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丸卒从
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1 * 仅用于实验室, 不用于诊断和治疗请随时跟我们索取并使用最新版本的说明书 RNA 甲基化修饰试剂盒此品非常适合从细胞与组织等样本中提取的总 RNA, 进行 RNA 甲基化修饰操作, 整个实验时间仅需 3 小时目录号 : A-P-9003(50 次 100 次 ) 操作手册请以英文操作为准! 在您收到定购的产品时, 请确认操作手册是配套的! 同时, 有翻译不妥的地方还请各位老师批评指正! 反馈信箱 :tech@aderr.com 2013 年 11 月, 第 1 版, 对应英文第版艾德科技 ( 北京 ) 有限公司 A&D Technology Corporation -1-

2 目录表产品手册... 3 试剂盒组成... 3 运输和保存... 3 配套器材 ( 自备 )... 3 说明... 4 重点提示... 4 一般特性... 4 产品简介... 5 原理 / 步骤... 6 用法... 7 操作手册附录... 9 cdna 合成... 9 设置甲基化特异性 qmsp... 9 疑难解答定购信息推荐产品如何下单推荐阅读

3 试剂盒组成艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴组件 A-P (48 次 ) 保存条件 Conversion Buffer 8 ml 常温 Conversion Powder 5 瓶常温 NA Binding Solution 13 ml 常温 F-Spin Column 50 常温 F-Collection Tube 50 常温 Desulphonation Solution 300 ul 常温 Control Primer-F (10 um) 10 ul 20 C Control Primer-R (10 um) 10 ul 20 C Elution Buffer 1.2 ml 常温使用手册 1 常温 * 在放到微型离心机之前, 应将离心柱盖子盖紧运输和保存该试剂盒需加冰袋在 4 C 运输当您收到产品后 :1) 需在 20 C 储存如下的组件 :Control Primer-F and Control Primer-R; 剩余的其它组件室温保存在合适的保存条件下, 所有的产品组件有效期是 12 个月, 自购买之日算起配套器材 ( 自备 ) 带盖的热循环仪 ( 由于亚硫酸盐反应没有矿物油, 所以只有带加热模块盖子的循环仪适合这个步骤 ) 台式离心机 ( 可达 14,000rpm) 移液器和洗头 1.5 ml 离心管 100% 的乙醇 RNA 样本 -3-

4 重点提示艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴使用必读 : 使用 : 采用 RNA 甲基化修饰试剂盒处理得到的转化 RNA 对于像甲基化特异性 PCR, MS-HRM, 和亚硫酸盐测序如 : 焦磷酸测序和深度测序是非常理想的其中总 RNA 可以是来自哺乳动物, 植物, 真菌, 细菌和病毒等样本中得到的 RNA 输入量 : 对于每次亚硫酸盐实验 RNA 的输入量是 5 ng-1 ug. 最为理想的 RNA 的输入量应该是 ng 当使用 RNA 甲基化修饰试剂盒做甲基化特异性 RT-PCR 时,RNA 的输入量可以少至 <10 ng, 但是 PCR 循环数应该多于 45 RNA 处理后的得率取决于 RNA 的输入量, 自然的 RNA 量和起始材料来源起始材料 : 非常适合使用各种细胞和组织样本, 比如 : 来自培养瓶和微孔板培养的细胞, 新鲜和冷冻的组织, 石蜡包埋组织, 血液, 体液样本等等预防措施 : 为了避免交叉污染, 接下来的预防措施是非常有必要的 F-Spin Columns: 仔细地吸取样本或溶液到 F-Spin Columns 使用灭菌的枪头并在转移完不同的溶液时随时更换在将 F-Spin Columns 放到微型离心机前始终保证盖子是盖紧的在整个操作步骤中必须带干净的手套为了避免手套接触到样本, 应该理科更换手套说明一般特性质控 : 每批 RNA 甲基化修饰试剂盒的生产, 对既定的各个组件的生产把控, 确保了稳定的产品质量保证所有产品的性能描述都符合行业的产品标准 A&D Technology Corporation 保证所有的产品组件达到如说明书中所描述的功能质量保证 : 此品如果没有达到您的实验期望, 可以给我们的技术发送邮件到 :tech@aderr.com 我们也鼓励您随时与我们联系, 如果您有任何意见或新的应用领域及产品性能和技术安全 : 对于实验人员工作时, 实验室应配备安全的外套, 一次性手套, 和适当的防护眼罩产品更新 : A&D Technology Corporation 有权更改或修改任何产品, 以提高其性能和设计这个操作指南的信息是可能随时变更, 恕不另行通知因此, 此使用指南仅为提供此品用户时配套使用使用限制 : RNA 甲基化修饰试剂盒是为研究用途, 不适合诊断或治疗的应用知识产权 : RNA 甲基化修饰试剂盒中使用的原理和方法, 我司有产品使用的追索权 -4-

