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甫圣胡
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1 一般实验室研究使用, 不适于诊断和治疗 DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 用于快速检测全基因组 / 特定位点 DNA 中 5mc 的含量, 时间短, 效率高! 目录号 :A-P (48 次 ) A-P (96 次 ) 操作手册艾德科技 ( 北京 ) 有限公司 A&D Technology Corporation 在您收到定购的产品时, 请确认操作手册是配套的! 同时, 有需要修正的地方还请各位老师批评指正! 反馈信箱 :tech@aderr.com 2011 年 10 月, 第 1 版地址 : 北京昌平区中关村生命科学园东 60 米 (102206) 电话 : 传真 : 网址 : tech@aderr.com 艾德科技 ( 北京 ) 有限公司 A&D Technology Corporation

2 目录操作试剂盒组成运输与储存操作组成 A-P (48 次 ) A-P (96 次 ) 储存 MF1 (10X Wash Buffer) 14 m 28 ml 4 C MF2 (Binding Solution) 5 ml 10 m 常温 MF3 (Negative Control I, 20 ug/ml)* 10 ul 20 ul 20 C MF4 (Negative Control II, 20 ug/ml)* 10 ul 20 ul 20 C 介绍产品特性一般特性产品概述参考文献原理 / 程序用法配套器材 ( 自备 ) 操作手册建议条带附录凝难解答定购信息 MF5 (Capture Antibody, 1000 ug/ml* 4 ul 8 ul 4 C MF6 (Detection Antibody,400 ug/ml)* 8 ul 16 ul 20 C MF7 (Enhancer Solution)* 8 ul 16 ul 20 C MF8 (Fluoro Developer)* 8 ul 16 ul 20 C MF9 (Fluoro Enhancer)* 8 ul 16 ul 4 C MF10 (Fluoro Dilutor) 4 ml 8 ml 常温 8-Well Assay Strips (With Frame) C 操作手册 1 1 常温 * 使用前, 请将溶液离心至管底! 提示 : MF3 Negative Control 是未甲基化的多核苷酸含 50% 的胞嘧啶. MF4 Positive Control 是甲基化的多核苷酸含 50% 的 5 甲基胞嘧啶. 运输与储存常温 + 低温 (4 C 和 20 C) 收到后 : (1) 将组件 MF3, MF4, MF6, MF7 和 MF8 避光储存 20 C (2) 将组件 MF1, MF5, MF9, 和 8-Well Assay 避光储存 4 C (3) 将组件 MF2 和 MF10 避光常温储存提示 : 使用之前检查溶液 MF1(10X Wash Buffer) 是否含有盐的沉淀物. 如是, 常温或 37 C 预热, 直至盐的沉淀物溶液全部溶解. 请收到试剂盒时, 将所有的组件进行恰当的保存! Page 2 Page 3

3 介绍产品特性 : 在使用 DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 检测全基因组 DNA 甲基含量时是非常适合的. 不论是从哺乳类动物, 植物, 真菌, 细菌, 病毒和培养细胞, 新鲜与冷冻的组织, 石蜡包埋组织, 血浆 / 血清样本, 体液样本. 此品尤其适合仅有少量样品在激光显微捕获了的解剖样品和胚胎干细胞样品. DNA 输入量 : 每次反应 DNA 上样量为 ng 最优 DNA 的输入量为 100 ng, 正如在一些种属中甲基化 DNA 的含量一般都小于 1% 的总 DNA, 与组织中的含量不一样材料 : 材料包括各种组织或细胞试样如细胞培养瓶或酶细胞新鲜和冷冻组织, 石蜡包埋组织血浆 / 血清样品, 体液样品等. 内控 : 此品包含有阳性与阴性 DNA 对照一个标准曲线可以进行 ( 范围 : ng) 或单个数量的甲基化的 DNA 可以作为阳性对照因为全基因组甲基化是从组织到组织, 从正常和病变的区域, 建议确保运行复制样品信号的生成是经过验证的这个工具可以让用户对两份不同的样品以量化的绝对数量或相对数量来确定甲基化的 DNA 预防措施 : 为了避免交叉污染, 小心样品或溶液的加入在使用移液器进行加不同液体样本时, 要及时更换枪头在整个实验程序中需要戴手套且不同样品之间的接触, 立即更换手套一般特性 : 质控 : 每批 DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 的生产, 对既定的各个组件的生产把控, 确保了稳定的产品质量保证所有产品的性能描述都符合行业的产品标准质量保证 : 此品如果没有达到您的实验期望, 可以给我们的技术发送邮件到 :tech@aderr.com 我们也鼓励您随时与我们联系, 如果您有任何意见或新的应用领域及产品性能和技术安全 : 对于实验人员工作时, 实验室应配备安全的外套, 一次性手套, 和适当的防护眼罩产品更新 : 艾德科技有权更改或修改任何产品, 以提高其性能和设计这个操作指南的信息是可能随时变更, 恕不另行通知因此, 此使用指南仅为提供此品用户时配套使用使用限制 : DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 是为研究用途, 不适合诊断或治疗的应用知识产权 : DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 中使用的原理和方法, 我司有产品使用的追索权 Page 4 Page 5

