (81.7% vs 76.4%) 2N 受精率 (78.4% vs 86.9%), 组间比较差异均有统计学意义 (<0.01); 而患者年龄基础激素水平促性腺激素 (Gn) 使用总量精子来源及质量着床率临床妊娠率组间比较, 差异均无统计学意义 (>0.05) 结论: 卵巢对 Gn 刺激的高反应性可能与 ICSI 后异常受精的发生有关异常受精卵的发生虽对临床结局无明显影响, 但减少异常受精发生率, 增加卵子利用率, 可能会提高累积妊娠率关键词 : 卵胞质内单精子显微注射 (ICSI); 异常受精 ; 合子中图分类号 : R321 文献标识码 : A 文章编号 : X(2012) 上世纪 90 年代卵胞质内单精子显微注射技术 (ICSI) 成功地运用于治疗不育症, 成为治疗某些不育症的主要方法之一 ICSI 是将单个精子直接注入成熟卵母细胞胞质内的技术, 大大提高了体外授精的受精率, 但仍有异常受精发生, 其异常受精发生的原因目前存在较大的争议本研究回顾性分析本院生殖中心的 ICSI 周期, 探讨异常受精发生的相关因素及对临床结局的影响 1 资料与方法 1.1 资料来源回顾性分析 ~ 期间在我院生殖中心行 ICSI 治疗的 299 个周期的临床和实验室资料通讯作者 : 周平 ; Tel: ; zhoup_325@yahoo.com.cn ( 不包括补救 ICSI), 按照是否有异常受精的受精卵分为异常受精组 (n=118) 和对照组 (n=181), 其中异常受精组至少发生 1 个非 2 原核 (2N) 的受精卵异常受精组内按照异常受精率的高低分为 A 组 ( 异常受精率 10%, n=62) 和 B 组 ( 异常受精率 >10%, n=56); 正常对照组的受精卵均为 2N 受精卵 1.2 方法控制性超促排卵 (COH) 方法 COH 按照本中心常规方法进行, 1 短方案 : 月经第 2~3 日肌肉注射达菲林 ( 益普生制药有限公司 ) 进行垂体降调节, 第 5 日肌肉注射促性腺激素 (Gn) 促排卵, Gn 包括 hmg ( 珠海丽珠公司 ) 和 FSH( 默克雪兰诺有限公司 ), 阴道 B 超监测卵泡及卵巢大小, 当有 2 个以上优势卵泡 ( 直径 18 mm) 时, 肌肉注射 hcg( 珠海丽珠公司 ) IU, 注射 hcg 后 34~36 h 阴道 B 超引导下穿刺取卵 ; 2 长方案 : 黄体中期肌注达菲林降调节, 14 d 后或月

2 经第 3 日肌肉注射 Gn 促排卵, 其他同短方案 ICSI 方法卵母细胞经透明质酸酶 (Sigma 公司 ) 消化后机械剥离卵丘和放射冠颗粒细胞, 成熟卵母细胞行 ICSI, 14~18 h 后观察 N 数目, 更换培养液取卵后第 2 日或第 3 日行胚胎移植, 移植后注射 hcg 或 ( 和 ) 黄体酮 ( 浙江仙居制药有限公司 ) 进行黄体支持临床资料收集女方年龄不孕类型不孕年限不孕因素 ( 包括男方因素, 非男方因素 ) 基础血清黄体生成素 (blh) 基础卵泡刺激素 (bfsh) 基础雌二醇(bE2), 促排卵方案 Gn 使用天数 Gn 使用总量 hcg 注射日 E 2 LH 孕酮 () 水平获卵数成熟卵数精子来源 ( 精液精子睾丸 / 附睾精子 ) 精液质量受精情况优质胚胎率移植胚胎数临床妊娠数孕囊数等资料进行比较分析检测指标及计算卵子成熟率 = 成熟卵数 / 获卵数 100%; 异常受精率 =(1N+3N+ 3N) 受精卵数 / 成熟卵数 100%; 正常受精率 =2N 受精卵数 / 成熟卵数 100%; 胚胎质量评估参考文献 [1], 总评分 9~10 分为优质胚胎 ; 优质胚胎率 = 优质胚胎数 / 2N 受精卵数 100%; 种植率 = 孕囊数 / 移植胚胎数 100%; 移植 14 d 测尿 hcg, 阳性者为生化妊娠 ; 移植 35 d 行阴道超声检查, 见孕囊为临床妊娠, 临床妊娠率 = 临床妊娠数 /ICSI 总例数 100% 1.3 统计学处理采用 SSS13.0 软件进行统计分析, 计量资料结果以均数 ± 标准差 (x - ±s) 表示, 采用 t 检验计数资料以百分数 (%) 表示, 采用 χ 2 检验 ; <0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 异常受精组和对照组临床资料比较 299 个 ICSI 周期共获卵枚, 成熟卵枚异常受精组 118 个 ICSI 周期共获卵个, 成熟卵个, 平均每周期获卵 17.8 ± 7.2 个, 获成熟卵 15.3 ± 6.1 个 ICSI 后共 179 个卵发生异常受精 : 140 个 1N, 32 个 3N, 7 个 >3N(3 个 4N, 2 个 6N, 2 个 8N) 5.0%(179/3 601) 的 ICSI 卵发生异常受精异常受精组 hcg 注射日 E2 水平高于对照组, 差异有统计学意义 (<0.05); 异常受精组获卵数成熟卵数卵子成熟率均高于对照组, 差异有统计学意义 (<0.01); 患者的年龄不孕年限不孕类型促排卵方案 blh 水平 bfsh 水平 E 2 水平 Gn 使用天数 Gn 使用总量 hcg 注射日 LH 水平水平精子来源及质量组间比较, 差异均无统计学意义 (>0.05), 详见表 1 和表 2 表 1 