海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 1; 些体液中异常甲基化的 $3"; 在一些应用中肿瘤衍生来的物质可以直接测试不需要用到具有低检测限的方法直接检测的应用之一也是唯一用于临床的 $3" 甲基化生物标志物 7 基因启动子甲基化甲基鸟嘌呤 $3"

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晨申
5 years ago
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1 1, 海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 综述 +2 方法检测单位点 $3" 甲基化标志物在肿瘤诊断预后及治疗反应性中的应用!" #!"$% &' $!!! "! "!!!! 4 44 背景 4$3" 甲基化是一种涉及肿瘤的发生在人类基因组上极具特征性的表观遗传学修饰肿瘤细胞中所发现的异常 $3" 甲基化模式不仅表现为全基因组的低甲基化还包括特定基因不同位点的高甲基化特别是大量抑癌基因会因启动子区域的高甲基化状态而发生表观遗传沉默这其中的一些抑癌基因使得 $3" 甲基化标志物用于早期肿瘤的诊断成为可能并且已有部分抑癌基因在疾病的预后及对治疗的反应性上显示出较大的价值内容 4 在众多检测单基因位点 $3" 甲基化的技术中基于亚硫酸氢钠预处理的 $3" 为模版的 +2 方法被普遍认为分析灵敏度及特异性最为突出许多新兴方法例如 5.6" "27 5 已然成为传统 +2 方法的补充并有望发展为具有诊断价值的检测手段值得一提的是高分辨率熔解曲线分析 2 技术因其闭管模式及成本的有效性而显示出作为诊断工具的巨大潜力总结 4 至今已发展出大量传统和新兴的 +2 方法用于检测单基因位点的 $3" 甲基化所有方法都有其独特的优点和不足之处尤其是考虑到临床应用环境时应具体分析作出适当的选择 44 在人类细胞中 $3" 甲基化几乎完全发生在二核苷酸胞嘧啶 + 的第 1 位碳原子上尤其在启动子区域的许多基因富含 + 这些富含 + 的一段 $3" 一般被称为 + 岛 + 岛在正常细胞中通常处于非甲基化状态然而 $3" 甲基化在正常细胞中也是非常重要的在失活的女性 8 染色体上的基因印迹基因 ) 以及失活的种系基因如 " 9) 黑色素瘤抗原基因家族中都存在甲基化的 $3" 片段此外 + 二核苷酸甲基化能保护正常细胞避免重复元件的不适当转录如长散在核元件 639 和 " 元件 * + 二核苷酸甲 1 基化同样也被认为能够保持染色体的稳定性事实上 -:,-: 的特定基因组 + 二核苷酸都! " # " # $ %& "'' ' # #! " # #! "!(& )*) % " #+,--- $ %&. /0*1, ) # (& &'%& 处于甲基化状态在肿瘤早期发展阶段许多特定的非甲基化抑癌基因启动子区域发生从头甲基化和转录沉默尽管通常肿瘤全基因组表现为广泛的低甲基化, 很多重要的基因在人类恶性肿瘤中被沉默且与肿瘤有关的所有细胞通路途径可能受到影响 ;- $3" 甲基化和沉默可能影响抑癌基因座位上一个或的两个等位基因而非甲基化的等位基因可能因为突变缺失或杂合性丢失而灭活因此许多基因启动子的异常甲基化非常有望 ) 成为生物标记应用于早期诊断和预测预后此外可以通过检测肿瘤患者血清和其他体液中因肿瘤细胞凋亡而释放入循环的 $3", 研究最多的体液是乳腺癌的乳房抽吸液肺癌的痰液和支气管肺泡灌洗液前列腺癌患者的尿液和多种癌症的血清和血浆 ) 然而在这些种类的标本中肿瘤来源的 $3" 是非常难以检测到的是因为它们的浓度很低而且混迹于大量的正常细胞的 $3" 中所以需要有出色检测能力的方法来鉴定出这