4 产品概述 : DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 中含有定量检测全基因组羟甲基化所必需的所有试剂在检测实验中,DNA 被固定在一种有 DNA 吸附能力的孔上, 甲基化的片段会被捕获剂以及检测抗体识别, 用荧光分光光度计读取在 ex=530 +/-20/em=580 +/-20 nm 处的荧光强度来定量甲基化的 DNA 的量与荧光强度值成线性关系, 可以通过本试剂盒提供的方程来计算两种不同的甲基化 DNA 样品的相对甲基化状态或者通过标准曲线完全定量 5-mc 基于其工作原理和微孔板模式, 本试剂盒可以用于各种物种来源的多种样品形式, 包括培养的细胞新鲜和冷冻的组织石蜡包埋组织血浆 / 血清样品以及体液样品关于 5-hmC 5-hmC 是近年来在动物组织中发现的, 由胞嘧啶修饰而来 5-hmC 在表观遗传学上的功能可能与 5- 甲基化胞嘧啶 (5-mC) 不同尽管到现在为止还不确知其功能, 有研究者猜测它在调控基因的表达与关闭过程中起着重要的作用 5-hmC 的发现让我们不得不重新评估 DNA 甲基信息, 也不得不监测人类的健康组织和病理组织之间 5-hmC 相对分布的差异在我司的 DNA 羟甲基化定量检测技术之前, 我们还没有发现任何直接的常规方法来检测 5- hmc, 以及区分 5-hmC 和 5-mC 5-hmC 和 5-mC 的区别时下常用的 DNA 甲基化分析方法包括限制内切酶酶切和亚硫酸氢盐后的定性定量分析或 MeDIP 介导的 MS-PCR 和测序, 这些技术都不适合用来检测 5-hmC, 因为它与 5-mC 事实上很难用这类方法区分开来为了解决这个问题, 我司特研制了 DNA 羟甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 本试剂盒提供了一种很经济的方法来检测 5- 羟甲基化胞嘧啶, 并且区分 5-hmC, 5-mC, 和 C, 使得研究者能够重新评估他们的 DNA 甲基化信息, 也能够在新样品中寻找 DNA 羟甲基化最近, 一种新的修正的核苷酸被命名为 :5-hmC, 且在老鼠的大脑和胚胎干细胞中已经发现在 1952 年,5-hmC 第一次发现是在噬菌体内在哺乳动物中, 它是由甲基化胞嘧啶氧化所产生的, 这是一个通过 T 族酶和 DNA 甲基转移酶蛋白介导的一个反应下面是胞嘧啶的甲基化羟甲基化形式: 未甲基化 DNA 甲基化 DNA 羟甲基化 DNA T-C-G-T-C-G-A-C-G T- m C-G-T- m C-G-A- m C-G T- hm C-G-T- hm C-G-A- hm C-G 目前, 在表观遗传学界 5-hmC 更广泛的功能仍然是一个谜然而, 一系列的有力证据已经表明在去甲基化染色体重塑和基因表达调节, 尤其是脑的特定部位基因表达调控中 5-hmC 扮演着重要角色试剂盒曾经对来自小鼠大脑和海拉细胞系的样品成功地进行了 5-hmC 的定量, 所得到的结果与用 HPLC 和 LC-MS 的方法相当通过使用本试剂盒, 研究者们首次在正常人类脑部组织和结肠组织中发现了高丰度的 5-hmC 同时, 研究结果还显示, 正常人类脑部组织和结肠组织中 5-hmC 分别占总甲基化胞嘧啶 (5-mC 和 5-hmC 的总和 ) 的 32% 和 16% 相反, 在结肠癌细胞系 (HCT116) 和宫颈癌细胞系 (HeLa) 中,5-hmC 的比率很低, 几乎没有 96 孔板模式让您可以根据自己的需要选择用手工或者高通量 ; 此试剂盒中提供通用阳性和阴性对照, 能用于定量检测各种来源的 DNA 样品中的羟甲基化状态, 包括哺乳动物植物真菌细菌以及病毒 ; 此试剂盒中含有定量检测全基因组 DNA 甲基化实验所有用到的试剂, 包括阳性和阴性对照直接测定荧光强度的方法来进行定量检测取代了已过时的和劣质的方法, 无须 DNA 消化 / 变性提取, 不用使用套色版, 不接触放射性材料 ; 本品用到的新方法和专利试剂使得羟甲基化 DNA 定量实验结果精确高度灵敏特异, 检测极限为 10 pg 的羟甲基化 DNA, 检测范围宽至 10 pg 到 20 ng, 检测灵敏度是 HPLC 的十倍 (0 008% vs 0 08%), 不与 DNA 上甲基化或者未甲基化胞嘧啶反应, 特异检测 5-hmC Page 6 Page 7