5 产品简介最新报道,5- 甲基胞嘧啶 (5-mC) 不仅广泛的存在于基因组 DNA 中, 在 RNA 中也普遍存在但是,RNA 甲基化的功能仍不清楚有些研究认为 RNA 甲基化在翻译调控中起着重要作用, 而有些研究认为其在 RNA 的稳定性及结构中起着重要作用在人类中, 5-mC 会出现在各种不同形式的 RNA 分子上, 包括 trnas,rrnas,mnras, 非编码 RNA(ncRNAs) 等至少有个的 5-mC 候选位点被发现在 mrnas 和 ncrnas, 它覆盖了 10.6% 残留在转录组的总胞嘧啶 5-mC 似乎浓缩在某些类型的 ncrna, 但相对缺乏 mrnas 然而, 绝大多数 (83%) 的候选位点中发现在 mrnas 在这些转录组上, 5-mC 似乎耗尽在蛋白质编码序列, 且浓缩在 5 和 3 UTRs 两个不同的甲基转移酶,NSUN2 和 DNMT2 已知催化 5-mC 修改在真核生物的 RNA 最近强有力的数据表明,RNA 胞嘧啶甲基化作用影响着调节各种生物过程, 如 RNA 稳定性与信使核糖核酸 (mrna) 的翻译此外, 损失 5-mC 在 vault RNAs 导致异常的处理成 Argonaute-associated 小 RNA 片段, 可以作为小分子核糖核酸 ( 即 microrna) 因此, 受损的处理的 vault ncrna 可能与导致人类疾病的病因 NSUN2-deficiency 人类疾病相关亚硫酸氢盐转化 RNA, 紧接着是 RT-PCR 扩增克隆和可信的测序分析, 来收集可靠的关于 RNA 胞嘧啶甲基化状态的信息, 变得尤为重要由于 RNA 的不稳定性, 导致对于 RNA 的研究十分困难为此, 我公司给您强烈推荐 RNA 甲基化修饰试剂盒, 解决了如上的问题该产品包括了进行修饰所有必要组件, 独特设计的混合液配方包含了 RNA 的保护剂, 以防降解这样有效保证了胞嘧啶转化成尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶几乎不受影响无毒的 RNA 紧紧的结合在离心柱基质上, RNA 可以有效去除残余的亚硫酸氢和盐, 得到纯净的修饰 RNA 洗脱后的 RNA 可以用于做 qmsp( 即 RT-PCR), 克隆,MS-HRM 和测序分析 ( 如 : 焦磷酸分析和深度测序 ) 等各种 RNA 甲基化后续实验分析产品功能简介如下 : 有效且高效地准备转化好的 RNA 用于各种下游实验分析 A&D Technology Corporation 与合作伙伴 EPI. 合作开发的 RNA 甲基化修饰试剂盒这个工具是专门为亚硫酸氢盐转化和验证 RNA 而设计的, 具有如下的优势和特性 : 快速简便的操作流程仅需 3 小时将未甲基化的 RNA 胞嘧啶 (C) 完全转化为尿嘧啶 (U), 转化率 >99.9% ; 不当或错误的转化率 <0.1% ( 甲基化胞嘧啶转化成胸腺嘧啶 ) 强给力的 RNA 保护剂有效防止了 RNA 的降解, 保护了 >90% 的 RNA 包括的对照引物是专门针对特异转化后的 RNA 设计的, 可以用来测试其是否完全正确的实现了亚硫酸盐转化可用于亚硫酸盐转化的 RNA 低至每次反应 5 ng 简单可信和实验条件始终如一 -5-