2 海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 1; 些体液中异常甲基化的 $3"; 在一些应用中肿瘤衍生来的物质可以直接测试不需要用到具有低检测限的方法直接检测的应用之一也是唯一用于临床的 $3" 甲基化生物标志物 7 基因启动子甲基化甲基鸟嘌呤 $3" 甲基转移酶它可以预测用烷化剂治疗恶性胶质瘤患者的预后情况 )- 尽管许多有希望的 $3" 甲基化标志物已经确定它们应用于临床仍然收到限制往往由于缺乏足够的诊断敏感性和特异性某个生物标记物诊断的敏感性是指特定的生物标志物检测法能将实际患病的人正确地判定为患者的比例而诊断特异性是指该方法能将实际无病的人正确地判定为非患者的比例另外此篇综述中我们将分析灵敏度定义为在背景为未甲基化的模板中可检测到的最小甲基化模板的比例 ) $3" 的甲基化检测绝大多数都是基于 +2 技术以亚硫酸氢钠预处理的 $3" 为模板已有两种不同的策略用于此类反应的引物的设计甲基化独立 +2 引物可用于大部分现有的 +2 方法被设计用来成比例的扩增甲基化和非甲基化的 3$" 但是要提供最高的分析灵敏度一般使用甲基化特异性 +2 5 引物仅用于扩增甲基化模板本文回顾了一些最有应用前景的基于和 5 引物的方法并讨论有关其临床适用方面的优势和劣势但是没有什么方法是具有普遍优势的因为不可能仅用一种方法达到如下所有目标定量的准确性高的分析灵敏度低的假阳性率和假阴性率高通量评估单个 + 位点低的 +2 污染风险闭管式分析结果容易解释无须专门的设备且成本低表概述了这些方法同时比较了它们临床应用上的几个重要参数一亚硫酸氢钠预处理法表观遗传信息在 +2 过程中会丢失因为 $3" 聚合酶不能区分甲基化和非甲基化的胞嘧啶因此聚合酶在这两种情况下会结合鸟嘌呤和未甲基化的胞嘧啶 +2 以后任何最初甲基化的等位基因被稀释到一个不可测的浓度因此 $3" 必须经过修饰来保证甲基化信息得到保存 $3" 经亚硫酸氢钠预处理后胞嘧啶转化为尿嘧啶 )) 这是大多数实验室出于上述目的而采用的方法因为 1 甲基胞嘧啶脱氨转化为胸腺嘧啶的转化速率比胞嘧啶转化为尿嘧啶的慢假设在亚硫酸氢钠预处理后保留的胞嘧啶都是来源于 1 甲基胞嘧啶因此在随后的 +2 过程中尿嘧啶残基被复制为胸腺嘧啶残基 1 甲基胞嘧啶残基被复制为胞嘧啶图 ). 和同事们描述的亚硫酸氢钠预处理试验步骤被广泛应用市场上也由此出现了大量的商品化试剂盒在合适的条件下经亚硫酸氢钠预处理后非甲基化胞嘧啶的预期转化率为 ;;: )* 尽管转化率高但是一小部分的 $3" 片段实际上呈现低的转化率 )1 且没有转化位点的分布是非随机的如此一些启动子区域更倾向于不完全基因转化转化率也取决于 $3" 的质量 )1 当应用以 5 引物为基础的技术期望检测到低水平甲基化时上述可能性尤其要牢记亚硫酸氢钠预处理后正链和反链不再互补因此需要对每条链单独设计或者 5 引物二基于引物的方法扩增一个目的基因而不依赖于其甲基化状态是比较困难的在绝大多数情况下 +2 偏性倾向于扩增非甲基化 $3" ) 这能通过经重亚硫酸盐修饰 $3" 的 + 含量不同而得到解释最近已经提出了针对此问题的不同解决方法首先有报道称通过在引物序列引入一定数目的 + 位点来控制退火温度从而控制 +2 的扩增偏性 ) 在某些情况下仅使用无 + 位点的传统引物提高退火温度已足够解决扩增偏性问题 ), 单分子扩增已显示能够克服 +2 偏性现象 ); - 相对较低的分析灵敏度是应用引物进行 +2 的另一局限性虽然这种方法的灵敏度可以通过在引物序列引入 + 