1) 5-mC 转化到 5-hmC 大大降低蛋白质的亲和力对于甲基化 DNA; 2) 5-hmC 群系通过氧化损伤或借助外源的醛式的 DNMTs 能够防止参与的 DNMT 目标胞嘧啶不被甲基化 3) 5-hmC 可能会吸收特异性的蛋白, 并致使染色质的结构发生改变或 DNA 甲基化模式的改变 4) 5-hmC 分布在 40% 的甲基化胞嘧啶的蒲金耶氏细胞 (Purkinje cells) 中,

5 1) 5-mC 转化到 5-hmC 大大降低蛋白质的亲和力对于甲基化 DNA; 2) 5-hmC 群系通过氧化损伤或借助外源的醛式的 DNMTs 能够防止参与的 DNMT 目标胞嘧啶不被甲基化 3) 5-hmC 可能会吸收特异性的蛋白, 并致使染色质的结构发生改变或 DNA 甲基化模式的改变 4) 5-hmC 分布在 40% 的甲基化胞嘧啶的蒲金耶氏细胞 (Purkinje cells) 中, 有 10% 在颗粒神经元 (granule neurons) 中. 原理 / 程序 : DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 包含全基因组 DNA 羟甲基化定量的所有试剂在此试验中,DNA 必定会跑出经过处理后的具有高亲和性的 DNA 条带在检测实验中,DNA 被固定在一种有 DNA 吸附能力的孔上, 羟甲基化的片段会被捕获剂以及检测抗体识别, 然后使用荧光分光光度计读 RFU( 相对荧光单位 ), 对其进行荧光法定量甲基化的 DNA 的量同测量的荧光强度成比例本试剂盒有以下优点和特性 : 整个荧光法检测技术的操作简单易学, 方便快捷, 只需要 4 小时就能完成实验 ; 灵敏度高, 检测极限低至 50 pg 甲基化的 DNA; 对于未甲基化和甲基化的胞嘧啶无特异性, 仅对甲基化 DNA(5-mC) 进行高度专一的检测 ; 通用型的阳性与阴性对照, 对于任何种属的甲基化 DNA 状态进行定量检测是非常理想的 ; 微孔板 (96 孔 ) 的设计使实验更灵活, 无论对于手动还是高通量分析 ; 简单可信和检测实验条件恒定参考文献 : 1. Robertson KD. Nat Rev Genet. 6: , Kriaucionis S et al: Science. 324: , WYATT GR et al: Biochem J. 55:774-8, Tahiliani M et al: Science. 324: , Valinluck V et al: Nucleic Acids Res. 32: Valinluck V et al: Cancer Res. 67:946-50, Jin SG et al: Nucleic Acids Res. 38: e125, 建议使用我司 DNA 提取系列试剂盒进行基因组 DNA 制备将 DNA 结合在实验孔中洗脱孔, 然后加入捕获抗体洗脱孔, 然后加入检测抗体以及增强溶液加入氟代显影剂进行荧光法定量, 然后测量 RFU 图解 :DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 实验过程 Page 8 Page 9

