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1 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统 应用文集

2 前言 Agilent 129 Infinity 液相色谱应用文集 基于 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统, 安捷伦科技公司采用新技术开发了高效液相色谱系统 (HPLC) 以及超高性能液相色谱系统 (UHPLC), 可为您的每次测试提供更高的分离度 更高的灵敏度和更多的灵活性 本文集包含了安捷伦公司为各种行业和应用领域使用新型 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统而开发的一系列主要的超高效液相色谱应用方法, 并针对每一种应用, 对分析设备 色谱柱 分离介质以及色谱分离条件进行了详细说明 所有推荐采用的解决方案也都给出了实例 配置概况和方法说明 本文集还详细描述了 Agilent 129 Infinity 二元泵 Agilent 129 Infinity 温控柱温箱和 Agilent 129 Infinity 二极管阵列检测器的性能特点 通过 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统应用文集, 您可以为您的应用开发找到合适的初始条件, 并使您可简单 正确和完整的订购整套高效液相色谱系统, 因此可满足您的要求和应用需要 2

3 目录 前言 - Agilent 129 Infinity 液相色谱系统应用文集 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统 : 更强大, 更高灵敏度, 更具灵活性 应用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统进行植物油中合成抗氧化剂的超快速分析....7 应用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统进行胰蛋白酶的消化分析 应用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统为柑橘油中呋喃香豆素 5- 甲氧基补骨脂素 (5-MP) 和 8- 甲氧基补骨脂素 (8-MP) 的测定开发一种绿色液相色谱方法 应用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统提高盐酸甲氧氯普胺制剂中杂质的分析效率..23 药品主要代谢物的软件辅助高通量鉴定 Agilent 129 Infinity 超高性能液相色谱系统在环保中的应用 : 色谱技术的发展 应用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统进行精细化学品中的杂质筛查 应用 Agilent 129 Infinity 液相色谱超高性能液相色谱系统, 通过反相高效液相色谱进行完整甘油三酸酯的高分离度分析 通过将超高效液相色谱柱压力增至 12 巴来提高分离度和速度 在一个超高效液相色谱 (UHPLC)- 三重串联四极杆液相色谱 / 质谱系统中, 通过盒式分析和极性切换进行代谢稳定性研究 体外代谢药物高通量分析中离子聚焦电喷雾扩展离子化能力 采用超高效液相色谱 / 三重串联四极杆质谱联用仪开发高通量生物分析方法

4 采用 Agilent 129 Infinity 液相色谱和 Eclipse 多环芳香烃 (PAH) 色谱柱进行多环芳香烃的快速分析 采用 Agilent 129 Infinity 液相色谱和 ZRBAX 快速分离高通量和超高压快速高分度 1.8 微米色谱柱进行脂溶性维生素的快速分析 采用 Agilent 129 Infinity 液相色谱和 ZRBAX 快速分离高通量和超高压快速高分度 1.8 微米色谱柱实现复杂液体 ( 甘油三酸脂 ) 的高分离度分析 采用 Agilent 129 Infinity 液相色谱和 ZRBAX 快速分离高通量和超高压快速高分度 1.8 微米色谱柱进行精细化学品辛基 - 二甲基 氨基苯甲酸甲酯的杂质分析 新的动态多反应监测模式改善复杂分析中数据质量和三重串联四极杆质谱定量 Agilent 129 Infinity 二元泵的性能特点在传统的表面多孔径亚 -2 微米色谱柱填料基础上实现更高的分离度和速度 Agilent 129 Infinity 温控柱温箱的性能特点新的快速转换阀 两个可达 1 C 的加热区提高了仪器实用性 Agilent 129 Infinity 二极管阵列检测器的性能特点低噪音 低折射率 高速度和数据安全性

5 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统 : 更强大, 更高灵敏度, 更具灵活性 Agilent 129 Infinity 液相色谱具备全新的先进流体输送系统, 足以应对任何超高效液相色谱或高效液相色谱相关的挑战, 为我们打开了一扇通向几乎无限分离度和通量可能性的大门 为了实现超高效液相色谱分析和常规高效液相色谱分析无与伦比的检测器灵敏度, Agilent 129 Infinity 二极管阵列检测器中带有微流控光学波导的安捷伦最大光强卡套式流通池可将光传输效率提高至接近 1%, 而不引起由流通池色散效应造成的分离度的降低 此外, 由于几乎完全消除了折射率和热效应的影响, 从而最大限度地减少了基线漂移 基于先进的直通式设计,Agilent 129 Infinity 自动进样器可实现大体积和小体积样品的高精确度进样, 而无需更换定量环 Agilent 129 Infinity 温控柱温箱的温控范围为低于室温 1 C 到 1 C, 提供了无限卓越的灵活性, 从而可对分离的速度和选择性进行优化 新的安捷伦快速转换阀则为开发超高通量 多方法模式和自动方法模式的解决方案铺平了道路 无限强大的功能 Agilent 129 Infinity 二元泵为您提供了最佳的性能表现 兼容性以及灵活性 通过新型安捷伦 Jet Weaver 混合器中多层技术实现的主动阻尼和最低延迟体积技术为您的色谱提供了超高速梯度功能以及液相色谱 / 紫外联用仪和液相色谱 / 质谱联用仪时的优越性能 无限高的灵敏度 Agilent 129 Infinity 二极管阵列检测器采用了创新的光学设计 - 包括带有微流控光学波导的安捷伦最大光强卡套式流通池, 使紫外灵敏度和基线稳定性高到一个新的水平 对于液相色谱 / 质谱联用仪, 安捷伦喷射流热聚焦技术可通过改善电喷雾液滴的空间聚焦而显著提高质谱仪和质谱 / 质谱联用仪仪的灵敏度 无限高的灵活性 Agilent 129 Infinity 温控柱温箱中的新型快速转换阀实现了节约资源的超高通量 多方法和自动方法开发解决方案 一个全新的模块 - 安捷伦 129 Infinity Flexible Cube 可以使用定量环进样模式, 实现超快的循环周期, 或针座自动反冲, 将交叉污染降到了最低 5

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7 应用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统进行植物油中合成抗氧化剂的超快速分析 应用报告 食品 作者 Gerd Vanhoenacker, Frank David, Pat Sandra Research Institute for Chromatography Kennedypark 26 B-85 Kortrijk Belgium ,4,5-2,4, ,6-3,4,5-3,4,5-3, min 摘要 欧洲和美国对食用植物油中添加合成抗氧化剂进行了规范 其官方方法即采用了超快速液相色谱方法, 可通过配备安捷伦 ZRBAX 超高压快速高分度 (RRHD) 色谱柱的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统实现 在低于色谱柱 12 巴背压上限的 112 巴压力下,2 分钟内即可获得高通量 本文对流动相组成和温度的优化进行了讨论 通过使用标准方案和加标植物油 ( 向日葵 油菜籽 橄榄 ) 萃取物获得了优异的数据 植物油样品的检测限为 1 毫克 / 千克或者更低 当采用简单的甲醇萃取时, 在植物油样品中均获得了良好的抗氧化剂回收率 CHCN 7

8 前言 脂质氧化可导致食品的酸败和异味问题, 并降低食品的营养价值 因此, 人们常常在食品中添加合成的抗坏血酸棕榈酸酯及酚类抗氧化剂, 以防止油脂中不饱和脂肪酸的氧化, 并通常采用复合抗氧化剂来提高抗氧化作用 本文所研究的抗氧化剂的结构和名称缩写如图 1 中所示 欧洲 ¹ 和美国 ² 的监管机构对其中一些抗氧化剂的使用进行了最高量限制, 而其它抗氧化剂的使用则已经被禁止了 因此, 在食品和食品成分中进行抗氧化剂的测定是一项非常重要的分析工作 各抗氧化剂检测限列于表 1 中 H H C 3 H 7 H 3,4,5- (PG) H H (TBHQ) C(CH 3 ) 3 C(CH 3 ) 3 H H H (H 3 C) 3 C C(CH 3 ) 3 (H 3 C) 3 C 3, (BHT) H H H 3,4,5- (G) H C 8 H 17 C 12 H 25 H (NDGA) H H C(CH 3 ) 3 2,6- (Ionox-1) H H 3,4,5- (DG) H H HH H H C 3 H 7 H 2,4,5- (THBP) (BHA) H H H (AP) C(CH 3 ) 3 C 15 H 31 图 1 本文所研究的抗氧化剂的结构和代码 抗氧化剂 欧洲 1 美国 2 抗坏血酸棕榈酸酯 合格量 没有限制 3,4,5- 三羟基苯甲酸丙酯 ~2 毫克 / 千克, ~2 毫克 / 千克, 3,4,5- 三羟基苯甲酸辛酯 单独添加或复合添加 单独添加或复合添加 3,4,5- 三羟基苯甲酸十二酯 2- 和 3- 叔丁基 -4- 羟基苯甲醚 3,5- 二叔丁基 -4- 对甲苯酚 ~1 毫克 / 千克 叔丁基对苯二酚 不允许使用 2,4,5- 三羟基苯丁酮不允许使用不允许使用 去甲二氢愈创木酸不允许使用不允许使用 2,6- 二叔丁基对甲苯酚不允许使用不允许使用 表 1 欧洲和美国对食用油中抗氧化剂的使用限制 CHCN 8

9 测定食用油中抗氧化剂的官方方法采用了 15 至 25 厘米长 内径为 4.6 毫米 装填有 5 微米粒径十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱 流动相由稀释醋酸或磷酸 ( 洗脱液 A) 和体积比为 5/5 的甲醇 / 乙腈溶液 ( 洗脱液 B) 组成 分析时间为 15 至 25 分钟 在本应用中, 分析速度的提高是由两个原因造成的 首先, 已报道的一些目标物 ( 例如抗坏血酸棕榈酸酯 ) 的不稳定性和样品在自动进样器中的长时间停留造成了化合物的显著降解 Perrin 和 Meyer 报道了采用柠檬酸和异抗坏血酸来提高样品和标准溶液稳定性的方法 4 他们的方法能使抗坏血酸棕榈酸酯在室温下稳定存放 7 个小时 然而, 食用油质检实验室和脂肪加工产业对提高分析速度的需求已越来越迫切 抗氧化剂的添加与否以及抗氧化剂的检验都必须在装卸油脂之前进行 出于经济和实际需要的考虑, 人们期望能够得到一个快速 准确和高精密度的分析结果 本应用报告详细阐述了如何应用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统进行植物油中 1 种抗氧化剂的分析 通过优化流动相的组成和温度, 将传统的方法转化为高通量方法 应用该方法分析了植物油和加标植物油萃取物, 并获得了优异的数据 实验 仪器和方法 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统, 其设置如表 2 中所示 : 部件号 G422A G4226A G1316C G4212A 方法参数 : 部件简述 集成真空脱气机的 Agilent 129 Infinity 二元泵 Agilent 129 Infinity 自动进样器 Agilent 129 Infinity 柱温箱 溶液和样品 安捷伦 129 Infinity 二极管阵列检测器 根据 Perrin 和 Meyer 的方法制备样品和标准溶液 标准物和萃取物的溶剂是一种含柠檬酸 (1 毫克 / 毫升 ) 和异抗坏血酸 (1 毫克 / 毫升 ) 的甲醇溶液 对于加标样品, 在萃取之前, 要先加入以上述甲醇溶液为溶剂的抗氧化剂母液 称取 1g 植物油, 加入 1 毫升溶剂进行萃取 将该混合物在旋涡混合器上旋涡处理 3 秒, 静置 2 分钟后再旋涡处理 3 秒 再将样品在离心机中以 5 g 的速度离心处理 5 分钟, 将上清液转移至自动进样瓶中等待进样 色谱柱 ZRBAX 超高压快速高分度 Eclipse Plus C18 色谱柱,5 毫米 2.1 毫米内径, 1.8 微米粒径 流动相 A =.2% 磷酸水溶液 B = 体积比为 5/5 或 75/25 的乙腈 / 甲醇溶液 流速 可变 梯度 可变 温度 可变 进样 2 微升 检测 二极管阵列检测器 (DAD),4 或 8 赫兹 酚类抗氧化剂 信号 28/1 纳米, 参比 4/5 纳米 抗坏血酸棕榈酸酯 信号 255/1 纳米, 参比 4/5 纳米 表 2 条件 CHCN 9