参考文献 : 1. Niu Y et al: Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 11:2013. 2. Cantara WA, et al. NucleicAcids Res. 2011; 39: D195-201. 3. Motorin Y, Helm M.Nucleic Acids Res. 2010;38(5): 1415-1430. 4.

Alexandrov A, et al. MolCell. 2006; 21(1): 87-96. 8. Schaefer M, et al. GenesDev. 2010; 24(15): 1590-1595. 9. Helm M. Nucleic AcidsRes. 2006; 34(2): 721-733 10. Motorin Y, Helm M.Biochemistry.

6 参考文献 : 1. Niu Y et al: Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 11: Cantara WA, et al. NucleicAcids Res. 2011; 39: D Motorin Y, Helm M.Nucleic Acids Res. 2010;38(5): Squires JE, Preiss T.Epigenomics. 2010; 2(5): Chow CS, et al. ACSChem Biol. 2007; 2(9): Baudin-Baillieu A, et al.nucleic Acids Res. 2009;37(22): Alexandrov A, et al. MolCell. 2006; 21(1): Schaefer M, et al. GenesDev. 2010; 24(15): Helm M. Nucleic AcidsRes. 2006; 34(2): Motorin Y, Helm M.Biochemistry. 2010; 49(24): 原理 / 步骤 RNA 甲基化修饰试剂盒包括了所有定性修饰总 RNA 样本的必要试剂独特转化试剂包含了 RNA 保护剂, 有效防止了化学试剂和嗜热试剂的降解这样提高了胞嘧啶转化为尿嘧啶的效率, 胞嘧啶脱氨基作用可以可以忽略不计无毒的 RNA 捕获溶液增强了 RNA 结合在柱基质上的能力, 这样转化后的 RNA 可以有效地被洗脱同时将亚硫酸氢盐和盐分彻底清除更值得一提的是, 在这个试剂盒中我们配套的提供了一对特异性的甲基化引物, 极大地方便了您进行 qmsp( 甲基化定量 PCR) 分析 RNA 测序分析从 MCF-7 细胞中提取 RNA, 经亚硫酸盐处理针对处理后的 RNA, 使用 28s RNA 引物特异扩增后, 合成 cdna 并测序未甲基化的 C(#4 #5 #14) 转化成 U, 经扩增 T 后, 测序检测而甲基化的图示 :RNA 甲基化修饰试剂盒 C(#8) 仍保持不变 -6-