位点或使用寡核苷酸阻滞物来得到提高 ) 一重亚硫酸盐基因组测序 $3" 甲基化分析的金标准在传统上是先用重亚硫酸盐修饰 $3" 经 +2 扩增后进行测序 ) 此方法能够提供单个 + 位点水平的信息测序最常用引物但也可用来证实 5 引物的扩增结果 +2 产物能够直接测序或者通过制备单个克隆进行测序对克隆 +2 产物的进行测序可提供单个分子甲基化信息而直接测序则对所有扩增分子每个 + 位点平均甲基化状态进行估算使用 5 引物时所有的克隆分子都被认为是甲基化的而当使用引物且有足够克隆经过测序时则样品中甲基化和非甲基化分子的比率是可以确定的遗憾的是常规临床检测中使用单克隆序列测定过于费时且昂贵单个克隆的重亚硫酸盐基因组测序受到克隆偏性的影响这可能对长片段胸腺嘧啶的准确测定带来问题这种长片段在重亚硫酸盐修饰的 $3" 中经常遇到 * 最近有报道提

3 - 海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 出一种无需克隆操作的单分子测序方法即数字式重亚硫酸盐序列测定法 - 这种方法不仅需要样品的多重反应而且需要将样品稀释到一个临界水平从而将每个反应孔中超过 ) 个 +2 模板分子的可能性降至最低每个样品至少进行 ; 次反应以便于获得一定数量的阳性孔进行后续的测序屋论如何与分离单个重亚硫酸盐转变 $3" 分子的亚克隆操作程序相比这种方法节约了时间和劳力二焦磷酸测序对于传统双脱氧法测序桑格测序的一个有吸引力的转变是焦磷酸测序该方法基于焦磷酸盐的检测焦磷酸测序同样适用于重亚硫酸盐修饰

4 海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& $3" 的甲基化分析可以得到单个 + 位点的定量信息 1 焦磷酸测序通过检测一种核酸外切酶缺陷型 $3" 聚合酶在合成互补链过程中产生的光能来进行当核苷酸被掺入时焦磷酸盐被释放出来并在 "7 硫酸腺苷转移酶作用下被转变成 "7 "7 分子将能量提供给荧光素酶在荧光素酶分子氧化荧光素这个反应中释放出光能四种不同的核苷酸按照模板碱基的需求有顺序的加入焦磷酸测序仪有多种用途, 然而所得数据的定量准确性和可靠性随着 + 位点至正向引物末端间距的延长而逐渐下降这个特点也限制了单个焦磷酸测序反应所能分析的碱基数 + 位点 ; 重亚硫酸盐修饰 $3" 中经常出现的长片段胸腺嘧啶也有可能影响检测结果的重复性焦磷酸测序通常应用引物来进行不过这种方法也能够用于识别 5 分析中出现的假阳性结果 *- 三亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法特定的限制性内切酶消化 +2 扩增产物可以用来区分甲基化和非甲基化 $3" * 经重亚硫酸盐修饰后的甲基化和非甲基化 $3" 序列的差异可以产生新的甲基化依赖性限制性酶切位点或者维持限制性酶切位点处于甲基化依赖状态这种特性可通过亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法 + 2" 这种定量方法而实现 *) 该方法用琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 +2 产物然后进行定量杂交限制 + 2" 应用最大的原因在于缺乏能够识别整个序列的限制性内切酶很多 + 岛不能被分析此外除了 +2 偏性现象外 ) 含有限制性内切酶位点的单链与和不含该酶切位点单链间杂交双链的形成以及在重亚硫酸盐修饰过程中非甲基化胞嘧啶的不完全转化使得精确地定量大打折扣虽然这种方法相对来说比较费力但是花费较低四甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法 5 9 最 * 初是用于研究单核苷酸的突变而后应用于 $3" 甲基化的研究 ** 扩增产物经凝胶电泳