6 用法配套器材 ( 自备 ) 可调移液器各型号塑料枪头荧光分光光度计 ( 有激发波长在 530nm 和发射波在 590nm) 1.5ml 离心管 37 C 孵化器材板密封材料和石蜡封口膜双蒸水 1 X TE buffer ph 7.5 to X PBS ph 7.2 to 7.5 分离 DNA 其它通过 DNA 甲基化定量检测试剂盒获得高敏感度和特异性 5- 甲基胞嘧啶检测演示不同浓度的合成未甲基化 DNA( 只包含 50% 的胞嘧啶 ) 和甲基化 DNA( 只包含 50% 的 5- 甲基胞嘧啶 ) 将会被加入到孔中, 通过 DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 进行检测 Page 10 Page 11

7 操作手册为了得到更理想的实验结果, 请您在实验开始前认真地阅读整个的操作手册起始材料 DNA 输入量 : 每次反应 DNA 量从 20ng 到 200ng 不等. 最佳的量是 100ng/ 反应起始 DNA 可以是在水中也可以是在缓冲液中例如 :TE DNA 提取 : 实验者可以采用多种方法进行 DNA 提取我司提供一系列基因组 DNA 提取试剂盒, 以供参考 ( 看 19 页订购须知下面 ). DNA 保存 : 提取的基因组 DNA 在使用前可保存于 4 C ( 短期 ) 或 20 C ( 长期 ) 1. 准备 1X 清洗缓冲液 (wash buffer)(mf1) 48-Assay Kit: 将 13 ml MF1 10X 清洗缓冲液加入到 117 ml 蒸馏水中 (ph ). 96-Assay Kit: 将 26 ml MF1 10X 清洗缓冲液加入到 234 ml 蒸馏水中 (ph ). 稀释的 MF1 1X 清洗缓冲液可以储存在 4 C 的条件下长达 6 个月 2. 准备稀释的阳性对照 (MF4) 单点对照准备 : 使用 1X TE 缓冲液将 MF4 阳性对照稀释到 5 ng/µl (1µl MF4 + 3µl TE 缓冲液 ). 建议的标准曲线准备 : 第一步, 稀释 MF4 到 10 ng/µl (5µl MF4 + 5µl 1X TE 缓冲液 ) 然后, 依照下面的稀释表, 再准备五种浓度, 通过 10 ng/µl 稀释的 MF5 和 1X TE 到 0.5,1.0,2.0, 5.0, and 10 ng/µl 管子 MF4(10ng/ul) 1X TE MF4 终浓度 ul 19.0 ul 0.5 ng/ul ul 9.0 ul 1.0 ng/ul ul 4.0 ul 2.0 ng/ul ul 2.0 ul 5.0 ng/ul ul 0.0 ul 10.0 ng/ul 3. DNA 结合 a. 预先确定好实验的条孔数量小心的从座架上拿走不需要的条孔, 将其放回到包中 ( 密封好包, 存于 4 C 下 ) b. 在每个孔中注入 80 µl MF2 结合溶液 c. 加入 1 µl MF3, 1 µl 稀释的 MF4( 看下面注意 ), 100 ng 实验者 DNA 标本 (1-8 µl) 到表 1 中或表 2( 第 16 页 ) 指定的孔中微微的左右倾斜或慢慢地晃动板子几次, 使溶液混合, 并确保溶液均匀的覆盖孔的底面注意 : (1) 为得到单个对照, 加入在第二步中已经准备好的 5 ng/µl 浓度的 MF4 1 为得到标准曲线, 加入浓度为 0.5 到 10 ng/µl 的 MF4 稀释液 1 µl ( 见第二步中标 ). 最终的量应该是每孔 0.5, 1,2,5 和 10 ng (2) 为得到最佳结合, 所添加的 DNA 样本量不应大于 8 µl d. 在 37 C 下, 用板密封盖或者用封口膜 M 覆盖条带板和孵化物, 达 90 分钟 e. 将 MF2 结合溶液从每个孔中移走使用 150 µl 稀释的 MF1 1X 清洗缓冲液清洗每一个孔, 每次都要清洗三遍 4. 甲基化 DNA 捕获 a. 使用稀释的 MF1 来稀释 MF5 ( 以 1:1000 比例 ) b. 加入 50 µl 稀释的 MF5 到每个孔中, 然后在室温下密封和孵化达 60 分钟 c. 移走每个孔中的稀释的 MF5 溶液 d. 用 150 µl 稀释的 MF1 清洗每一个孔, 三遍 e. 使用稀释的 MF1 来稀释 MF6 ( 以 1:2000 比例 ) f. 加入 50 µl 稀释的 MF6 到每个孔中, 然后在室温下密封和孵化达 30 分钟 g. 移走每个孔中的稀释的 MF6 溶液 h. 用 150 µl 稀释的 MF1 清洗每一个孔, 四遍 i. 使用稀释的 MF1 来稀释 MF7 ( 以 1:5000 比例 ) j. 加入 50 µl 稀释的 MF7 到每个孔中, 然后在室温下密封和孵化达 30 分钟 k. 移走每个孔中的稀释的 MF7 溶液 l. 用 150 µl 稀释的 MF1 清洗每一个孔, 五遍 m. 使用 150 µl of 1 X PBS 清洗每一个孔, 一遍 Page 12 Page 13