10 结果与讨论 首先使用官方方法中的流动相进行分析 流速设定为适中的.4 毫升 / 分钟, 分析时间为 8 分钟 ( 如图 2A 中所示 ) 合成酚类抗氧化剂均在 28 纳米处被检测到, 而抗坏血酸棕榈酸酯 (AP) 则在 255 纳米处被检测到 然后, 洗脱液 B 的组成由体积比为 5/5 的甲醇 / 乙腈调节为 75/25, 从而降低粘度和加快分离速度 在优化好流动相组成后, 选择性发生了很大的变化, 为了使所有的目标氧化剂之间达到完全分离, 又对温度进行了优化 值得注意的是, 与图 2A 中所示的 3 C 时的洗脱顺序相比, 在 45 C 时,3,4,5- 三羟基苯甲酸十二酯 (DG) 与 3,5- 二叔丁基 -4- 对甲苯酚 (BHT) 的洗脱顺序发生了反转 所有化合物在柱温为 45 C 时均可稳定存在 提高温度的另一个好处是背压下降了 当流速提高到 1.9 毫升 / 分钟时, 最后一个色谱峰在 1.5 分钟之前洗脱出, 此时的柱压为 112 巴 ( 如图 2C) A B C 甲醇 / 乙腈 5/5 75/25 75/25 比例 (v/v) 流速.4 毫升 / 分钟.4 毫升 / 分钟 1.9 毫升 / 分钟 梯度 -7.5 分钟 :35-1% B -7.5 分钟 :3-1% B -1.6 分钟 :3-1% B 温度 3 C 45 C 45 C 检测器速度 4 赫兹 4 赫兹 8 赫兹 最大压力 375 巴 27 巴 112 巴 A. B PG THBP TBHQ NDGA BHA THBP Ionox-1 G DG BHT AP min C. PG TBHQ NDGA BHA Ionox-1 G DG BHT AP min 8 THBP PG TBHQ NDGA BHA Ionox-1 G DG BHT AP min 图 2 在不同条件下对 1 微克 / 毫升标准溶液的分析 CHCN 1

11 我们对这种超快速分析方法的性能进行了评估, 其结果列于表 3 中 首先, 采用抗氧化剂的标准溶液研究了该方的法重现性和线性 所有抗氧化剂的检测限均等于或小于.1 微克 / 毫升, 这相当于植物油或脂肪样品中的抗氧化剂含量大约为 1 毫克 / 千克或更低 对植物油和加标植物油的萃取物进行了分析, 以检测该方法的回收率和准确性 植物油样品分别采用不同抗氧化剂进行加标处理, 加标浓度为 1 或 5 毫克 / 千克, 并将萃取物的测定含量与标准溶液在相同浓度下进行比较 标准溶液和加标植物油样品的快速分析色谱图如图 3 中所示 在色谱图中可看到由植物油基质成分产生的附加峰, 但并没有对分析造成太大干扰 大多数干扰峰存在于橄榄油样品中, 但是 1 毫克 / 千克加标橄榄油样品仍然可以与未加标样品区分开来, 其回收率也是令人满意的 ( 如表 3 中所示 ) 重现性 (% 相线性回收率 1 毫克 / 千克回收率 5 毫克 / 千克对标准偏差 ) (1) (R²) (2) (%) (%) 葵花籽油菜籽油橄榄油葵花籽油菜籽油橄榄油 3,4,5- 三羟基苯甲酸丙酯 ,4,5- 三羟基苯丁酮 叔丁基对苯二酚 去甲二氢愈创木酸 和 3- 叔丁基 -4- 羟基苯甲醚 ,6- 二叔丁基对甲苯酚 ,4,5- 三羟基苯甲酸辛酯 ,4,5- 三羟基苯甲酸十二酯 ,5- 二叔丁基 -4- 对甲苯酚 抗坏血酸棕榈酸酯 (1) 连续 6 次注入 1 微克 / 毫升标准溶液 (2).1,.2,.5, 1, 1 微克 / 毫升标准溶液, 每个浓度水平进样一次 表 3 超快速分析方法的性能数据 CHCN 11

12 结论 应用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统, 开发了植物油中抗氧化剂检测的超快分析方法 在背压为 112 巴时, 分析时间可缩短至 2 分钟以内 我们采用标准溶液研究了高通量方法的性能 ( 重现性 线性 检测限 ) 对植物油样品和加标植物油样品进行了萃取, 并计算了抗氧化剂的回收率 结果表明, 所有抗氧化剂的回收率都是令人满意的 本研究所建立的方法对要求快速得出结果的实验室非常有用 参考文献 1. European Parliament and Council Directive No. 95/2/EC (1995) 2. Encyclopedia of Food Color and Additives, Vols. I, II, and III, Burdock G., CRC Press, Boca Raton (1997). 3. fficial Methods of Analysis of AAC International, 17th edition, AAC fficial Method , W. Horwitz ed., AAC International, Gaithersburg (2). 4. Perrin C., Meyer L., J. Am. il Chem. Soc., 8 (23) ,4,5-3,4, ,6-3,4,5-3,4,5-3, ,4,5-3,4,5-3,4,5-3,4,5-3,4,5-3,4, ,6-3,4,5-2,6-3,4,5-2,6-3,4,5-3,4,5-3, ,4,5-3, ,4,5-3, 图 3 采用快速方法分析标准溶液 (1 微克 / 毫升 ) 和加标植物油 (1 毫克 / 千克 ) 萃取物 CHCN 12

13 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统分析胰蛋白酶酶解产物 应用报告 药物开发 生产 QA/QC 作者 Gerd Vanhoenacker, Frank David, Pat Sandra Research Institute for Chromatography Kennedypark 26 B-85 Kortrijk Belgium Koen Sandra Metablys Kennedypark 26 B-85 Kortrijk Belgium min min min Bernd Glatz and Edgar Naegele Agilent Technologies R&D and Marketing GmbH and Co. KG Hewlett-Packard-Str Waldbronn Germany 摘要 本应用报告表明 : Agilent 129 Infinity 液相色谱系统适用于分离更为复杂的肽混合物 采用不同的梯度斜率和流速, 在 25 mm 2.1 mm id 1.7 µm dp 反相高效液相色谱柱上分离牛血清白蛋白 (BSA) 胰酶酶解产物 可采用的最大压力为 9 bar 在总分析时间为 8 分钟和 26 分钟时, 得到的峰容量在 188 到 851 之间 CHCN 13

14 前言 从重组蛋白 医用蛋白质的定性到以蛋白质组为基础的生物标志物的发现和验证等各领域, 多肽的分离极为重要 在生物制药分析中需要分析成百上千的多肽, 蛋白质组学样品中存在成千上万的多肽, 样品的复杂性可想而知 显然, 色谱仪器正面临着巨大的分离挑战 本应用报告证明了采用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统的超高压液相色谱 (UHPLC) 的分离能力 在 25 mm 2.1 mm 1.7 µm d p 色谱柱上分离牛血清 部件号 G422A G4226A G1316C G4212A 方法参数 : 说明 白蛋白胰酶酶解产物, 在不同梯度斜率和流速下测定了峰容量和峰容量产率这两个评价分离效果的重要指标 值得注意的是, 存在一个位点漏切且不考虑非特异性酶切的情况下, 一次 in silico 牛血清白蛋白 (BSA) 酶解能产生约 15 个多肽 实验部分 仪器和方法 Agilent 129 Infinity 二元泵, 带集成的真空脱气机 Agilent 129 Infinity 自动进样器 Agilent 129 Infinity 柱温箱 Agilent 129 Infinity 二极管阵列检测器 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统配置如下 : 色谱柱 C18 15 mm 2.1 mm 1.7 µm C18 1 mm 2.1 mm 1.7 µm 流动相 A= 水 / 乙腈 ( 体积比 98/2), 含.1% 三氟乙酸 (TFA) B= 乙腈, 含.8% 三氟乙酸 (TFA) 流速.4 ml/min 或.2 ml/min 梯度 至 5% B 可变时间 ( 梯度洗脱 ) 65% B 1 分钟 ( 色谱柱冲洗 ) % B 5 分钟 ( 色谱柱平衡 ) 柱温 6 C 进样量 1 µl 检测器 二极管阵列检测器, 检测波长 214/4 nm, 参比波长 4/6 nm,4 Hz 样品牛血清白蛋白 (BSA) 的酶解在 ph 值为 8 的碳酸氢铵缓冲液中进行 加入胰蛋白酶使酶 / 蛋白的比值为 1 / 5, 然后 37 C 酶解过夜 另一牛血清白蛋白样品 ( 称为 BSA RA) 在酶解前还原二硫键并烷基化 在进样前, 两样品均采用流动相 A 酸化至浓度为 3 nmol/ml 用于辅助峰容量计算的肽标准混合物溶解于流动相 A 中, 此混合物标样包含缓激肽 1-5(5 nmol /ml) 血管紧张肽 II(3 nmol /ml) 神经降压肽 (2 nmol /ml) 促肾上腺皮质激素片 [18-39](2.5 nmol /ml) 和牛胰岛素链 B (12.5 nmol /ml) 结果与讨论 25 mm 长的色谱柱是由一根长 7 mm 内径.12 mm 的不锈钢毛细管柱连接两根色谱柱 (15 mm 和 1 mm) 组成的 以 8% B/ 分钟变化的较快梯度得到的酶解产物快速分析结果如图 1 所示 在短梯度时间 (6.25 分钟 ) 内得到的峰容量约 19, 相应的峰容量产率超过 3 个峰 / 分钟 峰容量是通过梯度时间除以测定的 5 个标准多肽在峰底 (4s) 处的平均峰宽计算而来 ( 见图 1) 本报告中所采用的梯度时间大于 BSA 肽段最后从色谱柱洗脱实际所需要的时间 原因是该梯度也用于分析其他保留时间长的酶解产物 计算峰容量时, 仅考虑一个洗脱窗口时 (3 到 7.5 分钟 ), 所得峰容量为 136 然而此时峰容量产率没有受到影响, 每分钟产生的峰数量保持不变 CHCN 14

15 增加 相应地 色谱图中能得到的信息也 就越多 当然 这需要以分析时间为代价 如果采用更长 更缓的梯度 峰容量就会 图 2 显示了四个不同斜率梯度下 BSA 酶 3 倍 从 188 增加到 567 对于 5 分钟 的梯度 若仅考虑 BSA 酶解产物的色谱 窗口 峰容量在 39 分钟内为 375 显然 若保持分析时间在可接受范围 则梯度变 min min min 分钟 8% B/min 增加到 5 分钟 1% B/min 时 峰 容 量 增 加 到 原 来 的 解产物的分析结果 当梯度时间从 化越慢 得到的信息就会越多 进一步增 加梯度时间会得到更高的峰容量 但梯度 变缓到一定程度时 梯度变化带来的这种 图1 肽标准混合物 上图 BSA 酶解产物 中图 和 BSA RA 酶解产物 下图 的快速分析 流速.4 ml/min 梯度 6.25 分钟内 B%从 到 5% 峰容量增加的效应变得越发不明显 峰容 量趋于固定 如图 3 所示 梯度时间从 5 分钟增加至 1 分钟时 峰容量大约 增加 25% 从 567 增加至 711 然而 梯度时间进一步延长至 2 分钟时 峰容 量只增加约 15% 从 711 至 82 最后 DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 214 nm/bw:4 nm Ref 4 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI \BSA-3.D) 一种情况下 分析时间超过 3 小时 实用 性降低 从图 3 推断 梯度时间为 1 至 15 分钟时 能最好的兼顾峰容量和分析 时间 min 6.5 DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 214 nm/bw:4 nm Ref 4 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI... 3LIFESCI\BSA25CM2.D) min 11 DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 214 nm/bw:4 nm Ref 4 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI... 3LIFESCI\BSA25CM4.D) min DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 214 nm/bw:4 nm Ref 4 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI... 3LIFESCI\BSA25CM5.D) CHCN min 图2 不同梯度下 BSA 酶解产物的色谱图 流速.4 ml/min 梯度 6.25 分钟内 -5%B 8%/min 12.5 分钟内 4%/min 25 分钟内 2%/min 5 分钟 1%/min 15

16 当流速和梯度斜率降低至.2 ml/min 和.5% B/min 时, 与在.4 ml/min 和 1% B/min 的梯度条件相比, 峰容量由 567 增加至 645, 而峰容量产率从 11.3 减少至 6.4 另一方面, 当样品变得更加复杂时, 分离度的适度增长将有益于检测相关样品之间的细微差异, 特别是在采用如质谱仪一类的高端定性检测器时, 其表现尤为突出 结论 本应用报告证明多功能的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统可用于分离高度复杂的肽混合物 采用长 25 mm,1.7 µm 粒度填充色谱柱, 在压力高达 9 bar 的条件下对蛋白质酶解产物进行了分析 根据不同需要,Agilent 129 Infinity 液相色谱系统可实现高的峰容量产率 ( 不到 1 分钟内, 峰容量为 188) 或高分离度 (3 小时峰容量超过 8) min /min min 梯度时间 梯度斜率 峰容量 峰容量产率 (min) (% B/min) ( 峰 /min) 图 3 峰容量和峰容量产率与梯度时间的函数 CHCN 16