5 ) 海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 分离纯化后与内参引物结合该引物在延伸至被分析的单核苷酸的 1 端时立即终止如甲基化研究中 + 位点中的胞嘧啶随后 ) 标记的 '+7 或 '77 在 $3" 聚合酶作用延伸内参引物扩增产物片段通过聚丙烯酰胺凝胶显像分离然后用磷光成像分析技术对 ) 种核苷酸的相对量进行定量分析尤其在单引物延伸反应中包含多个内参引物时可实现相对高通量 *1 在这一步内参引物不应该退火到原来含有 + 位点的序列以防止偏性现象的产生但是在 + 密集的区域达到这个目的是很困难的这个方法很费力并且存在要应用到放射性物质的缺点 " '! 公司的 53 # 技术可被作为检查平台替代放射性标记技术 * 另外一种以变性 6+ 替代放射性标记对扩增的引物片段进行分离和量化的变异技术已有报道 * 52 分析最近用于 7 启动子甲基化的研究并推荐优于 + 2" 和焦磷酸测序技术最后最近介绍了一种能半定量的高通量的基于芯片技术的方法 *, 五甲基化敏感的熔解曲线分析法亚硫酸氢钠处理得到的甲基化和未甲基化的 $3" 之间序列的差异可通过熔解曲线分析 +" 来区分因为 + 含量越高的甲基化 $3" 越不容易熔解 *; 在甲基化敏感的 +" 5 +" 方法中在荧光染料嵌入到双链 $3" ' $3" 中后进行在闭管系统中 +2 后立即立刻在温度升高的同时对荧光的连续监测来检测产物的熔解特性大多数小的 +2 产物通常在一个有限的温度窗内熔解染料释放时产生突然减弱的荧光信号当结果被看做衍生的熔解曲线时将主要荧光迁移看做峰代表了产物的溶解温度图 ) 在甲基化分析中靶序列可能被完全甲基化完全未甲基化或者是不均匀的甲基化当完全甲基化分子和完全未甲基化分子的混合物被放大时出现两个不同的熔解峰就很容易解释了但是当不均匀甲基化的分子被放大后解释熔解模式就很困难图 ) 六甲基化敏感的高分辨率的熔解法 5 2 一般来讲高分辨率的熔解 2 技术的发 1- 展带来了几个方法学上的优势首先因为 2 法能获得更多的数据点使熔解峰变得更尖锐扩增产物间的微小差异便能检测到第二 2 仪器产生的温度分辨率高相对的就可能实现高通量这取决于所使用的仪器 1 第三大多数仪器提供的软件允许标准化终末荧光温度转化以及应用内部寡核苷酸定标物 1) 2 可在染料达到饱和浓度而不抑制 +2 反应情况下完成非饱和的染料例如 5 2 也可以使用尽管这种燃料不能很好的检测杂交双链但这也是甲基化研究中的一个优势因为杂交双链不会将熔解模式复杂化有报道称 5 2 可进行序列的特异

6 海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 结合 1* 提示了在用熔解技术进行甲基化研究中一个潜在的问题用传统的引物的 2 技术已被用于分析单个印迹位点的甲基化引物包含一定数目的 + 位点用来校正 +2 偏性并增加分析敏感度例如 7 启动子甲基化的分析以及 ; 甲基化变化 ; 表达转录母系印迹非蛋白质编码这种方法涉及到引物序列中包含 + 位点这将 +2 偏性推向甲基化等位基因优化的退化温度使反应更类似于 5 大大提高了分析灵敏度最近表明对倾向于不均匀甲基化的启动子的研究可通过数字化 5 2 方法来改进 1 七基于碱基特异性裂解及引物延伸的基质辅助激光吸附电离飞行时间质谱 "6$ 7. 采用 "6$ 7. 