异常受精组和对照组临床计数资料比较 Table 1 Comparison of clinical qualitative data in abnormal fertilized group and control group 指标总例数异常受精组 Abnormal fertilized group 对照组 Control group Index Total n % n % 不孕类型 Infertility type χ 2 原发 rimary 继发 Secondary 不孕因素 Infertility factor 男方 Male 其他 Other 促排卵方案 Ovulation induction 长方案 Long protocol 短方案 Short protocol 精子来源 Sperm source 精液 Semen 睾丸 / 附睾 Testis/Epididymis 精子质量 Sperm quality 正常 Normal 异常 Abnormal

3 表 2 异常受精组和对照组临床资料比较 (x - ±s) Table 2 Comparison of clinical data in abnormal fertiized group and control group 指标异常受精组对照组 Index Abnormal group Control group 总例数 Total 年龄 ( 岁 ) Age (year) 31 ± 5 30 ± 不孕年限 ( 年 ) 6 ± 4 5 ± Infertility duration (a) bfsh(u/l) 6.8 ± ± be2(pmol/l) ± ± blh(u/l) 5.6 ± ± Gn 使用天数 (d) 12 ± 2 12 ± Gn used days Gn 使用总量 (U) ± ± Gn dose hcg 注射日 hcg injection day E2 (pmol/l) ± ± <0.05 LH (U/L) 1.4 ± ± (nmol/l) 3.6 ± ± 获卵数 17.8 ± ± 7.0 <0.01 No. of oocytes retrieved 成熟卵数 15.3 ± ± 5.3 <0.01 No. of maturing oocytes retrieved 2.2 患者的相关资料及临床结局异常受精组中 2N 受精率低于对照组, 差异有统计学意义 (<0.01); 优质胚胎率着床率临床妊娠率组间比较, 差异无统计学意义 (>0.05), 详见表异常受精组内资料的分析 B 组 hcg 注射日 E2 水平获卵数及获成熟卵数均略高于 A 组, 但差异无统计学意义 (>0.05), 详见表 4 3 讨论 ICSI 周期中异常受精的发生与卵母细胞精子及 ICSI 操作技术有关在有活动精子及成熟的 ICSI 操作技术情况下, 卵母细胞质量是决定受精成败的最关键因素, 任何影响卵母细胞质量的因素都会 [2] 影响其受精情况本研究结果显示异常受精组 hcg 注射日 E2 水平高获卵数多成熟卵子数多卵子成熟率高, 这表明卵巢对 Gn 刺激的反应性高可能与异常受精发生有关外源性的 Gn 促排卵可导表 3 异常受精组和对照组实验室资料及妊娠结局比较 Table 3 Comparison of laboratory data, pregnancy outcomes between abnormal fertilized group and control group 指标异常受精组对照组 Index Abnormal fertilized group Control group 总例数 Total 成熟卵率 (%) 81.7 (1 718/2 103) 76.4 (1 883/2 464) <0.01 Maturing oocyte rate 正常受精率 (%) 78.4 (1 347/1 718) 86.9 (1 637/1 883) <0.01 Normal fertilization rate 优质胚胎率 (%) 53.8 (725/1 347) 53.7 (879/1 637) High-quality embryo rate 着床率 (%) 17.7 (51/289) 15.4 (64/416) Implantation rate 临床妊娠率 (%) 36.4 (43/118) 34.8 (63/181) Clinical pregnancy rate 表 4 异常受精组内资料的分析 (x - ±s) Table 4 Analyse clinical quantitative data in abnormal fertilized group 指标 A 组 B 组 Index Group A Group B 总例数 Total hcg 注射日 E ± ± E2 levels on hcg injection day (pmol/l) 获卵数 17.3 ± ± No.of oocytes reterieved 成熟卵数 14.4 ± ± No.of maturing oocytes reterieved 致卵母细胞代谢异常 AT 含量下降转录异常不同步的核 / 质成熟微管混乱卵原性多倍体形 [3] 成卵巢对 Gn 刺激的反应高可能加重了卵母细胞这些异常的发生, 最终导致异常受精的发生那么在临床工作中如果卵巢发生了这种高反应性, 导致受精失败, 可以试行小剂量长时间的 Gn 刺激, 以期获得发育较好的卵母细胞来改善受精情况 A 组和 B 组的 hcg 注射日 E2 水平获卵数及获成熟卵率均无统计学差异, 这表明卵巢对 Gn 刺激的反应并未随着异常受精率的升高而继续增高, 所以异常受精的发生不能用高反应性完全解释, 即高反应性可能只是导致异常受精的原因之一, 并且不是最主要的原因尽管如此, 但在还没有找到最主要原因的情况下, 上述方法仍值得一试与对照组相比, 异常受精组 2N 受精率低 (<0.05), 而优质胚胎率种植率 -816-