17 一种用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统测定柑橘油中呋喃香豆素 5-MP 和 8-MP 的绿色液相色谱法 应用报告 天然产品, 香料 作者 Gerd Vanhoenacker, Frank David, and Pat Sandra Research Institute for Chromatography Kennedypark 26 B-85 Kortrijk Belgium MP (5-methoxypsoralen, 75 bergapten) min 8-MP 5-MP Bernd Glatz and Edgar Naegele Agilent Technologies R & D and Marketing GmbH and Co. KG Hewlett-Packard-Str Waldbronn Germany 摘要 采用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统对柠檬油和柑橘油中呋喃香豆素 5- 甲氧基补骨脂素 (5-MP) 和 8- 甲氧基补骨脂素 (8-MP) 进行了分析 当使用反相 (RP) 液相色谱 (LC), 乙腈和水为流动相, 压力为 1 bar 时, 总分析时间可缩短至 4 分钟 基于绿色色谱理念, 并考虑到目前乙腈短缺, 本报告对水 / 甲醇和水 / 乙醇流动相与水 / 乙腈流动相进行了比较, 并研究了有机改性剂性质对选择性和峰容量的影响 对 5-MP 含量约为 5 mg/kg 的柠檬油样品进行测定, 比较了不同方法的分析结果 ppm 水平时未检测到 8-MP 柑橘油中这两种呋喃香豆素的检测限约为 1 mg/kg CHCN 17

18 前言 呋喃香豆素是存在于植物提取物和精油中用于香芬化妆品的天然产物 呋喃香豆素已被确定具有光致突变性和光致癌性 国际癌症研究机构 (IARC) 结合紫外线辐射将 5-MP (5- 甲氧基补骨脂素, 香柠檬烯 ) 和 8-MP (8- 甲氧基补骨脂素, 花椒毒素 ) 分别列为 2A 类 ( 可能对人类致癌 ) 和 1 类 ( 对人类致癌 ) 致癌物 图 1 5-MP 和 8-MP 的结构 5-MP (5- ) 8-MP (8- ) 在此基础上, 对化妆品中补骨脂素的含量也做出了明确限制 1995 年, 该委员会 95/34/DC 官方指令指出, 防晒和彩妆产品中呋喃香豆素应低于 1 mg/kg (1 ppm) 1 当前业界正在讨论将此限制扩展至全部化妆品 2 由此可见对化妆品以及化妆品所用精油中的呋喃香豆素进行快速分析的重要性 采用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统结合紫外线检测, 对柠檬油和橙油样品中的 5-MP 和 8-MP( 图 1) 进行测定, 从而对该方法进行评价 使用标准仪器分析此类样本的典型时间为 3 分钟 3 研究了利用 Agilent 129 Infinity 液相色谱的高压性能来增加分析速度的可能性 通常, 分析流动相由水和乙腈组成 对不同的有机改性剂 ( 乙腈 甲醇和乙醇 ) 进行了比较, 并开发了一种以生物降解乙醇为流动相组分的绿色方法 使用 Agilent 129 Infinity 液相色谱 二极管阵列检测器 (DAD) 和质谱仪 (MS) 检测对呋喃香豆素痕量分析的特点将另行描述 4 实验 仪器和方法 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统的配置如下 : 产品编号 G422A G4226A G1316C 4212A 方法参数 : 色谱柱 流动相 描述 溶液和样品 Agilent 129 Infinity 二元泵, 带集成的真空脱气机 Agilent 129 Infinity 自动进样器 Agilent 129 Infinity 柱温箱 Agilent 129 Infinity 二极管阵列检测器 C18 15 mm L 2.1 mm id, 1.7 µm d p C18 1 mm L 2.1 mm id, 1.7 µm d p A= 水 B= 乙腈 甲醇或乙醇 浓度为 5 µg/ml 的储备溶液由 5-MP 和 8-MP 标样溶于乙醇制得 该溶液在进样前要进一步用乙醇稀释 使用柠檬油和柑橘油样品 对单个油样以及混合样进行分析, 在进样前样品用乙醇稀释 ( 体积比 1/1) 流速梯度 可调可调 温度 8 C 进样量 1 µl 检测器 二极管阵列检测器, 信号 214/4 nm, 参比 5/6 nm,4 Hz CHCN 18

19 结果和讨论 提高分析速度 利用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统高压性能来提高分析速度 本实验采用反相液相色谱法 (RP-LC), 水 / 乙腈流动相, 通过缩短分析起点的等度洗脱时间, 同时使流速和梯度斜率成比例增加, 从而保持一致峰形的色谱图 流速由.45 ml/min 上升至.6 ml/min.9 ml/min 1.2 ml/min, 导致 15 mm 长的色谱柱压降上升至 19 bar 在不牺牲分离度的情况下, 分析速度加快逾 2.5 倍 图 2 A 2B 和 2C 显示混合油样的一些典型谱图, 样品中仅检测到 5-MP 若色谱柱和硬件适用 1 bar 以上的压力, 则只能使用图 2C 中的分析条件 减少柱长至 1 mm, 提高流速至 1.45 ml/min( 图 2D), 可进一步加快分析速度 此时压力为 1 bar, 分析时间约为 4 分钟 使用短柱进行高速分析也存在缺点, 即分离度会下降, 但下降后的分离度仍足以检测样品中的 5 -MP DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 315 nm/bw:4 nm Ref 5 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI \CITR-BEH15-2.D) 16 A min DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 315 nm/bw:4 nm Ref 5 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI \CITR-BEH15-12.D) B min DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 315 nm/bw:4 nm Ref 5 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI \CITR-BEH15-31.D) C 8-MP 8-MP 8-MP min DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 315 nm/bw:4 nm Ref 5 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI...941\CITR D) 4 D MP 5-MP 5-MP 5-MP 5-MP min 图 2 不同的流速和色谱柱下混合油样分析的谱图 流速 / 柱长 :.45 ml/min /15mm(A),.9 ml/min /15mm (B),1.2 ml/min /15mm(C) 和 1.45 ml/min /1 mm(d) 流动相 : 水 - 乙腈 CHCN 图 2 条件 A B C D 柱长 15 mm 15 mm 15 mm 1 mm 流速.45 ml/min.9 ml/min 1.2 ml/min 1.45 ml/min 梯度 5 分钟 : 2.5 分钟 : 1.9 分钟 : 1 分钟 : 3% B 等度洗脱 3% B 等度洗脱 3% B 等度洗脱 3% B 等度洗脱 5 25 分钟 : 分钟 : 分钟 : 分钟 : 3 1% B 3 1% B 3 1% B 3 1% B 最大压力 44 bar 84 bar 19 bar 1 bar 19

20 绿色色谱法 在第二项应用中,Agilent 129 Infinity 液相色谱系统用于开发绿色液相色谱方法 4 DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 315 nm/bw:4 nm Ref 5 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI \CITR-ACN-3.D) A 使用 3 种不同有机改性剂对柑橘油进行了 3 分析 调整每个组合溶剂的组成和梯度, 以获得相似的洗脱窗口 结果如图 3 所示 可见洗脱谱图与第 1 节样品 ( 混合油样品 ) 谱图存在显著差异 导致差异的原因 MP min 在于 : 橙油主要含有聚甲氧基化黄酮, 而柠檬油主要是由补骨脂内酯衍生物组成 4 DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 315 nm/bw:4 nm Ref 5 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI \CITR-MEH-3.D) B 仅使用水和乙醇做为流动相来分析样品就是绿色色谱法 由于目前乙腈短缺, 这种 MP 方法在生态及经济上都极具吸引力, 但其 1 缺点是会产生高背压 在该特定分析中, 乙醇压力达到 77 bar, 而乙腈和甲醇分别只有 44 bar 和 59 bar Agilent 129 Infinity 液相色谱系统可适用 12 bar 的 DAD1 B, DAD1A, DAD: Signal A, 315 nm/bw:4 nm Ref 5 nm/bw:6 nm (B:\RIC\AGI \CITR-ETH-3.D) C min 压力, 且不存在高背压的问题 3 由谱图 3 可见, 样品中存在 5-MP 这表明在混合样品中,5-MP 是来自于柠檬油样而非橙油 请注意, 质谱是定性和定量分析痕量呋喃香豆素的最好方法 MP min 图 3 使用 3 种不同改性剂分析柠檬油样品的谱图 乙腈 (A) 甲醇 (B) 和乙醇 (C) 流速 :.45 ml/min 图 3 条件 A B C 改性剂 乙腈 甲醇 乙醇 梯度 -5 分钟 : 3.5 分钟 : 5 分钟 : 3% B 等度洗脱 4% B 等度洗脱 23% B 等度洗脱 5 25 分钟 : 分钟 : 5 25 分钟 : 3-1% B 4-1% B 23 1% B 最大压力 44 bar 59 bar 77 bar CHCN 2

21 定量和性能数据采用不同的方法对柠檬油样品中的 5-MP 进行了定量分析, 并对分析性能进行了比较 ( 见表 1) 5-MP 含量为.1 µg/ml.5 µg/ml 1 µg/ml 5 µg/ml 以及 1 µg/ml 的标准溶液单次连续进样, 用以创建校准线 数据汇总见表 1 为比较不同方法的分离能力, 测定 5 µg/ml 5-MP 的标准溶液化合物的峰底 (4s) 的平均峰宽除以梯度时间, 得到每种方法的峰容量 与 15 mm 色谱柱相比, 短色谱柱的分离能力如预想有所下降 值得注意的是, 水 / 乙腈的峰容量不会受到流速增加的影响, 乙腈和乙醇的峰容量也类似 流动相 柱长 流速 最大压力 峰容量 线性 5-MP 含量 (mm) (ml/min) (bar) (R²) (µg/ml)* 乙腈 > 甲醇 > 乙醇 > 乙腈 > 乙腈 > 乙腈 > 平均 5.46 * 样品溶液的浓度 在分析前样品油采用 1 倍体积的乙醇稀释 表 1 不同方法的比较 检测对象为柠檬油样 相对标准偏差 (%) MP 的检测与所有分离方法类似, 相对标准偏差 (RSD) 为 1.98% 在样品溶液中平均检出浓度为 5.46 µg/ml, 这相当于原柠檬油中 5-MP 的含量为 51 mg/kg CHCN 21

22 结论 采用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统对柑橘油中的呋喃香豆素进行测定 采用水 / 乙腈为流动相的原方法, 与采用甲醇或乙醇替代乙腈的绿色色谱法进行了性能比较 此外, 对高速方法的性能进行了评价 本应用报告表明 :Agilent 129 Infinity 液相色谱系统的高压能力和探测器高采样速率能很好的提高分析速度 ; Agilent 129 Infinity 液相色谱系统可作为比现有方法毒性更低 环境更为友好的新方法 参考文献 1. Eightieth Commission Directive 95/34/EC of 1 July 1995 adapting to technical progress Annexes II, III, VI and VII to Council Directive 76/768/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products (1995) 2. Sixth plenary of 13 December 25, Scientific Committee on Consumer Products SCCP/942/5, pinion on furocoumarins in cosmetic products (25) 3 Frérot E., Decorzant E., J. Agric. Food Chem. 52 (24) G. Vanhoenacker, F. David, P. Sandra, in preparation CHCN 22

23 用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统提高盐酸胃复安制剂中杂质分析的效率 应用报告 制药 作者 Gerd Vanhoenacker, Frank David, Pat Sandra Research Institute for Chromatography Kennedypark 26 B-85 Kortrijk Belgium Bernd Glatz and Edgar Naegele Agilent Technologies R&D and Marketing GmbH & Co. KG Hewlett-Packard-Str Waldbronn Germany 摘要 本应用报告对 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统用于测定盐酸胃复安药物制剂中杂质和有关物质的性能进行了评价 探讨了将 12 系列 HPLC 系统上的常规液相色谱 (LC) 方法转为 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统上的超高压方法 方法转移相对容易, 温度精确调节是使不同杂质得到相同选择性的最重要参数 在此方法开发过程中施加的压力高达 17 bar 最终的高效方法是在 88 bar 下操作的分析时间为 3.5 分钟, 比原来的 HPLC 方法快 4 倍左右, 但也具有同样的准确度 我们进行了验证研究以证明 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统的性能 采用新的二极管阵列检测器 (DAD) 使杂质的检测限低至相当于主化合物的.1 % w/w 这比要求的检测限还要低一个数量级 CHCN 23

24 前言 目前药物分析的关键词是高通量 高效率和高分离度 高效率的目标就是在所开发和验证方法的准确度 精密度和重现性保持不变的前提下, 开发比当前所用方法约快 4-5 倍的分析方法 在液相色谱 (LC) 中, 加快分析速度的方法包括使用填料粒度小于 2 µm 的色谱柱和 / 或在高温下操作 采用填料粒度小于 2 µm 的色谱柱, 与常规方法相比, 可以在更高的线性流速下操作, 但需要专用的液相色谱仪器 我们用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统测定了盐酸胃复安制剂中的杂质 该系统配置了高压泵, 输液压力高达 12 bar, 以及新的快速而灵敏的二极管阵列检测器 ( DAD) 方法开发包括从配置填充 3.5-µm 填料色谱柱的常规仪器 (Agilent 12 系列液相色谱系统 ), 向配置 1.7-µm 填料色谱柱的 UHPLC 系统 (Agilent 129 Infinity 液相色谱系统 ) 上的条件转换 通 过比较两个系统得到的数据, 对各系统准确度 精密度和重现性进行了评价 实验仪器 所用的标准 Agilent 12 系列 HPLC 系统和 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统配置如下 : 溶液杂质和有关物质的储备溶液用甲醇配制 化合物结构及其 EP 代码列于表 1 本文中始终采用这种峰的编码方式 储备溶液与水混合并稀释成适当浓度 制剂是盐酸胃复安水溶液 (5 mg/ml) 与某些其它物质 ( 保密配方 ) 混合制成的注射剂 12 系列 HPLC Agilent 129 Infinity 液相色谱系统 真空脱气机 129 Infinity 二元泵, 带集成的真空脱气机 G1311A 四元泵 G1313A 自动液体进样器 G4226A 129 Infinity 自动进样器 G1316A 柱温箱 G1316C 129 Infinity 柱温箱 G1315B 二极管阵列检测器 G4212A 129 Infinity 二极管阵列检测器 CHCN 24