7 用法艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴操作手册为了得到最好的实验结果, 在实验开始前, 请通读这个操作手册起始材料 : RNA 输入量 :RNA 每次反应量范围在 5 ng-1 ug 最佳输入量是每次 ng. 起始的 RNA 应该是在水中或是溶液中比如 :TE RNA 应该是高质量的并无或很少 DNA 的污染可以使用 DNase I 去除 DNA 你可以使用自己的办法来提取 RNA 当然, 此手册后附有 RNA 提取的相关产品 RNA 储存 : 提取好的 RNA 可以储存在 -20 C( 短期 ) 或是在 -80 C( 长期 ) 直到使用为止 1. 溶液和试剂制备 : a. 制备转化溶液 : 添加 1.4 ml 的 Conversion Buffer 和 40 ul 的 Desulphonation Solution 到 1 瓶 Conversion Powder 得到转化液通过 WB(10X Wash Buffer) 到 117 ml 的蒸馏水 ( 最终 ph ) 中 96 次试剂盒 : 添加 26 ml 的 WB(10X Wash Buffer) 到 234 ml 的蒸馏水 ( 最终 ph ) 中这个稀释的 WB 1X Wash Buffer 现在可以储存在 4 C 可达 6 个月 b. 通过添加 3 ml 的蒸馏水到 7 ml 的 100 % 乙醇来制备 70 % 的乙醇 c. 通过添加 1 ml 的蒸馏水到 9 ml 的 100 % 乙醇来制备 90 % 的乙醇 d. 制备 desulphonation buffer 的工作液 : 首先, 以 1:12 比例稀释 Desulphonation Solution( 如 : 添加 5 ul 的 Desulphonation Solution 到 55 ul 的蒸馏水中 ) 其次, 添加 2 ul 的稀释的 Desulphonation Solution 到每个 1 ml 的 90 % 乙醇, 并混合 2. RNA 亚硫酸盐处理 : a. 添加 100 ul 的转化液到 PCR 管子中, 然后添加 2-10 ul 的 RNA 样本合液在 -20 C 制备好的转化液可以储存 2 周, 效率没有下降为了得到更好的结果, 建议立即使用混 b. 紧紧的盖上 PCR 管子并将它放进带盖的热循环仪设置并执行循环仪 -7-

8 温度时间 65 C 5 分钟 60 C 90 分钟 4 C 长达 16 小时同时, 根据你实验的需要数量, 预先将 F-Spin Columns 放进 F-Collection Tubes 3. 转化后 RNA 纯化 : a. 添加 250 ul 的 NA Binding Solution 到每个柱子中, 然后从每个 PCR 管子 ( 从第 2b 步 ) 中转移样本到装有 NA Binding Solution 的柱子中以 12,000 rpm 离心 1 分钟从收集管上移走柱子并丢弃滤出液再次将柱子放回到收集管中 b. 添加 200 ul 70% 的乙醇到柱子中以 12,000 rpm 离心 1 分钟 c. 添加 200 ul 的工作液 (Desulphonation Solution 和 90 % 乙醇混合 ) 到每个柱子中室温容许柱子放置 30 分钟, 然后以 12,000 rpm 离心 1 分钟从收集管上移走柱子并丢弃滤出液再次将柱子放回到收集管中 d. 添加 200 ul 的 90% 乙醇到每个柱子中以 12,000 rpm 离心 1 分钟从收集管上移走柱子并丢弃滤出液再次将柱子放回到收集管中再次添加 200 ul 的 90% 乙醇到每个柱子中并 12,000 rpm 离心 1 分钟 e. 将每个柱子套在新的 1.5 ml 管子中直接添加 ul 的 Elution Buffer 到柱基质上以 12,000 rpm 离心 1 分钟来洗脱转化的 RNA 现在, 转化的 RNA 可以用来使用, 或储存在 20 C 达 2 个月正如转化的 RNA 不是很稳定, 在进行下一个应用程序或储存前, 我们推荐从转化的 RNA 进行 cdna 的合成参考附录 1 中 cdna 的合成 -8-