4 临床妊娠率组间无统计学差异这表明异常受精的发生并不代表较差的妊娠结局但 Figueira 等报 [4] 道, 当 3N 率 25% 时, 妊娠结局不受影响 ; 3N 率 >25% 时, 其结局将大大受损 Dayal 等的研究 [5] 结果与 Figueira 等的一致 3.1 1N 的发生本研究显示 ICSI 后 1N 发生率约为 3.9%(140/ 3 601), 周期发生率约为 34.1%(102/299) ICSI 周期中 1N 有部分为具有雌原核和雄原核的二倍体受精卵, 其可能机制有 : 1 雌雄原核发育速度不同步, 在观察原核数目的时间内只观察到一个发育较快的原核, 而另一个原核还未形成 ; 22 个原核过早融合, 或在未形成原核膜前 2 个原核就已融合了, 这样融合的单个原核可能要大些只有雌原核的 1N 发生因素有 : 1 精子头去凝缩障碍以及不成熟精子染色体凝 [6] 缩, 导致雄原核形成障碍 ; 2 机械刺激所致的孤雌激活只有雄原核的 1N 可能是由于 ICSI 注射破坏了减数分裂纺锤体, 导致第二极体 (b2) 排出障碍最终导致雌性原核形成障碍 ; 卵母细胞激活障碍, 纺锤体及星状体缺陷也是不能形成雌原核因素之一 3.2 3N 的发生本研究显示 ICSI 后 3N 发生率约为 0.9%(32/ 3 601), 周期发生率约为 8.7%(26/299) ICSI 周期中 3N 的发生与卵母细胞精子及 ICSI 操作技术有关二倍体卵子和单倍体精子受精是 3N 发生的重要原因, 一般这样的卵子体积较大也可能是由 [7] 于 b2 未正常排出, 其可能的形式有 : 1 b2 排出障碍 ; 2 排出的 b2 不含有染色体, 即排出的为空极体 ; 3 排出的 b2 不含有全部 23 条染色体, 其余染色 [8] 体被核膜包裹形成独立的原核其可能的原因有 : 1 ICSI 操作时损伤了赤道板, 使分裂中期的细胞受损 ; 2 大量促排卵药物可能使卵母细胞纺锤体发生异常重组, 从而引起染色体异常 ; 3 ICSI 操作时卵母细胞骨架的破坏可能造成第二次减数分裂纺锤体的错误定位 ; 4 卵巢对药物的反应相对较高 ( 获卵数多 hcg 注射日血清 E2 水平高 ), 这一点与本研究结果相一致二倍体精子受精也是 3N 发生的原因之一, 尽管 ICSI 周期不会发生多精受精, 但对于严重少弱精子症患者, 其二倍体发生率远高于正常精液精子而这样的双倍体精子受精后将形成 3 个 N, 当然也有部分表现为正常的核型 (2N), 但其本质仍是三倍体, 最终将形成三倍体胚胎, 且往往以早期流产告终单倍体卵子和单倍体精子受精也可发生 3N 用 FISH 技术检测 ICSI 受精卵, Grossmann 等研究 [9] 显示, 36% 的 3N 受精卵实为二倍体受精卵, 颜军 [10] 昊等观察到, 约 25% 的 3N 受精卵实为二倍体受精卵因为 3N 中 1 个原核为单倍体, 而另外 2 个 N 的染色体加在一起为单倍体, 这提示可能是 1 个母源原核的染色体在第二次减数分裂后期发生了分 [11,12] 离, 由核膜包裹后形成 2 个原核另一种可能的机制是雌原核发生核内复制, 即受精后雌性原核发 [13] 生核内复制, 形成 2 个染色质一样的原核 3.3 >3N 的发生本研究资料显示 299 个 ICSI 周期共出现 3 例 (7 个 )>3N 的受精卵, 其中 1 例发生 1 个 4N 受精卵, 2 个 6N 受精卵, 2 个 8N 受精卵 ; 其他 2 例均发生 1 个 4N >3N 合子发生率约为 0.2%(7/3 601), 周期发生率约为 1%(3/299) 张文红等将 ICSI 来源的 [14] 2 个 4N 受精卵培养到囊胚阶段, 对囊胚细胞进行 DNA 短串联重复序列基因座多态性分析, 结果显示 [15] 它们均为二倍体核型有学者曾报道, 1 例多原核受精患者, 第 1 周期夫精 ICSI 后受精卵全部为多原核, 第 2 周期供精 ICSI 后受精卵仍全部为多原核供精排除了精子因素, 可以认为卵母细胞异常 [3] 是多原核出现的最主要因素有研究认为, 多原核形成与卵母细胞纺锤体微管缺陷有关, 如纺锤体不能结合到染色体着丝粒而导致染色体偏离赤道板, 这些分离的染色体片段, 被核膜包裹而独立形成原核纺锤体极体微管组织中心的微核活性发生改变, 可形成多极纺锤体, 使染色体发生多极分离, 最终导致多原核受精卵的产生通过上述临床资料分析, 卵巢对 Gn 刺激的反应性高, 卵子质量改变可能与异常受精有关, 但异常受精出现对妊娠结局无明显影响需注意临床用药, 尽可能提高卵子质量, 减少异常受精的发生, 增加卵子利用率, 可能会提高临床累积妊娠率参考文献 : [1] 陆小溦, 冯云, 张爱军, 等. 以胚胎质量评分预测体外受精 - 胚胎移植妊娠结局. 上海医学, 2006, 29(3): [2] Miyara F, Aubriot FX, Glissant A, et al. Multiparameter analysis of human oocytes at metaphase II stage after IVF -817-

