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运二寇
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1 * 仅用于实验室, 不用于诊断和治疗 96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 目录号 : A-P ( 96 次 ) A-P (192 次 ) 适用于 MS-PCR, 实时定量 MS-PCR, 以及甲基化微阵列操作手册请以试剂盒中配套的英文手册为准! 在您收到定购的产品时, 请确认操作手册是配套的! 同时, 有翻译不妥的地方还请各位老师批评指正! 反馈信箱 :tech@aderr.com 2014 年 8 月, 第 1 版, 对应英文第版艾德科技 ( 北京 ) 有限公司 A&D Technology Corporation

2 目录操作... 2 试剂盒组成... 2 运输和保存... 2 产品介绍... 3 重要说明... 3 一般产品信息... 4 简述... 5 原理和程序... 7 用法... 9 需要的材料 ( 需单买 )... 9 使用步骤... 9 附录使用甲基化特异性 qpcr 疑难解答订购信息相关产品如何下单推荐阅读... 18

3 操作试剂盒组成组件 BisulFlash Conversion Mix ( 转换混合溶液 ) DNA Binding Solution (DNA 结合液 ) Desulfonation Buffer ( 脱磺酸溶液 ) Elution Buffer ( 洗脱液 ) Binding Beads ( 磁珠结合 ) Mag-96 Well Plate (96 孔磁珠分选板 ) Adhesive Cover Film ( 封口膜 ) 96 次 192 次 A-P A-P 储存温度 4 ml 8 ml 室温 15 ml 30 ml 室温 0.6 ml 1.2 ml 室温 2 ml 4 ml 室温 0.5 ml 1 ml 4 C 1 2 室温 1 2 室温使用手册 1 1 室温 * 注意 : 在使用前, 将各溶液离心至管底运输和保存该试剂盒按室温运输所有组件在室温下 (15-22 C ) 避光保存其中,Binding Beads 在 4 C 储存在合适的保存情况下, 所有的产品组件有效期是一年, 自发货之日算起

4 产品介绍重要说明使用 : 使用该 96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 修饰后的 DNA, 适用于各种下游甲基化分析, 包括常规 MS-PCR, 实时定量 MS-PCR 即 qmsp 法,MS-HRM, 以及甲基化微阵列等等 DNA 输入量 : 每次修饰反应,DNA 用量为 0.1ng 1μg 为得到最佳修饰效果, DNA 输入量为 100ng 如果您使用该 DNA 修饰试剂盒做 MSP 或是 qmsp, 并且起始 DNA 量极其少 ( 如 :<10ng), 那么 PCR 循环数就要高于 45 亚硫酸氢盐修饰后的 DNA 纯化率取决于 DNA 输入量 DNA 质量以及起始材料的来源使用基因组 DNA 做亚硫酸氢盐修饰, 事先无需做限制性酶方法质粒 DNA 可用来做亚硫酸氢盐处理, 可要也可不要之前的线性化, 因为该试剂盒总能允许 DNA 变形状态在整个 DNA 亚硫酸氢盐转换过程中得到保持起始材料 : 材料包括各种组织或细胞样本, 如细胞培养瓶培养的细胞, 微型板中培养的细胞, 显微解剖样本, 石蜡包埋组织血浆 / 血清样品, 体液样本等等

5 预防措施 : 为了避免交叉污染, 以下预防事项对于指导如何使用离心管和瓶子是非常必要的 : 小心的使用移液器将样本或溶液移入到离心管和瓶子中使用气溶胶屏障的移液器枪头, 在使用移液器进行不同样本或溶液的转移时, 要及时不停的更换枪头在将离心柱放入微型离心机之前, 始终将离心柱盖子旋紧盖严在整个实验程序中需要戴手套且不同样品之间的接触, 应立即更换手套一般产品信息质控 : 每批 96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 按照预定技术规范进行检测, 以确保稳定的产品质量我司保证所有产品的性能跟说明书中的描述一致质量保证 : 此品如果没有达到您的实验期望, 可以给我们的技术发送邮件到 :tech@aderr.com 如果您有任何意见或新的应用领域及产品性能和技术, 我们也鼓励您随时与我们联系安全防护 : 对于实验人员工作时, 实验室应配备安全的外套, 一次性手套, 和适当的防护眼罩