质谱对 $3" 甲基化进行检测有几个优点首先其检测方法敏感性较高在不包含任何 + 位点的引物序列中能检测到 1: 的甲基化水平此外它还具有高通量及其方法学可准确定量的特点 1, 在质谱分析前所做的实验可基于碱基特异性裂解或引物的延伸 1; 碱基特异性裂解法是利用一个标记有 7 启动子序列的引物进行扩增此法可使其 +2 扩增产物在体外转录成单链 23" 转录本后续的碱基特异性裂解法采用核糖核酸内切酶例如 23 " 通过非裂解的核苷酸使甲基化和非甲基化 + 位点产生不同的裂解模式然后用 "6$ 7. 质谱对裂解产物进行分析它通过信号强度对比来确定甲基化和非甲基化 $3" 的相对量在引物延伸阶段进行时 +2 引物延伸反应的完成是基于设计的引物能在检测的 + 位点邻近迅速退火与之结合然后该引物在含有 * 种不同终止子如双脱氧 37 的混合物中延伸根据 + 位点的甲基化的状况引物延伸反应在不同的核苷酸处终止同时用 "6$ 7. 质谱来检测时它们可产生不同的信号如果引物设计合理尽管是定量检测仍可有高达 )1 种不同引物延伸反应同时进行 1; 碱基特异性裂解法的目的是对大量未知甲基化区域进行检测而引物延伸法则须常规应用于数量相对较少且特征明确的已知 + 位点的检测这种方法的主要缺点是所需的仪器设备昂贵以及方法的复杂性使它较难应用例如由于没有实际序列的信息意外的单核苷酸多态现象的出现可能导致误译 + 和他的同事最近在某出版物上阐述了这个问题并证明了 "6$ 7. 质谱法可以确定检测到的甲基化序列是否是等位基因特异性的八多重甲基化检测在多重甲基化检测! #! 的方法中 ) 寡核苷酸阻断剂常被用于鉴别甲基化和非甲基化的等位基因引物被设计成用于与 + 富集序列杂交而设计的阻断剂只与非甲基化的 $3" 序列结合因此如果一个 $3" 序列是甲基化的那么阻断剂无法与之结合而空下的引物结合位点就可以与引物结合扩增就可以进行了用含有 + 位点及萃灭剂的荧光探针可以检测到扩增当多聚酶的外切酶活性裂解探针以后荧光基团从萃灭基团上解聚下来并发射出荧光图荧光强度与测试管中扩增子的量是成正比例的由此可以准确的定量甲基化的水平

7 * 海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 44 阻断剂分子的应用与使用 5 引物分析的方法相比显著提高了分析的敏感性多重甲基化检测法可以做到高通量密闭反应然而相对于传统的 5 检测方法将在下文中讨论它的优点主要是假阳性率极低因为在每一个 +2 循环反应中阻断剂的结合都是甲基化特异性的而在 5 中一旦扩增开始错配现象就有可能发生多重甲基化检测法的另一优点是引物与阻断剂设计的灵活性可以进行异种甲基化的检测三基于 5 引物的方法 5 引物被设计为仅用于扩增甲基化的 $3" 因此以为基础的方法导致的 +2 偏倚现象不再是一个问题这种特异性是通过使引物序列位于或靠近端处包含较多的 + 位点而达到的由于严格的 +2 条件仅甲基化的 $3" 才会发生扩增然而 5 测定通常具有较高的假阳性率 *- ) 尤其是当需要获得高度可分析的敏感测定时所必须进行的较高循环数的 +2 时错误的启动事件此过程中即使引物序列与模版错配扩增仍在进行和测试管中经重亚硫酸盐不完全置换的 $3" 分子可能是导致假阳性的原因错误的启始配对事件可以通过合适的阴性对照被检测到同时限制循环数和或采用较高的退火温度也是防止此类事件发生的方法不完全转化的分子可能会模拟甲基化序列这是由于 5 引物包含了多种从 + 位点而来的胞嘧啶虽然这一特性使得引物对甲基化的模版具有高度选择性但是它同时也使得重亚硫酸盐处理过的 $3" 中不完全转化的序列扩增成为可能采用具有多种非 + 胞嘧啶的 5 引物可能改善此问题一甲基化特异性 +2 在传统的 5 方法中第二套引物作为 5 引物的附加常被设计用于非甲基化 $3" 的扩增以使亚硫酸钠处理后可确认合适的模版的存在 +2 产物采用凝胶电泳检测测试管中既存在非甲基化 $3" 也存在甲基化 $3" 的情况下比较条带的浓度可以非常粗略的估计相对的甲基化水平用实时 +2 可以更精确的评估甲基化水平见下文但定量信息也可以通过基因分析器对荧光标记的扩增子进行分析而获得 * 1 5 是非常经济有效的但上述的假阳性结果均不能被检测到此外应避免打开 +2 管盖尤其是在临床环境中以减少 +2 污染的危险但是并不需要特殊的设备且方法简便易行鉴于以上原因 5 可在几乎任何实验室开展由此成为检测特定基因座的 $3" 甲基化最广泛使用的方法 5 因其高分析敏感性而著称在原始文献中有报道 5 可在过量的非甲基化 $3" 中检测到 -&: 的甲基化模版当使用成套的方法检测时这个数字可以微小到 -&---): 影响 5 检测的分析敏感性的因素还有引物的设计 +2 的循环数退火温度使用较少的循环数可以减少假阳性结果但是也削弱了分析敏感性同时使用设计合理的引物以及较高的退火温度可以防止错误的起始配对事件因此很多发表的 5 检测结果其分析敏感性千差万别二定量 5 甲基化荧光法荧光水解探针的使用使得 5 扩增可以实时, - 检测由此第一次实现了 5 的定量检测图 * 该方法通常被称为甲基化荧光法 #!6(# 解决了大部分 5 技术相关的问题首先只有当探针在引物之间被水解时才能检测到特异性产物扩增这样可以消除任何非特异性扩增信号比如引物二聚体基于上述原因甲基化荧光法事实上无须凝胶电泳是一种高通量的闭管式技术其次由于探针序列中包含额外的 + 位点错误的起始配对事件较少发生且不完全转化导致的假阳性也可被探针序列中富含非 + 的胞嘧啶所限制探针的引入使得检测方法的设计复杂化由于信号观测之前探针必须水解正确该方法可以检测到 5 法可能漏判的异质性甲基化序列甲基化荧光法的分析敏感度与 5 相当近来当应用数字化方法扩增单分子时敏感度能增加到 -&-1: - 所有基于 5 技术的定量检测方法所用的 $3" 是经过亚硫酸氢钠盐预处理过的因而需要一个对照基因以标准化 $3" 输入三定量 5 基于 5 2 荧光的方法采用荧光染料嵌入双链 $3" 的定量 5 技术可以无需荧光探针进行分析图 * 最初上述改变是通过在一个经凝胶电泳鉴定 +2 产物的方法中应用 5 2 染料而实现的由于所有测试管中的双链 $3" 都能被检测到引物二聚体的形成可能会影响定量结果的准确性 ) 这也就意味着需要 +2 之后的分析如凝胶电泳或毛细管电泳以确定扩增是否具有特异性在非定量熔解曲线 5 5 方法中同样可以在 +2 之后的熔解分析中应用 5 2 这样可以避免进行凝胶电泳但是由于 +2 后的熔解曲线分析的

8 海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 1 分辨力有限凝胶电泳不能提供的额外信息它也不能获得因此正如传统 5 技术一样熔解曲线分析法可能产生假阳性结果但是 5 的优势在于它是一种闭管式方法能实现高通量四定量 5 实时 5 后敏感的熔解曲线分析 5 " "27 5 的方法吸收了 2 技术的附加分辨能力以便检测出假阳性的结果因此 5 "27 5 也是基于双链 $3" 嵌入的荧光染料图 * 如果 +2 对于所测基因和对照的扩增效率相近实时 5 提供的量化数据就可以应用相应的 ) + 的定量方法进行分析 * 在 +2 后采用 2 步骤可以通过多种途径改善无探针的定量 5 测定这一验证的步骤可以提供凝胶电泳无法获得的信息并且由于错误的起始配对事件或不完全的转化导致的假阳性结果可以被检测到这种检测取决于扩增子的设计然而值得注意的是 2 