8 5. 信号检测 a. 通过将 1µl MF8 和 1 µl MF9 加入到每 500 µl MF10 中, 准备好氟代显影剂 b. 将 50 µl 氟代显影剂加入到孔中, 在室温下孵化 1 至 4 分钟, 避光较高浓度标准孔的颜色将会在此期间变成粉红色使用荧光分析仪在 530EX/590EM nm 条件下, 测量并读取 RFU( 相对荧光单位 ) 注意 : 如果条带孔框同分析仪不相符, 将溶液转移到 96 孔板上, 再次使用荧光分析仪在 530EX/590EM nm 条件下读 RFU 绝对定量 : 要得到甲基化的绝对定量就要使用精确计算, 首先, 生成一个标准曲线, 在每一个浓度点, 标绘出 RFU 值同 MF4 的对比, 然后, 使用线性回归 ( 可使用 Microsoft Exel 中线性回归计算功能 ) 确定标准曲线的斜率 (RFU/ng), 及标准曲线最线性的部分 ( 包含至少 4 个浓度点 ), 从而得到最佳的斜率计算现在可通过以下公式来计算 5-mC 在总 DNA 中的含量和百分比 6. 5-mC 计算相对定量 : 为了确定两种不同 DNA 样本的相对甲基化状态, 总 DNA 中 5- mc 的百分比可以通过以下公式进行简单计算得出 : S 代表 DNA 样本的初始输入量单位 :ng. S 代表投入 DNA 样本的量单位 :ng. P 代表投入阳性对照 (MF4) 的量单位 ng. * 2 是一个代数因子, 将 5-mC 在阳性对照中的含量标准化达到 100%, 由于阳性对照只包含 50% 的 5-mC 计算举例 : MF3 中平均 RFU 是 1000 MF4 中平均 RFU 是样本中平均 RFU 是 S 是 100 ng P 是 5 ng * 2 是一个代数因子, 将 5-mC 在阳性对照中的含量标准化达到 100%, 由于阳性对照只包含 20% 的 5-mC 计算举例 : MF3 中平均 RFU 是 1000 样本中平均 RFU 是斜率是 6000 RFU/ng S 是 100 ng Page 14 Page 15