25 色谱峰名称 ( 欧洲药典编码,EP) 结构主峰胃复安 CH 3 Cl N CH 3 N H H 2 N CH 3 X 溴代胃复安 1 4- 氨基 -5- 氯 -2- 甲氧基苯甲酸 (EP C) CH 3 Br N CH 3 N H H 2 N CH 3 Cl CH 2 4-( 乙酰氨基 )-2- 羟基苯甲酸 (EP H) H 2 N CH 3 CH 3 4- 氨基 -5- 氯 -N-2-( 二乙氨基乙基 )-2- 甲氧基苯甲酰胺 N- 氧化物 (EP G) 4 4- 氨基 -5- 氯 -N-2-( 二乙氨基乙基 )-2- 羟基苯甲酰胺 (EP F) H 3 C H 2 N N H H CH 3 Cl N H N CH 3 CH 3 CH 3 Cl N CH 3 N H H 2 N H 5 4-( 乙酰氨基 )-5- 氯 -N-2-( 二乙氨基乙基 )-2- 甲氧基苯甲酰胺 (EP A) 6 甲基 4-( 乙酰氨基 )- 2- 甲氧基安息香酯 (EP D) H 3 C CH 3 Cl N CH 3 N H N H CH 3 CH 3 H 3 C N H CH 3 7 甲基 4-( 乙酰氨基 )-2- 羟基安息香酯 CH 3 H 3 C N H H 8 甲基 4-( 乙酰氨基 )-5- 氯 -2- 甲氧基安息香酯 (EP B) Cl CH 3 H 3 C N H CH 3 9 甲基 4- 氨基 -2- 甲氧基安息香酯 CH 3 H 2 N H 表 1. 研究的化合物 CHCN 25

26 结果和讨论从 12 系列液相色谱到 129 LC Infinity 系统的方法转换 原来的方法是在使用四元泵带线性分离的 12 系列 HPLC 上开发的 制剂添加了.5% w/w 的色谱图如图 1A 所示 使用的色谱柱是 XBridge C-18 柱, 填充 3.5-µm 粒度填料 初始压力为 14 bar 只要将某些仪器的差异考虑进去, 该方法可以轻松转换到 129 Infinity 液相色谱系统上 如果将方法参数直接拷贝到 129 Infinity 液相色谱系统上, 保留时间将明显缩短 由于两个系统的延迟体积不同, 选择性也发生了改变 四元泵的延迟体积是 95 µl, 而 129 Infinity 二元泵的延迟体积已减少到了 1 µl 我们在 129 Infinity LC 方法中引入了一段初始等梯度持续时间来补偿这一差异 经过这种直接修正, 两个系统的保留时间和选择性非常相似, 而 129 Infinity LC 的效率比 12 系列更高 ( 未显示色谱图 ) 然后将方法转换到填充 1.7-µm 填料的内径为 2.1 mm 的 BEH C18 柱上 为了保持两个柱子上的线速度相同, 将流速减小到.22 ml/min, 同时将进样量从 2 µl 减少到.8 µl 压力为 38 bar 为了补偿延迟体积的差异, 在梯度中引入了.5 分钟的初始持续时间 这些条件下的结果与用 3.5-µm 填料色谱柱非常相似 ( 图 1B), 但得到结果 ( 图 1A) 的速度稍快 使用 129 Infinity 的设置, 柱效和分离度明显提高 理论塔板数可以用柱长与 2 倍粒径之比进行粗略计算 因此,1.7-µm 填料柱的柱效应为 3.5-µm 柱的两倍 由于分离度与柱效的平方根成正比, 所以, 在同 A) 12 LC B) 129 Infinity LC 一系统上分离度应提高 1.4 倍 在这个特例中, 分离度的提高比理论预计高得多 ( 例如峰 1 和峰 2 的分离度从 2.6 提高到 5.9) 这归功于 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统更低的死体积和更卓越的泵驱动 图 1 从 Agilent 12 系列液相色谱系统到 Agilent 129 Infinity 系统的方法转换 样品 : 添加.5% w/w1 到 9 杂质的制剂 色谱条件图 1 A B 色谱柱 XBridge C-18, BEH C18, 15 mm 2.1 mm, 1.7 µm 15 mm 3. mm, 3.5 µm 流动相 A =.25% w/w 醋酸铵水溶液 B = 乙腈 流速.45 ml/min.22 ml/min 梯度 -15 分钟 :5 57.5% B -.5 分钟 :5% B 等梯度 分钟 :5 57.5% B 温度 37 C 37 C 进样量 2 µl.8 µl 检测器 DAD, 信号 275/4 nm, 参比 4/6 nm 最大压力 14 bar 38 bar X 6 X CHCN 26

27 用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统提高分析速度在 1.7-µm 粒度色谱柱进行分析时压力是 38 bar, 远远低于 129 Infinity 液相色谱系统泵的 12 bar 的压力上限 因此, 还可以通过增大流速来缩短分析时间 当增大流速时, 为了保持相同的洗脱曲线, 应按流速的增加比例缩短梯度时间 当流速从.22 ml/min 加快到.66 ml/min 时, 操作压力从 38 bar 增加到了 12 bar 正如预期的一样, 色谱柱在非常高的压力或高流动相线速度条件下, 产生了摩擦热 [1,2] 由于分析物中某些组分的保留与温度有关, 所以我们注意到, 在高流速下色谱柱的选择性有所不同 可以看出, 主成分和化合物 5 之间 化合物 7 和 8 的分离度尤其受温度变化的影响 ( 图 2A) 将柱温从 37 C 降低到 32 C, 可以抵消热效应 ( 图 2B) 在该条件下, 在 分钟内就可实现良好分离, 与原来的液相色谱相比, 时间缩短了 3 倍 然而当压力增加到 17 bar 时, 所用色谱柱却只能耐受 1 bar 的压力 色谱柱在比最大耐受压力更高的压力下使用更长时间后, 柱寿命和方法的耐用性会明显降低 A) 37 C B) 32 C 图 2 摩擦热的生成对色谱柱选择性的影响, 以及降低柱温的效果 样品 : 添加.5% w/w 杂质 1 到 9 的制剂 色谱条件图 2 A B 色谱柱 BEH C18, 15 mm 2.1 mm, 1.7 µm 流动相 A =.25% w/w 醋酸铵水溶液 B = 乙腈 流速.66 ml/min 梯度 -16 分钟 :5% B 等梯度 分钟 :5 57.5% B 温度 37 C 32 C 4 5 X X 进样量.8 µl 检测器 DAD, 信号 275/4 nm, 参比 4/6 nm 最大压力 12 bar 17 bar CHCN 27

28 因此, 对于常规应用, 若柱长从 15 mm 减少到 1 mm, 在.66 ml/min 流速下形成的最大反压为 88 bar 进一步缩短梯度持续时间和梯度时间来保持原方法的选择性 该方法总分析时间是 3.5 分钟, 而原来用 3.5-µm 粒度色谱柱时总分析时间为 15.5 分钟 ( 图 3) 初始峰的分离度是 3.8, 这仍比用 12 系列液相色谱系统得到的数值高 X 图 3 用最终的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统方法得到的结果 样品 : 添加.5% w/w 杂质 1 到 9 的制剂 色谱条件图 3 最终的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统方法 色谱柱 BEH C18, 1 mm 2.1 mm, 1.7 µm 流动相 A =.25% w/w 醋酸铵水溶液 B = 乙腈 流速.66 ml/min 梯度.1 分钟 :5% B 等梯度 分钟 :5 57.5% B 温度 32 C 进样量 1 µl 检测器 DAD, 信号 275/4 nm, 参比 4/6 nm 最大压力 88 bar CHCN 28

29 3. 方法验证采用图 3 的条件, 测定了线性 进样重现性和检测限 ( 表 2) 等参数 得到良好的线性 ( 所有化合物均大于.999) 和进样精度 RSD 在.5% 左右, 接近检测限 (LD) 的某些化合物的 RSD 均低于 8%, 大多数化合物的 RSD 低于 3.5% 这都在该浓度水平的合格限内 在 LD 分析的色谱图见图 4 LD 相对于主要化合物 ( 柱上 5 25 pg), 在.1% w/w 到.5% w/w 之间波动 这说明, 杂质水平低于报告阈值 1 到 5 倍时仍可被检测到 4 X 图 4 制剂 ( 上图 ) 及添加了 LD 浓度水平杂质 1 到 9 的制剂 ( 中图 :.1% w/w; 下图 :.5% w/w ) 条件 : 见图 3 化合物线性,R² (1) 进样重现性,% RSD (2) LD 峰面积, 峰面积, % 柱上 信噪化 (3).5%.5% w/w (pg) 无可用数据 (4) 无可用数据 (4) 无可用数据 (4) (1).1,.2,.5,.1,.2,.5%, 1 进样 / 水平 (2) 连续 6 次进样 / 水平 (3) 信噪比, 噪音取自 分钟 (4) 无可用数据, 制剂中已存在杂质 CHCN 29

30 结论 本应用报告证明了将现有 HPLC 方法转换为快速 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统方法的可行性 开始, 我们将在 12 系列液相色谱仪上建立的 HPLC 分析方法简单移植至 129 Infinity 液相色谱系统仪器上 如果考虑了某些仪器特征, 该方法转移将相对简单 然后把原来的色谱柱(15 mm 3. mm,3.5-µm 粒度 ) 换成粒度更小的 (1.7-µm) 窄内径 (2.1-mm) 柱 此转换使化合物之间的分离度显著增加 参考文献 1. de Villiers A., Lauer H., Szucs R., Goodall S., Sandra P., J. Chromatogr. A, Gritti F., Guiochon G., J. Chromatogr. A, 使用小于 2 µm 填料的色谱柱可以通过提高流动相的线速度缩短分析时间, 而且不会影响分离度 在高压和高流动相流速条件下产生的摩擦热改变了方法的选择性 为了维持原来的选择性, 将色谱柱温度的设置降低 最终的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统分析是在 1-mm 柱上进行的, 压力为 88 bar, 比原来的 HPLC 方法快 4 倍 该 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统方法已得到成功验证 检测限随着相当于柱上 5 25 pg 的主化合物在.1%w/w 到.5%w/w 之间变化, 这比要求的报告浓度水平低 1 到 5 倍 CHCN 3

31 药物的主要代谢产物软件辅助下高通量鉴定 用 Agilent 129 Infinity 液相色谱 飞行时间和四极杆 - 飞行时间仪器快速采集数据, 并用安捷伦 MassHunter 代谢物鉴定软件对代谢物进行鉴定 应用报告 药物研究与开发中代谢产物的鉴定 作者 Edgar Naegele Agilent Technologies Waldbronn, Germany 摘要本应用报告报导了 : 用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统对体外试验获得的代谢物进行快速分离 用 Agilent 653 精确质量四极杆飞行时间液质联用系统快速采集飞行时间质谱图 用安捷伦 MassHunter 代谢物鉴定软件对体外试验的主要代谢物进行软件辅助下的快速鉴定 用安捷伦 MassHunter 软件对鉴定出的代谢物生成报告 CHCN 31