9 附录艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴 1. cdna 合成你可以使用你自己的方法来合成 cdna 为了实验便利,A&D Technology Corporation 提供了高保真 cdna 合成试剂盒 ( 货号 :A-P-9004), 它是经过优化和验证的, 与亚硫酸盐处理的 RNA 是互补的 a. 在冰上添加如下的内容到 0.2 ml PCR 管中 : 组件数量 Bisulfite-converted RNA ( ng) 10 ul Random primer (50 um) 1 ul 10 mm dntp mix 1 ul b. 在热循环仪上 65 C 热激 3 分钟立刻在冰上放置至少 1 分钟 c. 在冰上添加如下的内容到管子中 : 5X RT Reaction Buffer 4 ul 0.1M DTTl 2 ul RNase Inhibitor 1 ul RT Enzyme Mix 1 ul Total Volumn 20 ul 涡旋样本进行简单混合, 通过短暂离心, 收集孵育如下 :42 C 45 分钟, 紧接着 80 C 5 分钟 ( 不加热盖 ) 在 -20 C 储存合成 cdna 反应液, 或直接进行下一个应用程序, 如甲基化特异性 PCR( 参考附录 2 中的甲基化特异性 qpcr) 或甲基化测序等 2. 设置甲基化特异性 qpcr 当使用甲基化特异性 PCR 时, 我们推荐使用快速 MS-qPCR 试剂盒 ( 货号 :A-P-1028), 它包含优化的热启动酶系统并减少了甲基化特异性 qpcr 的时间 2X 浓度预混的酶只需添加引物和模板, 即可以进行 PCR 反应在这个试剂盒中,qMSP 仅需要 70 分钟即可完成准备 PCR 反应 : 组件 Size(ul) 终浓度 Methylamp Master Mix (2X) 10 ul 1X Forward Primer 1 ul M Reverse Primer 1 ul M cdna Template 1-2 ul 50 pg-0.1 ug RNase-free H2O 6-7 ul Total Volume 20 ul -9-

10 对于阴性对照, 可以使用 RNase-free water 代替 cdna 模板 PCR 反应程序循环设置温度时间循环数 Activation 95 C 7 分钟 1 Cycling 95 C 10 秒 C 72 C 10 秒 8 秒 Final Extension 72 C 1 分钟 1 凝难解答出现的问题可能的原因建议解决方法在阳性对照和样本孔中无信试剂被不正确的加入确保试剂加入的恰当顺序, 可能在操作中省略的任何步骤号在 RNA 结合前孔被不当的清洗确保在添加阳性对照和样本前, 孔不被清洗孔的底部没有被 BS( 结合液 ) 完全覆盖通过从一边到另一边轻柔的或轻轻的摇晃板子几次来让溶液覆盖孔的底部孵育时间和温度不正确确保孵育时间和温度像操作手册中描述的被正确的加入不正确的材料输入确保足够的阳性对照 (>0.2 ng) 和样本 (200 ng) 被加入到孔中不正确的读取吸光值检查酶标仪是否采用恰当的波长 (450 nm) 读取试剂盒被不恰当的储存或不当的处理确保试剂盒所有的组件是采用恰当的温度储存并在每次使用完后将盖子盖紧仅 PC( 阳性对在第 3c 步没有添加足够的 PC 确保添加足够的 PC( 阳性对照 ) 照 ) 孔中无信号或微弱信号 ( 阳性对照 ) 到孔中由于不恰当的储存条件导致 PC ( 阳性对照 ) 降解遵守操作手册中对于 PC( 阳性对照 ) 运输和储存条件的说明在阴性对照孔没有足够的清洗孔中存在高背景样本或阳性对照受到污染孵育时间太长 -10- 根据操作手册检查是否每一步都进行了清洗确保孔没有被样本或阳性对照或来自任何吸头的污染确保在第 3d 步中孵育时间没有超过 2 小时

11 仅在样本孔无信号或微弱信号过度的显色时间过度显色在第 5b 步中添加 SS( 阻止液 ) 减少第 5a 步中的显色时间不正确的提取或纯化 RNA 确保 RNA 样本是高质量的 260/280 比值应该 >1.9 且无或很少 DNA 的污染加入到孔中的样本量不够确保在第 3c 步骤中使用了足够的 RNA 数量样本中包含很少或无 m 6 A N/A 孔没有足够的清洗净根据操作手册确保清洗干净孔确保清洗缓冲液的残留尽可能的清洗干净延迟显色或阻断孔的显色确保显色溶液或阻断溶液是按照顺序加入的, 并采用与操作手册一致的顺序添加其他的试剂 ( 如 : 从孔 A 到 G 或从孔 1 到孔 12) -11-