6 产品更新 : 我司有权更改或修改任何产品, 以提高其性能和设计这个操作指南的信息是可能随时变更, 恕不另行通知因此, 此使用指南仅为提供此品用户时配套使用使用限制 : 96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 是为研究用途, 不适合诊断或治疗的应用知识产权 : 96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 中使用的原理和方法, 我司有产品专利简述胞嘧啶环中 5- 碳上的甲基若具备共有原子价的条件, 就能引发 DNA 的甲基化, 产生 5- 甲基胞嘧啶 DNA 甲基化在几乎所有的生物中都是存在着的, 包括发展生长和进化异常的 DNA 甲基化与疾病的发生有关, 如 : 癌症自身免疫性疾病精神分裂症因此, 基因 / 区域或全基因组 DNA 甲基化分析 5- 甲基胞嘧啶 (5-mC) 可以提供有价值的信息, 开发出的表观遗传标志物对于疾病诊断治疗和潜在目标非常有益的亚硫酸氢盐修饰的基因组 DNA, 经过 PCR 扩增克隆测序或全基因组测序是目前被认为是最可靠的方式, 对于评估单个分子 DNA 甲基化状态的也是如此通过亚硫酸氢盐修

7 饰处理后,5- 胞嘧啶位点被转化成尿嘧啶而 5- 甲基胞嘧啶保持不变然而, 目前使用的 DNA 亚硫酸氢盐转化方法仍然有不足之处, 特别是在速度便利化和通量方面为了解决这一问题, 我公司继续创新的开发了 96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 按照流程和组件优化, 这款产品可以在 1.2 小时内可以制备出修饰好的 DNA 样本该 96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 具有以下优点和特性 : 极速 : 完成整个实验步骤仅需要 1.2 个小时, 就可以得到 96 个修饰好的样本平均每个样本仅需 50 秒钟便利 : 预备好的转化混合液可以简单地直接加入到 DNA 样本中, 无需预先制备转化试剂创新性 : 目前在 DNA 变性过程和 C 到 T 的转化步骤, 无需

8 独立的 DNA 变性转化试剂完全转化 : 完全的将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶 (>99.99%), 不合适的和错误的甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶极其微小 (<0.1%), 可以忽略强劲保护 DNA 不被降解, 能保证 90% 的 DNA 不被断裂损失掉灵活性 : 不论选择 a) 根据手册每次单个反应 ; 还是 b) 每次高通量做 96 次反应, 使得实验非常灵活稳定性好 : 简单, 可靠, 不变的修饰条件, 容易遵循并且产量较高原理和程序作为下一代新型亚硫酸氢盐转化工具,96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 包含所有组件对 DNA 样本进行超快的亚硫酸氢盐转化由于独特的转化混合溶液包含功效强大的 DNA 保护试剂, 在整个亚硫酸氢盐 DNA 转化过程中,DNA 的变性状态都能得到保持, 因此, 能使 100% 的 DNA 在单链的形态下得到修饰, 而不会进行化学降解和嗜热降解因此, 这种新颖的磁珠设计方法可以单个操作, 也可实现高通量转化获得高效转化的 DNA 并可以用作后续如 : PCR, 芯片和下一代测序分析等等实验程序

同时发生 DNA 变性和亚硫酸氢盐转化 DNA 清洗转化后的 DNA 洗脱图解 :96 孔 DNA

通过采用甲基转移酶对 100ng 的基因组 DNA 中所有的 CpG 岛进行甲基化处理, 然后使用经过多重扩增包括

9 同时发生 DNA 变性和亚硫酸氢盐转化 DNA 清洗转化后的 DNA 洗脱图解 :96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 使用 96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 转化不同数量的人类基因组 DNA 使用快速 MS-qPCR 试剂盒扩增修饰后的 DNA( 货号 :A-P-1028) 使用 96 孔 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 精确转化 DNA 通过采用甲基转移酶对 100ng 的基因组 DNA 中所有的 CpG 岛进行甲基化处理, 然后使用经过多重扩增包括 CpG 岛的启动子区域进行实时荧光定量扩增分析, 并直接测序在非 -CpG 岛位点 100% 的 C 转化成 T; 在 CpG 岛位点 100% 的 C 仍然是 C

10 用法需要的材料 ( 需单买 ) 热循环仪带加热盖 * * 由于亚硫酸氢盐反应不用矿物油, 只有热循环仪带加热盖比较适合这个步骤移液器和移液枪头 0.2 ml PCR 管和 PCR 板磁珠分选装置 (A-Q10002) 1.5 ml 微型离心管 90% 乙醇使用步骤为得到最好的结果, 在实验开始前, 请全面仔细地阅读本使用手册起始材料 DNA 输入量 : 最佳 DNA 量是 100 ng/ 反应起始 DNA 可放在水中或者缓冲液中, 例如 TE DNA 提取 : 您可以使用自己的方法进行 DNA 提取我公司提供一系列全基因组 DNA 提取试剂盒方便您的使用 ( 看第 16 页订购信息下面 )