32 前言在现代药物开发中, 至关重要的是对可能的候选新药的吸收 分布 代谢和排泄 ( 统称为 ADME) 性质进行分析, 以便尽快确定是否继续对特定化合物的开发投入经费 要找到具有合适性质的化合物, 首先要在大量化合物中进行 ADME 性质筛查, 这要求在高通量环境下工作 本应用报告报导了用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统 Agilent 653 四极杆 - 飞行时间质谱系统和 MassHunter 代谢物鉴定软件对新药候选化合物的主要代谢物进行的快速 高通量鉴定 实验仪器 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统, 由集成式脱气的 129 Infinity 二元泵 129 高效恒温自动进样器, 和 129 Infinity 柱温箱组成 Agilent 653 精确质量四极杆 - 飞行时间液质联用系统 安捷伦 MassHunter 代谢物鉴定 (MetID) 软件 色谱柱 :ZRBAX SB-C18, 2.1 x 5 mm, 1.8 µm 样品制备使用下列储备溶液 : 2 mg/ml 微粒体 S9 的制备.1 mg/ml 丁螺环酮水溶液 1.6 mg NADP 溶于 1.6 ml.1 M 磷酸盐缓冲液,pH 为 mm 异柠檬酸盐 /MgCl 2 ( 将 23 mg MgCl 2.6H mg 异柠檬酸盐溶 于 2 ml 水中 ) 异柠檬酸脱氢酶.33 unit/µl NADPH 再生系统 :1.6 ml NADP 溶液 ml 异柠檬酸盐溶液 + 1 µl IDH 溶液 保温混合物 : 3.85 µl 底物 + 2 µl NADPH 再生系统 µl 磷酸盐缓冲 液 + 5 µl S9 37 C 下保温 6 分钟 在开始 (t=) 和终 止 (t=6 分钟 ) 时各取 1 µl 加入 6 µl 高氯酸和 1 µl 乙腈在 14, rpm 下离 心 15 分钟后终止反应 用 SpeedVac 浓 缩仪蒸干上清中的溶剂, 再用含.1 % 甲酸 的水复溶, 进行 LC/MS 分析 用 保温 时间的样品进行对照 LC 方法溶剂 A: 水 +.1 % 甲酸溶剂 B: 丙烯腈 +.1 % 甲酸流速 :.8 ml/min 梯度 分钟, 5 %B;.1 分钟, 5 %B; 1.1 分钟, 75 %B; 停止时间 : 1.1. 分钟平衡时间 : 1 分钟进样 : 进样量 5 µl, 样品在 4 C 冷却, 用 5 % 甲醇冲洗针头 5 秒, 在.1 分钟时从进样环转至旁路冲洗, 冲洗因子为 16 色谱柱 : 柱温为 6 C 飞行时间质谱方法离子源 : ESI 正离子毛细管电压 :35 V 干燥气体 : 12 L/min 雾化器 : 55 psi 气体温度 : 35 C 锥孔电压 : 65 V 碎裂电压 : 2 V 质量范围 : 1-1 m/z 采集速率 : 5 图谱 / 秒参考质量数 : 和 MetID 软件中的数据分析方法分析的第一步就是将含代谢物 ( 代谢样品 ) 的数据文件和只含母体药物 ( 对照样品 ) 的数据文件进行对比, 用分子特征提取 (MFE) 算法从达到 MS 限的数据中提取所有检测到的质量信号 将相关的化合物同位素质量和加合质量均归为离散的分子特征, 并去除化学噪音 然后对代谢样品和对照组所列出的化合物进行比较 所有新的或那些在代谢样品中增加 2 倍的化合物均被认为是潜在代谢物, 要用不同的算法再进一步进行分析 这些算法可以 鉴定和验证新代谢物, 或只是对其它算法找到的代谢物进行验证 在这个高通量实验中, 所有算法的结果都权重相当, 结合在一起形成最后的鉴定关联分值 当其最后的分值在严格定义的关联阈值之上时就确定为代谢物 所有算法得到的结果列在一张结果表中, 可以随时浏览和出报告 CHCN 32

33 结果和讨论在 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统上采用 1 分钟梯度洗脱就可在一根 5 mm 1.8 µm 粒度柱上实现代谢物的快速分离 代谢物由测试药物丁螺环酮体外试验产生 飞行时间质谱仪检测的数据采集速率为 5 Hz 时可得到满意的检测结果 数据生成后即被载入 MetID 软件, 并用通用方法进行分析 MetID 软件将结果列在快速一览表中, 在该表中可以查找到每个代谢物结果的更多信息 ( 图 1) 从结果列表可以生成总结报告, 显示每个代谢物的可用信息 ( 图 2) 更详细的报告包含了每个代谢物的详细结果 这里以丁螺环酮的单羟基代谢物 ( 图 3 到图 5) 和二羟基代谢物 ( 图 6 到图 8) 为例进行讨论 图 1 结果列表中显示了丁螺环酮代谢物分析的一览总结, 包括全部鉴定出的代谢物 提取离子色谱图 (EIC) 提取的化合物色谱图 (ECC) 同位素分布模式分析和计算分子式 Rel. 1. BioXF 图 2 结果总结报告, 包括按保留时间 (RT) 代谢物名称和相对分值 分子量及各种计算结果通过的用户权限 SC= 对照样品比较, IPM = 同位素分布匹配,EIC = 提取离子色谱图,MDF = 质量缺损过滤器, Form. = 计算分子式,BioXF = 指定的生物转化,Qual. = 根据分值认定,User = 用户认定 CHCN 33

34 在.75 分钟后出峰质核化为 的单羟基代谢物的详细报告, 显示了该代谢物本身的详细信息, 例如测定的精确质量 计算分子式 制定的生物转化和离子类型 另外, 报告还显示了每种算法的详细信息, 这些算法包括分子特征提取 (MFE) 提取离子色谱图 (EIC) 化合物检索和质量缺损过滤器结果等 ( 图 3) 对于羟基代谢物, 可能的分子式的计算不仅基于定义的质量误差窗口, 而且还根据测量的同位素形态, 从而提高了化合物分子式的质量, 显著限制了命中的可能数量 这些结果还在代谢物结果详细报告中以化学形式显示 ( 图 4) 图 3 保留时间.75 分钟处的丁螺环酮羟基代谢物详细代谢物报告 报告的这部分给出了有关鉴定的代谢物和鉴定计算方法的详细信息 还有关于计算式 ( 图 4) 色谱图和同位素分布 ( 图 5) 的其它详细信息 图 4 关于包含同位素分布的分子式的详细代谢物报告, 包括同位素分布 对保留时间为.75 分钟处丁螺环酮羟基代谢物的计算 CHCN 34

35 x1 5 CIP (C21H32N53) EIC (42.25).755 ( ) 1.6 A x (M+H) x1 5 ECC B (M+H) (M+H) (M+H) [m/z] C 图 5 保留时间.75 分钟处丁螺环酮羟基代谢物的详细报告 : A) 质量 的化合物的提取离子色谱图 (EIC) B) 保留时间.75 分钟丁螺环酮羟基代谢物的提取化合物色谱图 (ECC) C) 保留时间.75 分钟丁螺环酮羟基代谢物测量的同位素形态 ( 蓝线 ) 和计算的同位素形态 (CIP, 绿框 ) 最后, 显示了 EIC ECC 和同位素形态 ( 图 5) m/z 质核比为 的 EIC 显示丁螺环酮可能的羟基代谢物有 5 个峰, 从中选择了保留时间为.75 分钟的一个组分 ( 图 5A ) 保留时间.75 分钟分子质量为 的提取 MFE 化合物的 ECC, 与 TIC 相同 ( 图 5B) 该化合物测定的同位素形态与基于分子式计算的同位素形态完全符合 ( 图 5C) 在同一数据分析中, 还鉴定出了比单羟基代谢物低两个数量级的二羟基代谢物 详细报告显示了二羟基代谢物的具体信息, 该组分于.71 分钟洗脱,m/z 为 , 图 6 中还显示了每种计算的详细信息 ( 图 6) 图 6 保留时间.71 分钟的丁螺环酮二羟基代谢物的详细代谢物报告 报告的这部分给出了有关鉴定的代谢物和鉴定计算方法的详细信息 还有关于分子式 ( 见图 7) 色谱图和同位素类型 ( 见图 8) 的其它详细信息 CHCN 35

36 分子式的计算列于详细的分子式报告中 ( 图 7) m/z 的 EIC 显示丁螺环酮可能的二羟基代谢物有 5 个峰, 选择了保留时间.71 分钟的一个组分 ( 图 7A ) 保留时间为.71 分钟分子质量为 的提取 MFE 化合物的 ECC 与 TIC 一致 ( 图 7B) 该化合物测定和计算的同位素类型见图 7C 图 7 关于分子式的详细代谢物报告, 包括同位素分布 对保留时间.71 分钟处丁螺环酮羟基代谢物的计算 x1 3 EIC ( ) A x13 ECC B x CIP (C21H32N54) ( ) (M +H ) (M +H ) (M +H ) (M +H ) [m/z] C 图 8 保留时间.71 分钟处丁螺环酮二羟基代谢物的详细报告 : A) 质量为 的化合物提取离子色谱图 (EIC) B) 保留时间.71 分钟处丁螺环酮二羟基代谢物的提取化合物色谱图 (ECC) C) 测量的保留时间.71 分钟处丁螺环酮羟基代谢物测量与计算的同位素分布 CHCN 36

37 结论本应用报告介绍了用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统和 Agilent 四极杆 - 飞行时间液质联用系统, 在高通量条件下, 对体外代谢物样品的快速分离和精确质量进行测定 代谢物化合物在 1 分钟之内实现分离, 代谢物鉴定软件提取的峰宽不到 1 秒 (FWHH) 用安捷伦代谢物鉴定软件快速鉴定了主要代谢物, 并生成了总报告及每个代谢物的详细报告 参考文献 1. E. Naegele, F. Wolf, U. Nassal, R. Jäger, H. Lehmann, F. Kuhlmann, K. Subramanian, An interwoven, multi-algorithm approach for computerassisted identification of drug metabolites, Agilent Technologies 应用报告, publication number EN, CHCN 37

38 CHCN 38

39 Agilent 129 Infinity 超高性能液相色谱系统在环保中的应用 : 色谱技术的发展 应用报告 环保 作者 E. Michael Thurman and Imma Ferrer Center for Environmental Mass Spectrometry Department of Environmental Engineering University of Colorado Boulder, C, USA 摘要 本应用报告给出了通过新型 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统将 UHPLC( 超高效液相色谱 ) 应用于环保当中的几个实例 这些实例包含了采用美国国家环境保护局第 1694 号方法进行的药物废水分析, 以及如何采用 UHPLC 方法使该分析更为有效和可靠 第二个实例则表明, 可以采用快速色谱法对农药的复杂混合物进行分析, 从而打开了不同类型 UHPLC 分析方法在环境保护中应用的大门 最后一个实例将向您展示采用 UHPLC 和弹道梯度在 6 秒内对废水中药物进行快速分析, 这也是最早的有关环境分析的实例之一 本报告对一些有关 UHPLC 分析的见解也进行了讨论和说明 CHCN 39

40 前言 超高效液相色谱的诞生为液相色谱 / 质谱分析 (LC/MS) 带来了两个重要的创新 第一个创新是 1.8- 微米色谱柱的应用, 这使得其塔板数与 5- 微米色谱柱相比提高了两倍 这对于环保应用是非常重要的, 特别是对于环保应用中的复杂样品分析, 如废水中的药物分析等 然而,1.8- 微米色谱柱的应用要求泵能承受比常规 6 巴更高的压力, 这还只是 UHP LC 分析的一般使用范围 第二个创新是 1.8- 微米色谱柱允许使用快速分离色谱仪, 甚至超快色谱仪, 其运行时间可以缩短到 1 分钟以内 这些分析均要求较高的流速, 从而使得压力达到 8 巴到 1 巴, 这正好是 UHPLC 的适用范围 短时间内的高通量样品需求提高了应用 1.8- 微米反相色谱柱进行快速液相色谱分析的效率 对于每天分析数百个样品或需要更短的分析周期的实验室来讲, 快速色谱分析已成为必然要求 采用高分离度快速液相色谱, 相比原来需要几天时间, 现在可在几个小时之内获得成批样品的分析结果 在水处理和食品行业中, 监管实验室只要能在一个小时之内给出检验结果, 那么就可以在当天内进行水处理措施或发出蔬菜运输许可 最终结果将是客户工作效率的提高和报告实验室更大的成本效益 因此, 通过 UHPLC 缩短分析时间而提高了产率 分离时间在 1 分钟以内被称为快速液相色谱, 分离时间在 1 分钟以内被称为超快速液相色谱 UHPLC 的另一个优势是当使用 1.8- 微米长色谱柱时, 有效峰容量增加了 现在, 实现近 3 倍峰容量的增加已经成为可能, 这对于废水和环保应用 ( 如农药筛查 ) 中的未知物分析将很有价值 最后,UHPLC 系统必须能耐受高压力和高流速 ( 当压力达到 12 巴时流速大于 1 毫升 / 分钟 ), 从而可以在进行快速分离和正常流速色谱时具备高的峰容量 安捷伦专门设计了能够耐受 12 巴 (18, 磅 / 平方英寸 ) 压力的 1.8- 微米色谱柱, 并提供不同的固定相类型 (StableBond 色谱柱和 ZRBAX Eclipse Plus 色谱柱中的 C-8 C-18 等 ) 正如本应用报告所要阐述的, 对于难以分析的水样品来讲, 以上都是非常有利的, 包括提高美国国家环境保护局关于药物废水分析中第 1694 号方法的峰容量 同时, 它们对于使用三重串联四极杆质谱仪和液相色谱 / 飞行时间质谱联用仪仪进行医药和农药的快速分离也是非常有用的 实验 本应用报告所做的工作是由美国科罗拉多州的博尔德市科罗拉多州立大学环境质谱中心的 Imma Ferrer 博士和 Michael Thurman 博士完成的 他们使用了 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统和 Agilent 643 三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪仪以及 Agilent 622 精确质量飞行时间液相色谱 / 质谱联用仪仪 色谱柱 在快速分离高通量 (RRHT) 分析中测试了两种不同的色谱柱, 包括高压 (1 巴 )1.8 微米粒径色谱柱 表 1 为测试中所用的色谱柱及它们的理论塔板数 直径粒径塔板数理论额定压力色谱柱 ( 毫米 ) ( 微米 ) ( 巴 ) ZRBAX Eclipse Plus-C ,688 1 ZRBAX Eclipse Plus-C ,392 1 表 1 研究中所使用的色谱柱 色谱和质谱条件 所有 UHPLC 色谱分离采用了 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统, 标准的美国国家环境保护局 1694 号方法则采用了 Agilent 12 SL 系列 本应用报告中每个图所对应的条件如下所示 图 1. A 部分液相色谱仪为 Agilent 12 SL 系列 梯度为 3 分钟内由 1% 的乙腈 / 水溶液到 1% 的乙腈, 并保持 5 分钟 流速为.6 毫升 / 分钟 色谱柱为 3.5 微米的 ZRBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱, 4.6 毫米 15 毫米 基线峰宽为 秒, 峰容量为 1 最大压力为 75 巴 质谱仪为 Agilent 641 三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪系统, 其工作模式为电喷雾正极模式和三时间段多反应监测模式 (MRM) 每个化合物都有两个离子对, 且每个离子对的驻留时间为 1 毫秒 这些化合物为美国国家环境保护局 1694 号方法中的第一组化合物, 详细信息请参阅我们有关化合物及其离子对详情的应用报告 [2] CHCN 4