5 failure in non-male infertility. Hum Reprod, 2003, 18(7): [3] Andersen AN, Devroey, Arce JC, et al. Clinical outcome following stimulation with highly purified hmg or recombinant FSH in patients undergoing IVF. A randomized assessor blind controlled trial. Hum Reprod, 2006, 21(12): [4] Figueira RC, Setti AS, Braga D, et al. rognostic value of triploid zygotes on intracytoplasmic sperm injection outcomes. Assist Reprod Genet, 2011, 28(10): [5] Dayal MB, Gindoff R, Sarhan A, et al. Effects of triploidy after intracytoplasmic sperm injection on in vitro fertilization cycle outcome. Fertil Steril, 2009, 91(1): [6] Rawe VY, Olmedo SB, Nodar FN, et al. Organization defects and abortive activation in human oocytes after IVF and ICSI failure. Mol Hum Reprod, 2000, 6(6): [7] Matt DW, Ingram AR, Graff D, et al. Normal birth after single-embryo transfer in a patient with excessive polypronuclear zygote formation following in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril, 2004, 82(6): [8] Macas E, Imthurn B, Keller J. Increased incidence of numerical chromosome abnormalities in spermatozoa injected into human oocytes by ICSI. Hum Reprod, 2001, 16(1): [9] Grossmann M, Calafell JM, Brandy N, et al. Origin of tripronucleate zygotes after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod, 1997, 12(12): [10] 颜军昊, 陈子江, 李媛, 等. 体外受精后多原核受精卵的移植价值. 生殖与避孕, 2005, 25(9):5-41. [11] Macas E, Imthurn B, Rosselli M, et al. The chromosomal complements of multi-pronuclear human zygotes resulting from intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod, 1996, 11(11): [12] Rosenbusch BE. A preliminary concept, deduced from cytogenetic analyses, for explaining different types of multipronuclear oocytes obtained after intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril, 2010, 94(6): [13] Rosenbusch BE. Mechanisms giving rise to triploid zygotes during assisted reproduction. Fertil Steril, 2008, 90 (1): [14] 张文红, 龙晓林, 杜红姿, 等. IVF 和 ICSI 中多原核受精卵的发育及遗传多态性分析. 生殖与避孕, 2009, 29(7): [15] 蔡令波, 冯婷, 陈娟, 等. 