11 DNA 保存 : 提取好的全基因组 DNA, 在使用前可保存在 4 C 或者 -20 C 条件下对于捕获结合磁珠的平台, 我们建议使用我公司的磁珠分选器 ( 货号 :A-Q10002), 它有着非常强劲的磁力和已经被证明的快速而高效的提取能力在各种 96 孔板中, 磁珠均可结合 DNA, 并且特别适合在这个试剂盒中使用这个 96 磁珠分选器 DNA 亚硫酸氢盐转化 1. 对于 PCR 板或 0.2 ml PCR 管的每个孔, 添加 30 ul 转化混合液, 然后再添加 1-4 ul 的 DNA 样本 ( 最佳量是 :100ng) 2. 把 PCR 板子 / 管子盖紧, 并且将它们放到热循环仪中, 温度为 80 C, 放 45 分钟纯化修饰后的 DNA 1. 添加 120μl DNA 结合液到每一个 PCR 板子 / 管子中然后添加 5 ul 的结合磁珠, 使用移液器来进行混合, 时间控制在 8-10 分钟 ; 然后从每一个 PCR 板子 / 管子中将混合的样本转移到 96 孔磁珠分选器的孔中室温孵育 10 分钟注 : 未使用的条孔需要用这个试剂盒中的封口膜, 封好孔

12 2. 放置板子在一个 96 孔磁珠分选器上或是一个恰当的磁珠平台直到溶液澄清 ( 大约需要 2 分钟 ) 仔细移走并丢弃上清液 ( 提示 : 仔细地不要搅浑或丢弃包含 DNA 的磁珠 ) 3. 添加 200 ul 90% 乙醇到每个孔中并重新重悬磁珠放置板子在磁力平台 2 分钟或直至溶液澄清移走并丢弃上清液 4. 重复步骤 3 一次, 总计 :2 次清洗 5. 准备脱磺酸溶液, 通过添加 25 ul 的脱磺酸溶液即 Desulfonation Buffer 到每个 1 ml 90% 乙醇并混合添加 200 ul 终浓度的脱磺酸溶液到每个孔并重新重悬磁珠室温孵育 15 分钟, 然后放置板子在磁力平台 2 分钟或直至溶液澄清移走并丢弃上清液 6. 添加 200μl 90% 乙醇溶液到每个孔中并重悬磁珠放置板子在磁力平台 2 分钟或直至溶液澄清移走并丢弃上清液 7. 重复步骤 6 一次, 总计 :2 次清洗在最后一次清洗后, 务必保证乙醇完全去除 8. 室温下放置 3-4 分钟, 风干磁珠在磁力架上的板子要保证乙醇所有的痕迹都需去除

13 注 : 不要过度风干磁珠点 ( 过度风干磁珠会出现破解 ), 这样可能会显著降低洗脱的效率洗脱修饰后的 DNA 1. 在 20 ul 的洗脱液中, 重新重悬磁珠 ; 并室温孵育 2 分钟来释放磁珠上的 DNA 2. 通过放置板子在磁力平台上 2 分钟来捕获磁珠或直至溶液完全澄清 3. 转移 ul 的上清液到一个新的 0.2 ml PCR 板子, 在密封 PCR 板后, 并立刻储存在 -20ºC 进行保存附录使用甲基化特异性 qpcr 当做 MS-qPCR 即我们通常说的 qmsp 方法时, 我们推荐使用快速 MS-qPCR 试剂盒 (Cat. No. A-P-1028), 它包含热启动聚合酶系统, 并且能极大的减少全部甲基化特异性 qpcr 扩增时间在 2X 浓度下, 提供多功能混合液, 只要多加一些引物和模板, 更易于准备 PCR 反应如果使用该试剂盒, MS-qPCR 能缩短在 70 分钟之内完成

14 准备 PCR 反应作为阴性对照, 使用不含 DNA/RNA 的水代替 DNA 样本设计 PCR 反应疑难解答问题可能的原因建议 DNA 修饰不完全 DNA 质量不好 (DNA 严重降解 ) 检查样本 DNA 260/280 比率是否在之间 ;

15 太少的 DNA 或者太多的 DNA( 例如 < 100pg 或 >1 μg) 温度和热循环仪条件不对 DNA 清洗不足在每一步清洗和脱磺酸步骤中, 磁珠重新重悬转化混合溶液是否被其它的化学试剂或长期暴露在空气受到污染和影响试剂盒储存或者使用不当通过电泳跑胶看 DNA 是否降解添加或减少 DNA 输入量, 使其达到正常的范围或用最佳的量 100 ng 检查并调整到合适的温度和热循环仪条件确保在洗脱转化后的 DNA 中的第 5 步, 25 μl 脱磺酸溶液添加到每 1ml 90% 乙醇中在每一步清洗和脱磺酸步骤中, 确保磁珠重新完全重悬检查转化混合溶液有任何颜色的变化 ( 深黄或褐色 ) 或不容的沉淀物如有, 请使用并定购新的转化混合溶液将所有组件保存在室温下每次打开或使用后, 旋紧磁珠和