41 图 1. B 部分液相色谱仪为 Agilent 129 Infinity 液相色谱 梯度为 1 分钟内由 1% 的乙腈 / 水溶液到 1% 的乙腈, 并保持 1 分钟 流速为.6 毫升 / 分钟 色谱柱为 1.8 微米的 ZRBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱,2.1 毫米 5 毫米 基线峰宽为 5-6 秒, 峰容量为 1 最大压力为 375 巴 质谱仪为 Agilent 643 三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪系统, 其工作模式为电喷雾正极模式和三时间段多反应监测模式 每个化合物都有两个离子对, 且每个离子对的驻留时间为 1 毫秒 这些化合物为美国国家环境保护局 1694 号方法中的第一组化合物, 详细信息请参阅我们有关化合物及其离子对的应用报告 [2] 图 2 液相色谱仪为 Agilent 129 Infinity 液相色谱 梯度为 2 分钟内由 1% 的乙腈 / 水溶液到 1% 的乙腈, 并保持 2 分钟 流速为.6 毫升 / 分钟 色谱柱为 1.8 微米的 ZRBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱,2.1 毫米 1 毫米 基线峰宽为 5-6 秒, 峰容量为 1 最大压力为 75 巴 质谱仪为 Agilent 643 三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪系统, 其工作模式为电喷雾正极模式和单时间段多反应监测模式 每个化合物只有一个离子对, 且离子对的驻留时间为 1 毫秒 这些化合物为美国国家环境保护局 1694 号方法中的第 1 到第 4 组化合物, 再加上 15 种额外的药品 详细信息请参阅我们有关化合物及其离子对的应用报告 [2] 图 3A 液相色谱仪为 Agilent 129 Infinity 液相色谱 梯度为 2 分钟内由 1% 的乙腈 / 水溶液到 1% 的乙腈 流速为 1 毫升 / 分钟 色谱柱为 1.8 微米的 ZRBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱,2.1 毫米 5 毫米 基线峰宽为 1-3 秒, 峰容量为 6 最大压力为 78 巴 质谱仪为 Agilent 643 三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪系统, 其工作模式为电喷雾正极模式和两时间段多反应监测模式, 且每个时间段 6 种化合物 每个化合物只有一个离子对, 且离子 对的驻留时间为 5 毫秒 这些化合物都是从美国国家环境保护局 1694 号方法中选取的一系列 12 种化合物 图 3B 液相色谱仪为 Agilent 129 Infinity 液相色谱 梯度为 2 分钟内由 1% 的乙腈 / 水溶液到 1% 的乙腈 流速为 1 毫升 / 分钟 色谱柱为 1.8 微米的 ZRBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱,2.1 毫米 5 毫米 基线峰宽为 1-3 秒, 峰容量为 6 最大压力为 78 巴 质谱仪为 Agilent 643 三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪系统, 其工作模式为电喷雾正极模式和三时间段多反应监测模式, 且每个时间段三种化合物 每个化合物只有一个离子对, 且离子对的驻留时间为 5 毫秒 这些化合物包括卡马西平 古丁尼 咖啡因 苯海拉明 噻菌灵和三甲氧苄二氨嘧啶, 均选自美国国家环境保护局 1694 号方法 图 4 和图 5 液相色谱仪为 Agilent 129 Infinity 液相色谱 梯度为 2 分钟内由 1% 的乙腈 / 水溶液到 1% 的乙腈 流速为 1 毫升 / 分钟 色谱柱为 1.8 微米的 ZRBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱,2. 毫米 5 毫米 基线峰宽为 1-3 秒, 峰容量为 6 最大压力为 9 巴 质谱仪为 Agilent 652 精确质量四极杆 - 飞行时间串联液相色谱 / 质谱联用仪系统, 其工作模式为 2-GHz 模式下的电喷雾正极模式, 在质量准确度大于 2 ppm 下每秒扫描 2 次 化合物为 28 年 Thurman 等人报道的农药列表中的 22 种农药混合物 图 6 液相色谱仪为 Agilent 129 Infinity 液相色谱 梯度为 2 分钟内由 1% 的乙腈 / 水溶液到 1% 的乙腈 流速为 1 毫升 / 分钟 色谱柱为 1.8 微米的 ZRBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱,2.1 毫米 5 毫米 基线峰宽为质谱每秒扫描次数的函数 最大压力为 78 巴 质谱仪为 Agilent 643 三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪系统, 其工作模式为电喷雾正极模式和单时间段多反应监测模式, 且该时间段内化合物为卡马西平 化合物有一个离子对, 且离子对的驻留时间范围为 1-3 毫秒, 相应的扫描频率为每秒 3 到 2 次以上 CHCN 41

42 图 7 液相色谱仪为 Agilent 129 Infinity 液相色谱 梯度分别为 2 分钟 6 分钟和 3 分钟由 1% 的乙腈 / 水溶液到 1% 的乙腈 流速为.6 毫升 / 分钟 色谱柱为 1.8 微米的 ZRBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱,2. 毫米 1 毫米 基线峰宽为 2-6 秒, 峰容量为 6 最大压力为 75 巴 质谱仪为 Agilent 643 三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪系统, 其工作模式为电喷雾正极模式和单时间段多反应监测模式, 且该时间段内的化合物为咖啡因 化合物有一个离子对, 且离子对的驻留时间为 5 毫秒 样品制备药物分析标准物购自 Sigma 公司 ( 美国密苏里州圣路易斯市 ) 根据单个化合物在乙腈或甲醇中的溶解度大小, 在纯乙腈或甲醇中制备单个药物的母液 ( 浓度约 1 克 / 毫升 ), 并在零下 18 摄氏度条件下储存 然后利用这些母液, 通过乙腈和水的稀释来制备工作标准溶液 农药分析标准物购自 Ehrenstorfer 博士公司 ( 德国奥斯堡市 ) 根据单个化合物在乙腈或甲醇中的溶解度大小, 在纯乙腈或甲醇中制备单个农药的母液 ( 浓度约 1 克 / 毫升 ), 并在零下 18ºC 条件下储存 然后利用这些浓溶液, 通过乙腈和水的稀释来制备工作标准溶液 废水样品采集自博尔德市克里克 ( 科罗拉多州博尔德市 ) 的污水处理站, 并采用修订的美国国家环境保护局方法, 通过聚合物萃取柱对废水样品进行萃取 将 1 升废水样品直接萃取到 5- 毫克萃取柱中, 未进行 ph 值调节 空气干燥 1 分钟后, 用 8 毫升甲 醇稀释 将甲醇蒸发至 1 毫升, 再用液相色谱 / 质谱 / 质谱联用仪仪分析 详细描述见下文 空白 废水提取物被用来制备标准品溶液, 以用于方法确证 采用不同浓度 ( 浓度范围为.1 到 5ppb) 的药物标准混合物对废水提取物进行加标处理, 然后进行液相色谱 / 质谱 / 质谱分析 结果与讨论 本应用报告主要分成三个部分进行实例讨论 : 利用美国国家环境保护局 1694 号方法进行废水中药物分析时的峰容量和快速分离, 农药的超高效液相色谱和液相色谱 / 飞行时间 - 质谱联用仪分析, 以及超高效液相色谱 / 质谱联用仪中一些重要的色谱相关因素 第一部分 : 利用液相色谱 / 质谱 / 质谱联用仪进行环境药物分析 美国国家环境保护局第 1694 号方法是一套标准方法, 它需要耗费 2 分钟甚至更长的分析时间 然而, 美国国家环境保护局公布的有关该方法的最新修订表明, 如果使用了足够的质谱分析 ( 例如每个化合物 2 个离子对 ), 那么其它色谱条件也是可以采用的, 如更短的分析时间和快速分离 图 1 显示了应用新型 Agilent 129 Infinity 超高性能液相色谱系统, 可将分析时间从 3 分钟减少至 1 分钟, 分析时间降低 66% 的同时峰容量达到了 1 最初的美国国家环境保护局方法使用的是 3.5 微米 ZRBAX Eclipse Plus- C18 色谱柱, 而在快速分离条件中则采用了 1.8 微米 ZRBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱, 色谱柱尺寸 2.1 毫米 5 毫米 图 1 表明应用新型 Agilent 129 Infinity 超高性能液相色谱系统进行美国国家环境保护局第 1694 号方法中第一组药物的分析时, 可将分析时间从 3 分钟减少至 1 分钟 CHCN 42

43 x MRM (436. -> 277.) 1 ppb_group 1_2 transitions.d Part A. 3-min analysis with 3.5 µm ZRBAX Eclipse Plus-C18 for EPA 1694 for 46 compounds in 3-min gradient at.6 ml/min Peak capacity 1 Counts vs. acquisition time (min) ESI EIC( , ) Scan Frag=19.V Group1_resolution_5mm_3scans.d 1 Part B. 1-min analysis with 1.8 µm ZRBAX Eclipse Plus-C18 for EPA 1694 for 46 compounds at.6 ml/min Peak capacity Counts vs. acquisition time (min) 图 1 表明应用新型 Agilent 129 Infinity 超高性能液相色谱系统进行美国国家环境保护局第 1694 号方法中第一组药物的分析时, 可将分析时间从 3 分钟减少至 1 分钟 由于压力是 375 巴, 因此通过替换更长的色谱柱 (2.1 毫米 x 1 毫米 ) 和保持相同的.6 毫升 / 分钟的流速, 就有可能较容易的实现峰容量和可分离药物数量的增加 使用更长的色谱柱将使得压力成倍提高, 从 375 巴提高至 75 巴 该结果如图 2 中所示 对于通过三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪分析的药物, 也可以应用 Agilent 129 Infinity 液相色谱进行超快速色谱分析 图 3 中的实例表明, 为了获得对每个峰至少 2 次的扫描, 化合物的 数量已经减少到 12 种化合物 通过获得 2 次甚至更多的扫描次数, 峰宽可能会减少至 1-2 秒, 从而实现了超快速色谱分析 色谱柱为 ZRBAX Eclipse Plus-C18, 2.1 毫米 5 毫米, 流速为 1.2 毫升 / 分钟, 梯度为 1.5 分钟 12 种药物在不到 6 秒内被洗脱出来 就我们目前所知, 这还是第一个将超快速色谱分析应用于环保样品的例子 在这个实例中, 来自于科罗拉多州博尔德市的废水样品中包含有以下药物 : 卡马西平 古丁尼 咖啡因 苯海拉明 噻菌灵以及三甲氧苄二氨嘧啶 CHCN 43

44 1 5 4 Cpd 1:.764: +ESI EIC( , , ) Scan Frag=19.V Groups1-4+Extras_resolution_1mm.d vs. 图 2 峰容量的增加表明 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统通过超高效液相色谱可以在 2 分钟之内将美国国家环境保护局第 1694 号方法中所列的所有药物外加 15 种全新化合物, 共 9 种药物分离开来 该 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统采用了装填 1.8 微米固定相的 ZRBAX Eclipse Plus-C18 色谱柱, 色谱柱尺寸为 2.1 毫米 1 毫米 色谱图中峰宽为 5 到 6 秒, 峰容量为 ESI MRM Frag=9.V CID@35. (415. -> 159.) Group1_C18_speed grad_15comp_bis.d ZRBAX Exlipse Plus-C18, 2.1 mm 5 mm 1.2 ml/min 78 bar % vs. 图 3A 12 种药物标准物的超快速梯度 CHCN 44