12 定购信息艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴货号品名规格 A-P-9003 RNA 甲基化修饰试剂盒 50 次 100 次 A-P-9005 m6a RNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 比色法 ) 48 次 96 次 A-P-900X m6a RNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 48 次 96 次 A-R5001 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒 50 次 A-R5002 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒 200 次推荐产品 RNA 和 microrna 样本的制备 : 货号品名规格 A-R1202 A&D TRIpure 高纯总 RNA 快速提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 100 次 A-RH110 细胞 / 组织总 RNA 提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 200 次 A-R5311 石蜡包埋组织 microrna 快速提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 100 次 A-R4002 A&D 血液总 RNA 快速提取试剂盒 ( 液体样本, 离心柱 ) 50 次 100 次 A-RH710 血液总 RNA 小量提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 200 次 A-R5908 血液 ( 液体样本 )microrna 快速提取试剂盒 III 型 ( 柱型 ) 50 次 100 次 A-R3202 多糖多酚植物总 RNA 快速提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 100 次 A-R3302 A&D 通用植物总 RNA 提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 50 次 100 次 A-RH130 植物总 RNA 提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 200 次 A-R5331 通用植物 microrna 快速提取试剂盒 ( 柱型 ) 50 次 100 次特定基因 DNA 甲基化定性定量试剂盒和全基因组 DNA 甲基化定量试剂盒 : 货号品名规格 A-P-1016 DNA 甲基化直接修饰试剂盒 40 次 80 次 A-P-1026 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 50 次 100 次 A-P-1028 快速 MS-qPCR 试剂盒 100 次 200 次 A-P-1029 Epiquick qpcr 快速试剂盒 100 次 200 次 A-P-1034 DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 比色法 ) 48 次 96 次 A-P-1035 DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 48 次 96 次 A-P-1036 DNA 羟甲基化定量检测试剂盒 ( 比色法 ) 48 次 96 次 A-P-1037 DNA 羟甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 48 次 96 次相关产品货号品名规格 A-P-9004 高保真 cdna 合成试剂盒 50 次 100 次 A-BC121 DNase I(RNase-free)(2 U/ul) 2000U 10000U A-RH113 总 RNA 提取试剂盒 50 次 200 次 A-RQ110 A&D Pur-zol Reagent 100ml 200ml A-E2001 ZymoTaq DNA Polymerase 50 次 200 次 -12-

13 如何下单 1. 电话, 传真或邮件定购 : 技术电话 : ; 传真 : ; 邮件 : ordering@aderr.com 2. 在线定单定购 : 推荐阅读 1. RNA 甲基化修饰和定量? 惊呆了我和小伙伴们!!! 2. A&D Technology Corporation 解码神秘的 RNA 第 5 个碱基 ---m6a(n6-methyladenosine) 3. 艾德科技史上最全表观遗传学产品线与服务, 让你的研究冰爽一夏! 4. 新四大碱基的确定, 对于生物学研究者的几点启示! 5. 科学家发现新型 DNA-microDNA! 6. 艾德科技为您提供一站式的产品与服务! 7. A&D Technology Corporation 长期供应下一代超高敏测序系列产品!

14 艾德科技 ( 北京 ) 有限公司 A&D Technology Corporation 地址 : 北京昌平区中关村生命科学园东 60 米 (102206) 电话 : 传真 : 网址 : tech@aderr.com -14-

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ibm * 仅用于实验室, 不用于诊断请随时跟我们索取并使用最新版本的说明书 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒此品非常适合从细胞与组织等样本中提取的总 RNA, 进行 RNA 甲基化修饰, 整个实验时间仅需 3 小时目录号 : A-R5001(50 次 ) A-R5002(200 次 ) 操作手册在您收到定购的产品时, 请确认操作手册是配套的! 同时, 有翻译不妥的地方还请各位老师批评指正! 反馈信箱