分析可能只适合检测假阳性结果而不适合不完全的转化导致的高估甲基化水平的情况这是因为甲基化和完全转换的分子表达的信号将大大强于不完全转化分子 5 "27 5 可以检测到 -&: 甲基化模板由于此方法为闭管式操作故高通量是可能实现的且 +2 污染的风险较低五定量 5 甲基化特异性荧光扩增子发生 5.6" 另一种可以绕开附加探针的定量 5 方法近来被介绍在 5.6" 方法中 1 荧光信号由热稳定的核酸内切酶对 5 引物的裂解形成引物包含了一个寡核苷酸的 1 尾它携带荧光基团和淬灭剂并由核酸内切酶的识别位点分开直到引物退火多聚酶创建了目标基因的新拷贝双链识别的位点才产生图 * 5.6" 方法的定量准确性可由于引物二聚体的形成而受影响故而需优化引物的设计以避免此情况因此 +2 后的分析是需要的以便确定扩增是特异性的由于熔解曲线分析与该方法不相一致故使用凝胶电泳进行 +2 后的分析在分析灵敏度方面 5.6" 可媲美其他基于 5 的方法但由于荧光标记的引物和热稳定性核酸内切酶的使用导致其费用昂贵然而由于不需要额外的探针所以引物可以采用不同的标记设计多通道的 5.6" 检测以控制成本和劳动力也是可行的 1 四讨论癌症的早期发现往往能够改善临床预后人们已建立可以相对早期检测乳腺癌和前列腺癌的方法另一方面许多影像学和基于细胞学的检测方法已被证实不能早期诊断肺癌及其他癌症因此有必要研究新的分子学方法对癌前病变和微小恶性病变进行检测 ; 许多诸如 $3" 甲基化生物标志物这样的特定基因座都很可能成为备选尤其针对早期癌症的检测把癌症特定甲基化基因座作为癌症检测的生物标志物是合适的 ; 其原因如下首先 $3" 是一种能够从体液和组织中方便提取的稳定分子而 23" 的提取却要应用反转录 +2 其次含甲基化信息的 $3" 可以从福尔马林固定和石蜡包埋的组织中提取并在大多数以 +2 为基础的检测 $3" 甲基化的方法中使用第三检测的甲基化信号是阳性的不同于杂合子缺失以及基因表达变化的检测信号当的无关 $3" 过量存在时这两者的检测存在难度然而要使这许多 $3" 甲基化生物标志物应用于临床尚有大量工作要做因为现有的标志物往往缺乏作为诊断试验所要求的诊断敏感度和特异度由于假阳性结果会降低诊断特异性而假阴性结果会降低诊断敏感性故而诊断敏感度和特异度的缺失可能部分因为技术问题然而近期发现许多存在癌症特异性甲基化的新基因同时为特定目的研究建立具有较高诊断敏感度和特异度的标志物群的工作也在进行之中 + 位点的选择对于分析也很重要因为某些位点的甲基化状态更能有效地把健康组织同恶性组织区分开来此外对于 $3" 甲基化个体间的差异程度仍然未知因此很难界定哪些是典型的这不同于遗传事件我们已有参考序列基因水平的检测就更容易由于体液中肿瘤来源的物质常常难以检测在许多实际应用中常需要低检测限高敏感度的方法这些方法通常以 5 引物为基础然而它们也与假阳性结果有关我们可以通过在 #!6(# 方, 法中使用荧光探针或在 5 "27 5 方法中使用 2 来控制假阳性此外这些方法是定量的定量的数据可通过为甲基化水平设定阈值使得特定的标志物具有最高的诊断灵敏度和特异度当阈值降低时诊断灵敏度通常会升高而诊断特异度会降低

海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 44 非常敏感的特定基因座 $3" 甲基化检测不局限于 5 为基础的方法多重甲基化检测! #! ) 是一种以探针为基础的方法它使用寡核苷酸阻断剂使得甲基化 $3" 的检测具有可接受的分析特异性阻断剂的使用大大增加了分析敏感度此外由于在 +2 的每个循环中阻断剂都会提供分析特异性该方法的假阳性率非常低 5 2 是另一种以为基础的方法具有较高的分析灵敏度此外!