45 当使用超快速梯度条件时, 认识到需要质量保证和质量控制的数据是非常重要的 因此, 所有样品的净化措施必须在样品制备期间完成, 以最大限度的减少干扰 由于整个样品是在一个非常窄的窗口范围内被洗脱的, 因此使用带标记的内标进行定量也是很有必要的 129 Infinity 的重复时间在一秒钟以内, 能够很容易获得可靠的数据 液相色谱 / 质谱 / 质谱联用仪中至少两个离子对的应用也是同样重要的, 一个用于定量, 另一个则作为定性离子 更多的实例可参见我们有关 EPA 方法的应用报告 [2] ESI MRM Frag=11.V CID@25. ( > 158.) Boulder effluent_c18_speed grad_15comp.d % vs. 图 3B 来自美国科罗拉多州博尔德市废水样品的超快速梯度 检测到的化合物包括 : 卡马西平 古丁尼 咖啡因 苯海拉明 噻菌灵以及三甲氧苄二氨嘧啶 CHCN 45

46 第 2 部分 : 超高效液相色谱和液相色谱 / 飞行时间 / 质谱进行快速分离色谱分析的首要问题就是利用质谱仪在 1-2 秒的狭窄峰宽内获得良好的数据采集 在之前的实例中, 我们展示了如何利用三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪来获得良好的数据采集, 并保证每个峰都有 2 次以上的扫描次数 当有非常多的化合物需要监测时, 液相色谱 / 飞行时间质谱和液相色谱 / 四极杆 - 飞行时间串联质谱的应用使得该项工作变得容易 这是因为飞行时间质谱仪是在全谱模式下持续采集计数据的 只需要将飞行 时间质谱仪的软件设置为每秒采集 2 个谱图即可 图 4 显示了当采用液相色谱 / 飞行时间质谱或液相色谱 / 四极杆 - 飞行时间串联质谱进行超高效液相色谱分析时, 上述方法的有效性 采用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统可以在 8 秒内分析超过 1 种农药, 其中色谱柱为 ZRBAX Eclipse Plus-C18, 色谱柱尺寸 2.1 毫米 5 毫米, 流速为 1.5 毫升 / 分钟 超高效液相色谱分析要求压力达到 9 巴 分离的半峰宽只有.7 秒 除草剂 特丁净的结果见图 5 中所示 Cpd 19: (2 ppm mass tolerance, MFE) 5 pg on-column ZRBAX Eclipse Plus-C18, 2.1 mm 5 mm 1.8 µm Flow rate 1.5 ml/min 9 bar % VS. 图 4 利用液相色谱 / 飞行时间质谱联用仪, 在 2 分钟时间内完成农药中超过 1 种化合物的分析 CHCN 46

47 液相色谱 / 飞行时间质谱联用仪的色谱速度 分离效果和强大的功能使得其能在数分钟内对食物或水样品中农药的复杂混合物进行分析 在欧洲, 这种快速分析方法已经被允许应用于食品监控领域, 且只有当农药分析完成后, 船运来的蔬菜和水果才被允许卸载上岸 因此, 在这些应用当中, 快速分析是非常重要的 Cpd 19: VS. 图 5 采用 Agilent129 Infinity 系统的半峰宽为.7 秒, 该系统的色谱柱为 ZRBAX Eclipse Plus-C18, 色谱柱尺寸为 2.1 毫米 5 毫米, 流速为 1.5 毫升 / 分钟, 压力为 9 巴 CHCN 47

48 第 3 部分 : 超高效液相色谱 / 质谱联用仪中色谱方面的相关要素为了充分利用超高效液相色谱而进行的色谱仪和质谱仪条件的优化包括以下几个方面 首先, 为了获得超快速色谱 1-2 秒的峰宽, 每个峰至少应有 2 个质谱数据采集点 有关每秒数据周期的重要性如图 6 中所示 低采集周期率条件下, 常规的平滑曲线处理会导致峰宽变大 平滑曲线是为了获得好的峰形以利于积分和定量, 这也是所有色谱软件的一个常用步骤 因此, 当使用三重串联四极杆液相色谱 / 质谱联用仪时, 推荐您选取较短的 5 毫秒驻留时间和动态多反应监测程序, 以确保获得每个峰的 2 个采集周期 在使用液相色谱 / 飞行时间质谱和液相色谱 / 四极杆 - 飞行时间串联质谱联用仪的实例中, 只需要将软件设置为在需要的质量范围内每秒采集 2 个谱图即可 其次, 定量分析也是好的超高效液相色谱应用应该考虑的一个方面 在这里, 获得最大的峰灵敏度是非常重要的 图 7 显示的实 例表明, 通过调节梯度和流速直至获得最大峰信号, 可以使得咖啡因的峰强和峰面积最大化 在这个实例中,6 分钟梯度产生了 18 的最佳信噪比和 1.7 分钟保留时间下 55, 个峰面积计算点 应该注意的是, 当梯度延长到 3 分钟而保留时间仅只增加.2 分钟时, 信噪比降低了一半, 其值仅为 91 因此, 调节不同的流速和保留时间以获得最佳峰强度是非常重要的 ; 特别是色谱分析中的极性的和较早洗脱的化合物 好的超高效液相色谱应用应该考虑的最后一点是液相色谱 / 质谱联用仪信号的干扰 由于标准品的混合物纯度高, 其在进行快速或超快速分析时, 往往只产生较少干扰或不产生干扰 然而, 实际样品是可能产生干扰的 ; 因此, 在萃取过程中对样品进行稀释或纯化以限制所分析的基质量是非常重要的 然而, 在废水或其它复杂基质的药物检测中, 使用氘或 C-13 标记的标准物也是很有价值的 该方法也被美国国家环境保护局第 1694 号方法所推荐, 读者可参考我们有关该主题方面的应用报告 [2] 1 cps >2 cps 5cps 3cps 图 6 该图显示了驻留时间和各峰数据点数量的影响, 以及驻留时间和各峰数据采集点如何影响单个化合物 - 卡马西平的峰形, 范围从 1 秒峰宽下的每秒大于 2 个采集周期的到 3-4 秒峰宽下的每秒 3 个采集周期 CHCN 48

49 ESI TIC MRM Frag=11.V CID@** (** -> **) Caffeine_C18_long grad_5ul.d K K K ZRBAX Eclipse Plus-C % 1% 75.6 / VS. 图 7 咖啡因的液相色谱 / 质谱分析中保留时间对信噪比 (S/N) 和峰面积大小的影响 结论 我们的结论是, 在进行快速分离和超快速色谱分离时, 推荐使用 ZRBAX Eclipse Plus-C18,2.1 毫米 5 毫米色谱柱, 而如果要获得最大峰容量,ZRBAX Eclipse Plus-C18,2.1 毫米 1 毫米色谱柱则是较好的选择 我们的结果表明, 可以采用大于 1.5 毫升 / 分钟的流速, 而压力大于 1 巴时也可能得到较高的可信度和可靠性 最后, 我们将 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统视作从 Tsweet 重力色谱柱到超高效液相色谱领域的 简单易用 超快速高压液相色谱进化的最佳实例 致谢 本中心诚挚的感谢来自安捷伦科技公司的 Jerry Zweigenbaum 博士 Michael Woodman 博士和 Peter Stone 博士的帮助和建议 参考文献 1. EPA Method 1694: Pharmaceuticals and personal care products in water, soil, sediment, and biosolids by HPLC/MS/MS, December 27, EPA-821-R I. Ferrer, E. M. Thurman, J. A. Zweigenbaum, EPA Method 1694: Agilent's 641A LC/MS/MS Solution for Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water, Soil, Sediment, and Biosolids by HPLC/MS/MS, 28, Application Technologies publication EN, 3. E. M. Thurman, I. Ferrer, J. A. Zweigenbaum, Multi- Residue Analysis of 31 Pesticides in Food Samples by LC/Triple Quadrupole Mass Spectrometry, 28, Application Technologies publication 更多信息 有关我们产品和服务的更多信息请访问我们的网站 CHCN 49

50 CHCN 5

51 使用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统筛查精细化学品中的杂质 应用报告 精细化工 作者 Michael Woodman Agilent Technologies, Inc. 285 Centerville Road Wilmington, DE 1988 USA 摘要 使用配有紫外 / 可见光 (UV/VIS) 二极管阵列检测器 (DAD) 的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统对辛基二甲基对氨基苯甲酸中的杂质进行分析 该系统用 1.8 µm 填料 内径为 3. mm 和 2.1 mm, 不同长度的 C18 色谱柱, 压力在 6 bar(9 psi) 或 12 bar (18, psi) 下, 进行化合物与杂质的色谱分离 报告表明, 在低粘度乙腈 (ACN) 与高粘度甲醇 (MEH) 溶剂条件下,Agilent 129 Infinity 液相色谱系统能够用高分离度长色谱柱进行快速分析 CHCN 51

52 前言 为了确保产品质量 性能以及消费者安全, 分析原料 中间体以及最终用途广泛的成品中的杂质分析至关重要 使用高效液相色谱 (HPLC) 成功进行杂质分析的基本条件包括整个分离过程中的梯度洗脱和多波长检测, 并可从其他检测器中获益, 如蒸发光散射仪 (ELSD) 和质谱仪 (MS) 由于杂质测定是首要目标, 我们需要确保流动相 样品瓶及 HPLC 组件中无杂质, 杂质的存在可能干扰分析结果 小心稀释空白, 空白由于额外的样品制备步骤 ( 如, 过滤 ) 也可能带来污染 分析顺序可以按照生产原料 溶剂或稀释空白运行 通常也包括将主成分稀释到杂质检测可能要求的最低浓度所制备的限定标样 最后, 一般还必须包括检测权威的高纯参考标样 对氨基苯甲酸 ( PABA) 历来用于防晒剂配方中的抗紫外线成分 由于 PABA 的使用可增加致皮肤癌的风险, 目前常用以辛基二甲基对氨基苯甲酸 (D-PABA) 形式的衍生物 不过, D-PABA 的降解可能形成 PABA, 因此监测 PABA 在 D-PABA 中的潜在存在非常重要 作为商业产品, 考虑到安全性和经济性, D-PABA 的纯度对于制造商来说十分重要 在本项工作中, 我们研究 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统 ( 耐 12 bar 压力限的 UHPLC 系统 ) 与紫外 / 可见二极管阵列检测器用于检测 D-PABA 样品杂质的能力 本项工作分析的 D-PABA 化合物的结构如图 1 所示 实验样品制备 D-PABA 的异丙醇溶液的初始浓度为 1mg/mL, 随后根据需要稀释到较低浓度 LC/DAD 系统的进样量为.2-2 µl LC 方法详细内容液相色谱条件 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统二元泵 G422A, Agilent 129 Infinity 液相色谱系统自动进样器 G4226A 配切换阀的安捷伦柱温箱 G1316C 配有 1 mm 光程光纤流通池的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统二极管阵列紫外 / 可见检测器 G4212A 色谱柱 : ( 具体使用见各自的色谱图 ) Agilent ZRBAX SB-C18 RRHT, 3 mm 5 mm, 1.8 µm 6 bar 部件号 Agilent ZRBAX SB-C18 RRHD, 2.1 mm 1 mm, 1.8 µm 12 bar, 部件号 Agilent ZRBAX SB-C18 RRHD, 2.1 mm 15 mm, 1.8 µm 12 bar, 部件号 柱温 : 4 C 流动相 : A = HPLC 级水 B = 乙腈 (ACN) 或甲醇 (MEH)( 具体流动相见各自的色谱图 ) 流速 : 具体流速见各自的色谱图梯度 : 梯度条件为 4 % 至 9% 的乙腈或 5% 至 1% 的甲醇 梯度斜率一直维持在每个柱体积增加 3.5% 的有机相, 相应地改变梯度时间和流速 这是使用安捷伦方法转化器计算而确定的 [1] UV 条件 H 3 C N H 3 C (CH 2 ) 3 CH 3 CH 3 C 17 H 27 N 2 检测波长 21,254,28 和 32 nm, 带宽 4 nm, 参考波长关闭 图 1 辛基二甲基氨基苯甲酸 (D-PABA) CHCN 52

53 结果和讨论 用 4 个波长检测 D-PABA 的 UV 响应, 如图 2 所示, 保留时间为 2 min 分离过程的多波长检测提供了一种简单的方法来捕获多种杂质, 并协助最终波长条件的选择以达到所有分析物检测灵敏度最大化 辛基二甲基氨基苯甲酸,4 C,1.5 ml/min,4% 至 9% 乙腈 / 水,2 min ZRBAX StableBond C18 的柱压高达 46 bar,3 mm 5 mm 图 2 D-PABA 生产原料的多波长 UV 色谱图,3 mm 5 mm ZRBAX 快速分离高通量 (RRHT) 色谱柱 色谱图表明了此类分离所遇到的典型困难, 需要宽范围动态检测和灵敏的杂质测量 通过保留时间匹配和紫外光谱确定,.75 分钟处的峰是 PABA, 它是混合物中的主要杂质 CHCN 53