16 洗脱液含有很少或者不含有 DNA 下游甲基化特异性 PCR 结果不良放入的 DNA 质量不行 ( 降解 ) DNA 结合液没有足够添加到样本中作为 DNA 清洗的乙醇溶液的浓度不正确在 DNA 结合步骤或清洗风干步骤,DNA 没有完全的结合到磁珠上即便在阳性对照中, 很少或者没有 PCR 条带转化混合溶液的盖子通过电泳跑胶看 DNA 是否降解确保在纯化修饰后的 DNA 第 1 步中 DNA 结合液被加入使用 90% 乙醇为 DNA 清洗确保在纯化修饰 DNA 第 1 步孵育时间足够 (10 分钟 ), 第 8 步磁珠没有过度被风干确保所有的 PCR 组件都加入了, 并且使用了合适的 PCR 程序 (PCR 循环应 >40) PCR 引物和探针设计不合适或不正确确保引物和探针合适于做 MS-PCR 确保 PCR 中使用的模板 DNA 量足够

17 显著产生非特异性 PCR 条带亚硫酸氢盐转化失败确保所有修饰和清洗步骤都按照说明书中执行, 并且输入 DNA 量也是在推荐的范围内引物和探针不是特异的来识别修饰处理后的 DNA 或者目标基因检查引物和探针设计是否正确订购信息货号产品名称规格 A-P 孔 DNA 甲基化极速 96 次 A-P 修饰试剂盒 ( 磁珠法 ) 192 次

18 相关产品 DNA 样本准备货号产品名称 A-P-1003 通用型组织切片 DNA 提取试剂盒 A-P-1004 血浆 / 血清 DNA 提取试剂盒 A-P-1006 DNA 浓缩试剂盒 A-P-1007 凝胶 DNA 提取试剂盒 A-P-1009 石蜡包埋组织切片 DNA 提取试剂盒 A-P-1017 尿液 DNA 提取试剂盒 A-P-1018 血液和培养细胞 DNA 抽提试剂盒 DNA 亚硫酸氢盐修饰货号产品名称 A-P-1002 双链 DNA 提取 & 修饰试剂盒 A-P 孔 DNA 修饰试剂盒 A-P-1016 全细胞亚硫酸氢盐直接修饰试剂盒 DNA 甲基化分析货号产品名称 A-P-1005 PCR 纯化试剂盒 A-P-1011 通用甲基化 DNA 对照试剂盒 A-P-1019 通用甲基化 DNA 制备试剂盒 A-P-1028 快速 MS-qPCR 试剂盒 A-Q 孔磁珠分选板

19 如何下单 1. 电话, 传真或邮件定购 : 电话 : ; 传真 : ; 邮件 : ordering@aderr.com 2. 在线定单定购 : 推荐阅读 1. 新四大碱基的确定, 对于生物学研究者的几点启示! 2. 科学家发现新型 DNA-microDNA! 3. 艾德科技为您提供一站式的产品与服务! 4. 艾德科技教你如何在线设计甲基化的引物! 5. RNA 甲基化修饰和定量? 惊呆了我和小伙伴们!!! 6. 组蛋白甲基化和去甲基化神器在手, 小伙伴们发文章马上飞起来!

20 艾德科技 ( 北京 ) 有限公司 A&D Technology Corporation 地址 : 北京昌平区中关村生命科学园东 60 米 (102206) 电话 : 传真 : 网址 : 电邮 :tech@aderr.com

艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴 * 仅用于实验室, 不用于诊断和治疗请随时跟我们索取并使用最新版本的说明书 DNA 甲基化极易修饰试剂盒目录号 : A-P (50 次 ) A-P (200 次 ) 适用于 MS

艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴 * 仅用于实验室, 不用于诊断和治疗请随时跟我们索取并使用最新版本的说明书 DNA 甲基化极易修饰试剂盒目录号 : A-P (50 次 ) A-P (200 次 ) 适用于 MS * 仅用于实验室, 不用于诊断和治疗请随时跟我们索取并使用最新版本的说明书 DNA 甲基化极易修饰试剂盒目录号 : A-P-1054-050(50 次 ) A-P-1054-200(200 次 ) 适用于 MS-PCR, 实时定量 MS-PCR, 以及甲基化微阵列等下游实验分析操作手册请以配套的英文操作手册为准! 在您收到定购的产品时, 请确认操作手册是配套的! 同时, 有翻译不妥的地方还请各位老师批评指正!