9 海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 44 非常敏感的特定基因座 $3" 甲基化检测不局限于 5 为基础的方法多重甲基化检测! #! ) 是一种以探针为基础的方法它使用寡核苷酸阻断剂使得甲基化 $3" 的检测具有可接受的分析特异性阻断剂的使用大大增加了分析敏感度此外由于在 +2 的每个循环中阻断剂都会提供分析特异性该方法的假阳性率非常低 5 2 是另一种以为基础的方法具有较高的分析灵敏度此外! #! 和 5 2 是定量方法不需要打开 +2 管因此这些方法的临床应用与 #!6(# 和 5 "27 5 具有可比性见表理想的情况是这些方法的检测结果具有不止一种方法进行验证然而由于不同方法存在内在差异由不同检测方法获得的结果无法做到相同对较少数量的标本常可采用测序的方法来验证以和 5 为基础的方法产生的结果但是对所有标本测序对大多数实验室来说既费时又昂贵五结论和展望在已有研究的 + 岛中对个体的 + 位点进行更详细的分析研究可能对于发现最有价值的位点如具有最高诊断特异度和灵敏度是必需的当前的文献中根据特定的测定方法选择特定的 + 位点作为最佳的引物位置已成为一种趋势这是由于对于个别分子的 + 位点的详细研究非常昂贵且耗时新兴的大规模的平行测序方法, 通常被称为下一代测序使获得大量的信息简单可行当下有个平台可供使用 5<.68 系统 *1* 测序被 *1* 生命科学称为 *1* 现被 2 # 收购 "!= 系统被 5 / 称

10 海外检验医学 )-- 年月第卷第期 4 6! ' 4 # )-- & 3& 为 5 / 现被收购 5 6$ 系统被 " '! 称为 5 6$ 这些新方法中首先被应用于重亚硫酸氢钠处理过的 $3" 的是 *1* 系统进行焦磷酸测序已有研究在 *- 个不同的非恶性与恶性的血液细胞样本中对于 )1 个基因相关的 + 岛进行了详细的甲基化研究 )* 这个初步的研究表明了此种方法采用重亚硫酸盐处理的 $3" 作为模版是可行的稳定的优良的该方法除了能提供超高通量的检测之外它还能提供精确的测序即使在重亚硫酸盐处理过的 $3" 中常存在的长链胸腺嘧啶也能精确测序该方法可以消除 +2 产物在细菌中进行亚克隆时产生的偏倚 * 同时与重亚硫酸盐测序分析相比可以有更多的个体克隆分子被分析 ) 这样 *1* 方法能快速准确的在已知的 + 岛中发现最具有信息价值的 + 位点因此它体现了临床应用的稳定合理对于开发诸如 #!6(# 5 "27 5! #! 和 5 2 等兼具分析敏感性和经济性的测试方法具有指导意义作者贡献! " #$ % "! && " $! '! % & " "!" # " &! " % "! $! "! &&$! &% " & 作者潜在利益冲突声明 & & % & "!!!(!&!! 雇佣关系 ) " "& 顾问和咨询 ) " "& 股票所有权 ) " "& 酬劳 ) " "& 研究基金 * + ",# " ""$ " -%!-! "& 专家意见 ) " "& 赞助商参与的工作.! " / & #" "! "#! " & $ ' " &!" && &&$! & & 致谢 0-1, "! & " "! & & 翻译周韵斓 4 邓琳 4 沈立松上海交通大学医学院附属新华医院检验科审校史红中华医学会杂志社参考文献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福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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