54 图 3 如图 2 所示的基于 3 mm 5 mm 的梯度分离色谱图的扩展展示 图 3 中扩展的多波长色谱图显示了具体细节和杂质数量, 也有几处对个别组分的分离度显然不够 尽管采用了小粒径填料, 但由于色谱柱相对较短, 从而限制了总分离度 当我们换为长色谱柱长度时, 常会减少其直径, 以减少同一时间内溶剂的消耗 CHCN 54

55 图 4 标准物质的分析,2.1 mm 1 mm Agilent ZRBAX StableBond C18 色谱柱, 在 12 bar 压力限值下操作 乙腈 - 水梯度,.74 ml/min, 梯度时间 4. 分钟 从图 4 可见, 增加柱长可以显著地提高一些已检测到的组分的分离效果 要进一步提高分离度, 需要研究更长的色谱柱 可替代的流动相或色谱柱填料 CHCN 55

56 图 5 乙腈分离的扩展视图, 使用相同梯度斜率在 2.1 mm 15 mm 色谱柱,12 bar 额定操作压力 Agilent ZRBAX StableBond C18,1.8 µm 增加柱长显然可以增强分离度, 但若在常规的压力范围内操作, 增加的背压也会限制流速 配以 ZRBAX 超高压快速高分离度 (RRHD) 色谱柱的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统的工作压力可达 12 bar( 约 18, psi) 为了确保系统的持久稳定运行, 许多用户通常会为方法指定一个压力上限, 其值略小于额定操作压力的 8% CHCN 56

57 辛基二甲基对氨基苯甲酸,.52 ml/min,5% 至 1% 甲醇 / 水,5.7 min 柱压高达 845 bar 的 Agilent ZRBAX StableBond C18 色谱柱,2.1 mm 1 mm,1.8 µm 图 6 样品混合物的分离,2.1 mm 1 mm Agilent ZRBAX StableBond C18 色谱柱, 甲醇为有机相 流速.52 ml/min, 梯度时间 5.7 min, 梯度为 5% 至 1% 甲醇 当考虑分离度计算公式的基本参数时, 我们都十分熟悉柱容量 选择性以及效率的概念 增加柱长和减少填料粒径一样, 都会提高整体分离效率 由于效率提高会使分离度相对降低, 用户需通过摸索能促进分离选择性提高的可改变的化学变量, 以优化容量因子 在图 6 中可见以甲醇替代乙腈为有机相所产生的显著效果 若这个分离高度依赖于低波长监测, 人们可能会对甲醇的紫外截止波长 (25 nm) 产生疑问 然而, 在本例中, 本体高度共轭结构和相关杂质的结构使得检测器能在波长远高于反相色谱常用的有机溶剂的紫外截止波长处进行灵敏的检测 在与图 5 中示例相同的分析时间内, 我们得到了更高的选择性, 从而分离更多杂质, 同时减少溶剂消耗, 且无需使用昂贵的乙腈作有机相 CHCN 57

58 辛基二甲基氨基苯甲酸,.52 ml/min,5% 至 1% 甲醇 / 水,5.7 分钟柱压高达 845 bar,agilent ZRBAX StableBond C18 色谱柱,2.1 mm 1 mm,1.8 µm,4 C 图 7 图 6 色谱中小区域的扩展视图, 显示了多种低浓度杂质 条件如图 6 最小峰的杂质浓度预计小于.2 结论 合成材料和高度精炼的天然产品中低浓度杂质的检测, 对这些产品的最终利用至关重要 高效液相色谱使用高分离度色谱柱和选择适当的有机相进行快速分析, 保证了结果的一致性和分析的高速度 利用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统, 我们能很容易地证明 UHPLC 在系统工作范围 内性能优异 通过增加流速, 同时缩短部分梯度时间段, 重新生成梯度斜率, 可以获得更高的分析通量, 缩短了总分析时间 欲了解更多信息 欲了解更多有关我们产品和服务的信息, 请访问我们的网站 参考文献 1. en-us/products/instruments/lc/ pages/gp6931.aspx) CHCN 58

59 用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统 UHPLC 进行完整甘油三酯的高分离度反相高效液相色谱分析 应用报告 食品, 石化 作者 Michael Woodman Agilent Technologies, Inc. 285 Centerville Road Wilmington, DE 1988 USA 摘要 使用配置紫外 / 可见光 (UV/VIS) 二极管阵列检测器 (DAD) 的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统在无水反相梯度条件下, 分析大豆油中的甘油三酯 使用 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统在不同长度 1.8 µm 充填粒度 6bar(9psi) 或 12bar(18, psi) 压力下 内径为 3. mm 和 2.1 mm 的 C18 色谱柱上进行样品的色谱分离 本报告演示了异丙醇 (IPA) 或甲基叔丁基醚 (MTBE) 作为强溶剂和乙腈作为弱组分的混合流动相条件下,Agilent 129 Infinity 液相色谱系统能够采用高分离度长色谱柱 CHCN 59

60 前言 对来自动物或植物的完整甘油三酯进行分析具有很强的实用价值, 包括加深对甘油三酯化学组成的理解 评估燃料潜热 了解生物系统的脂代谢行为 高效液相色谱 (HPLC) 成功分析这些组分的基本条件包括 : 梯度洗脱及整体分离过程的低波长监测 甘油三酯发色团相对较少, 这有利于使用蒸发光散射检测器 (ELSD) 或质谱仪, 以便于实现分离的其他目的 在此应用的开发过程中, 我们对来自大豆 玉米 米糠 红花 葡萄籽 橄榄及棕榈油的植物油进行了分析 由于大豆油在美国广泛使用, 且对生物燃料生产的意义不断增长, 本应用的主要工作是最大限度地使大豆油甘油三酯的分离度符合标准要求 这些基本条件也适用于各种包括源自动物脂肪的样品 完整甘油三酯通常水溶性非常低, 因此常采用常规色谱法进行分离, 该方法主要依靠极性功能团的差异分离样品, 或非水分离模式的反相色谱法, 它对于如链长或链不饱和度等碳性的微小差异有更好的选择性 据珀金斯公布的资料 [1], 在大豆油中发现的主要脂肪酸 ( 甘油三酯的甘油骨干组成部分 ) 是肉豆蔻 (14:) 棕榈 (16:) 油酸 (18:1 ) 亚油酸(18:2) 和亚麻酸 (18:3), 也存在许多其他小脂肪酸 因为脂肪酸都是随机构造为甘油三脂, 所以脂肪酸亚结构的广泛转换是可能存在的 由于脂肪酸之间的主要差别是碳链长度和双键数, 所以甘油三酯的多样性主要呈现非极性有机结构的特征 因此, 反相色谱最适于此类应用 由于甘油三酯的水溶性极差, 您可以选择一个与水含量相关的较高的有机起始点, 或如本报告, 选择一个完全无水的分离环境 甘油三酯的典型结构如图 1 所示 [2] 在这个图中, 从上到下, 分别为棕榈酸 (C16:) 油酸(C18:1) a- 亚麻酸 ( C18:3), 显示了其链长和不饱和度 化学式为 C 55 H 98 6 实验 样品制备初始溶液的浓度为 1 mg/ml, 异丙醇或甲醇 / 甲基叔丁基醚体积比为 2:1, 随后根据需要稀释到更低浓度 LC/DAD 系统的进样量为.2-2 µl H 2 C *HC H 2 C α 图 1 典型的甘油三酯结构图 LC 方法详细说明 液相色谱条件 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统二元泵 G422A, Agilent 129 Infinity 液相色谱系统自动进样器 G4226A 配切换阀的安捷伦柱温箱 G1316C 配有 1mm 通径光纤流通池的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统二极管阵列紫外 / 可见检测器 G4212A 色谱柱 : ( 具体使用见各自的色谱图 ) Agilent ZRBAX SB-C18 RRHT,3 mm 15 mm, 1.8 µm 6 bar, 部件号 Agilent ZRBAX SB-C18 RRHD, 2.1 mm 1 mm, 1.8 µm 12 bar, 部件号 Agilent ZRBAX SB-C18 RRHD, 2.1 mm 15 mm, 1.8 µm 12 bar, 部件号 某些情况下, 色谱柱要串联以增加长度和分离度柱温 : 2 C 或 3 C 流动相 : A= 乙腈 B= 异丙醇 (IPA) 或甲基叔丁基醚 (MTBE)( 具体流动相见各自的色谱图 ) 流速 : 具体流速见各自的色谱图梯度 : 基于与 IPA 相比,MTBE 的洗脱强度高, 梯度条件为 2% 至 6% 的异丙醇或 1% 至 4% 的 MTBE 对于异丙醇梯度, 梯度斜率一直维持在每柱容增加 2.6% 的有机相,MTBE 为 2.%, 相应地改变梯度时间和流速 这是使用安捷伦方法转化器计算而确定的 [3] UV 条件 : 监测 21 nm 22 nm 和 23 nm, 带宽 4 nm, 参考波长关闭 ω CHCN 6

61 结果和讨论 以乙腈 IPA 梯度对甘油三酯的典型梯度分离如图 2 所示 一些通用的解释适用于图 2 中所示的条件和色谱图 虽然最理想的弱洗脱液是价格略低的甲醇, 而甲醇或者是含有甲醇的改性乙 醇的引入使甘油三酯的整体分离度显著降低 当从异丙醇到乙腈的梯度运行时, 操作压力的大幅度增加明显受限, 不可取 采用提高色谱柱的操作温度来降低溶剂粘度的方法已被证明是不可取的, 因为色谱分离能力往往随着温度上升而衰减 图 2 3 mm 15 mm ZRBAX 快速分离高通量 (RRHT) 色谱柱,1.8 µm 柱上大豆油样品的 21-nm UV 色谱图, 上图 系统压力跟踪显示梯度洗脱的总进程, 下图 流速.6 ml/min, 梯度时间 24 分钟 强溶剂, 异丙醇 色谱图表明了此类分离所遇到的典型困难, 即类似甘油三酯的小簇色谱峰 这些小簇并非碳原子数和不饱和度相同的位置异构体, 而是在质谱评估中链长和双键数不同的化合物的混合物 CHCN 61

62 Soybean 大豆油,1 il, µg,.6 1 µg,.6 ml/min,2% ml/min, 2% 至 6% to 6% 的异丁醇 IPA/ACN / 乙腈, over 分钟 minutes. Up 高达 to37 37bar bar 的柱压 on ZRBAXStableBondC18,3mm 15mm1.8µm,3 C,ZRBAX 8 色谱柱,3 1.8 µm,3 C 大豆油 Soybean,1 il, µg,.6 1 µg, ml/min,2%.6 ml/min, 2% 至 6% to的异丁醇 6% IPA/ACN / 乙腈, over 24 分钟 24 minutes. 高达 Up to 4 4 bar bar 的柱压 on ZRBAXStableBondC18,3mm 15mm1.8µm,2 C, 8 色谱柱,3 1.8 µm,2 C 图 3 在 3 C 时图 2 所示色谱图的扩展展示, 上图, 与图 2 相同条件下操作柱温为 2 C 时进行比较 从图 3 可见, 分离操作温度为 2 C, 而非 3 C 时, 分离效果得到改善 温度更低时, 操作压力增加约 1% 由于需折衷考虑分离和操作压力, 许多操作在 3 C 进行 ; 而借助操作压力更高的 Agilent 129 Infinity 液相色谱系统, 使我们能将温度降至 2 C, 并有效改善分离效果 CHCN 62

63 Soybean il, 1 µg,.29 ml/min, 2% to 6% IPA/ACN over 27 minutes. 大豆油 Up to,1 76 µg,.29 bar on ZRBAXStableBondC18,2.1mm 25mm1.8µm,2 C ml/min,2% 至 6% 的异丁醇 / 乙腈, 27 分钟 高达 76 bar 的柱压,ZRBAX StableBond C1 8 色谱柱,2.1 mm 25 mm 1.8 µm,2 C 图 4 大豆油样品的分析在 Agilent ZRBAX StableBond C18 色谱柱,2.1 mm 25 mm,1.8 µm,(15 mm 与 1 mm 连接 ), 在 12 bar 压力限值下操作 流速.29 ml/min, 梯度时间 27 分钟 观测到的最大压力为 76 bar 从图 4 可见, 柱长增加使得一些观测组分的分离度显著增加 为了进一步提高分离度, 需开发更长的色谱柱 寻找可替代流动相或色谱柱填料 与大多数高效分离一样, 速度限制因素包括操作压力 操作温度和最高流速 迄今已评估过的甘油三酯分离方法在更高柱温或更高流速条件下, 尚不被接受 这可能是由于甘油 三酯相对较高的分子量和柔性有机结构 即使非常小心地转换梯度斜率, 以确保方法转化时, 有机溶剂强度仍保持一致, 但在更高的流速操作时, 仍持续呈现整体分离能力的退化 由于异丙醇有很高的粘度和压力, 应考虑其他易混溶于乙腈并易于低紫外检测的非极性溶剂, 作为异丙醇的替代品 CHCN 63