体外受精治疗周期中出现过多的多原核合子 5 例分析. 中国实用妇科与产科杂志, 2006, 22 (12): (2012 年 4 月 19 日收稿 ) arameters Related to the Formation of Abnormol Fertilized Zygotes after Intracytoplasmic Sperm Injection Yuan-yuan ZHANG, Hui-fen XIANG, Xin XIE, Shi-ping ZHANG, ing ZHOU (Center of Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei, ) ABSTRACT Objective: To investigate the related influence factors on abnormal fertilized zygotes after intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Methods: A total of 299 ICSI cycles were studied retrospectively. They were divided into abnormal fertilized group (n=118) which at least had one non-2 pronucleus (2N) or 3N zygote and the control (n=181). Results: The E2 level on the day of hcg injection was higher in abnormal fertilized group (14 097±3 066 pmol/l) than that in the control ( ±6 836 pmol/l), <0.05. The number of oocytes retrieved (17.8 ± 7.2) and mature oocytes (15.3 ±6.1) were larger in abnormal fertilized group than those in control group (13.6 ± 7.0 vs 10.2 ± 5.3), respectively; <0.01. While significant differences of the maturity rates of oocytes (81.7%), the rates of 2N zygote (78.4%) were observed in abnormal fertilized group when compared with those in the control(76.4%,86.9%, respectively) (<0.01). There were no statistical differences between the two groups in age, basic hormone levels, amount of gonadotropin administration, sperm quality, implantation rate and pregnancy rate. Conclusion: The high responders of ovary may be related to the abnormal fertilization after ICSI. The outcome of pregnancy is not influenced by the abnormal zygotes, but reducing the incidence of abnormal fertilization and increasing oocytes utilization may improve the accumulative pregnancy rate. Key words: intracytoplasmic sperm injection (ICSI); abnormol fertilization; zygotes -818-

211 better than those in the control group, with significant difference between two groups (P < 0.05). The ocular hypertension of patients in the cont

211 better than those in the control group, with significant difference between two groups (P < 0.05). The ocular hypertension of patients in the cont 210 毛果芸香碱联合拉坦前列素治疗原发性急性闭角型青光眼的疗效观察符元党 1, 郑振优 2, 林再雄 2, 周吉良 1. 昌江黎族自治县中西医结合医院, 海南昌江 572700 2. 海南医学院附属医院眼科, 海南海口 570100 1 摘要 : 目的探讨