附录凝难解答出现的问题可能的原因建议解决方法阳性对照与样品均无信号仅阳性对照无信号或微弱信号是否正确的加入试剂在加入结合缓冲液之液, 孔被不恰当地清洗孔底部并没有完全被组件 MF2 溶液所复盖预热时间和温度不正确起始材料较少不正确的荧光读数组件没有存储或得到适当的处理在第三步 C 中阳性对照

9 建议条带孔的设置表一 : 建议在 48 微孔板 ( 或 96 微孔板, 其中 7 至 12 孔可设置样本 ) 中您使用单个位点的阳性对照, 我们可以同时检测标准品与样品各两份. 表二 : 建议在 48 微孔板 ( 或 96 微孔板, 其中 7 至 12 孔可设置样本 ) 中您可以制作标准曲线, 我们可以同时检测标准品与样品各两份. 附录凝难解答出现的问题可能的原因建议解决方法阳性对照与样品均无信号仅阳性对照无信号或微弱信号是否正确的加入试剂在加入结合缓冲液之液, 孔被不恰当地清洗孔底部并没有完全被组件 MF2 溶液所复盖预热时间和温度不正确起始材料较少不正确的荧光读数组件没有存储或得到适当的处理在第三步 C 中阳性对照加入量不够在操作手册中任何一步可能被您忽略了, 检查试剂是否被添加到恰当的位置. 在加入阳性对照和样本之前确保孔没有被清洗通过微微的左右倾斜或慢慢地晃动板子几次, 确保溶液覆盖孔的底面确保孵育时间和温度是正确的按照操作手册来设置的确保注入到孔中的阳性对照 (>1ng) 和样本量 (>100ng) 充足检查是否采用合适的荧光波段 (530EX/580EM nm) 确认所有的组件是被恰当的温度储存, 并在每次使用完溶液后, 须将瓶盖拧紧. 确保注入了足够的阳性对照组件 MF4 因不恰当的储存而降解组件 MF4 阳性对照确保按照本操作手册中第三步的运输与储存条件 Page 16 Page 17

10 阴性对照中存在高背景洗脱不净检查是否严格按照操作手册中的每一步进行的实验阳性对照或样品 DNA 被污染在加入样本或阳性对照时, 确保孔不被污染或意外地使用污染的吸头, 孵育时间太长在第 3d 步时的孵育时间不应超过 2 小时荧光信号过强在第 5b 步时减弱荧光量定购信息货号品名规格 A-P-1035 DNA 甲基化 48 次相关产品 DNA 样本的制备定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 96 次货号品名规格 A-D1801 全血基因组 DNA 50 次提取试剂盒 ( 离心柱 ) A-D1901 细胞 / 组织基因组 DNA 50 次提取试剂盒 ( 离心柱 ) A-D3111 新型极速植物基因组 DNA 50 次提取试剂盒 ( 离心柱 ) A-D6201 酵母基因组 DNA 50 次试剂盒 ( 离心柱 ) A-D7118 高浓度石蜡包埋组织基因组 DNA 50 次提取试剂盒 ( 离心柱 ) 全基因组 / 特定基因 DNA 甲基化定量试剂盒 A-P-1034 DNA 甲基化 48 次定量检测试剂盒 ( 比色法 ) 96 次 A-P-1036 DNA 羟甲基化 48 次定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 96 次 A-P-1037 DNA 羟甲基化 48 次其它定量检测试剂盒 ( 比色法 ) 96 次 A-R1201 高纯总 RNA 50 次极速提取试剂盒 ( 离心柱 ) 200 次 A-R3301 通用植物总 RNA 50 次极速提取试剂盒 ( 离心柱 ) Page 18 Page 19

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