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弱殷
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1 第 9 卷第 19 期食品安全质量检测学报 Vol. 9 No 年 10 月 Journal of Food Safety and Quality Oct., 2018 一例沙门氏菌测量审核的回顾与分析魏静元 *, 孙晶, 姜薇, 王志嘉, 王歆睿 ( 辽宁省分析科学研究院, 沈阳 ) 摘要 : 目的通过测量审核提升本实验室检测沙门氏菌能力与自身竞争力方法以测量审核作业指导书出入境检验检疫行业标准 SN/T 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR 法和国家标准 GB 食品微生物学检验沙门氏菌检验为依据, 采用 PCR 方法和传统增菌分离生化反应血清学法鉴定沙门氏菌结果检出非沙门氏菌结论编号 091 样品检出沙门氏菌, 编号 123 样品 PCR 检测出现假阳性, 经生化鉴定证实 PCR 出现假阳性, 需经生化鉴定予以确认本次测量审核样本检测结果与制样单位反馈结果一致关键词 : 测量审核 ; 沙门氏菌 ; 快检 Review and analysis of a case of Salmonella spp. measurement audit WEI Jing-Yuan *, SUN Jing, JIANG Wei, Wang Zhi-Jia, WANG Xin-Rui (Liaoning Province Academy of Analytic Sciences, Shenyang , China) ABSTRACT: Objective To improve the laboratory's ability and self competitiveness to detect Salmonella by measurement audit. Methods Salmonella was identified by PCR method, traditional bacteria increasing, separation and biochemical reaction and serological identification method, according to the guidance book of measurement audit, entry-exit inspection and quarantine industry standard SN/T PCR The rapid detection of multiple pathogens in foods-pcr method and national standard GB National food safety standard-food microbiological examination-salmonella. Results Salmonella was detected from samples No. 091, and false positive was detected by PCR from samples No. 123, which was confirmed to be non-salmonella by biochemical identification. Conclusion False positive PCR should be confirmed by biochemical identification. The results of this measurement audit sample are consistent with the feedback results of sample preparation units. KEY WORDS: measurement audit; Salmonella; fast test 1 引言测量审核是实验室对被测物品 ( 材料或者制品 ) 进行实际测试, 将测试结果与参考值进行比较的活动, 通过对测量结果的满意度判定来验证实验室开展该项目检测或者是校准的能力, 也是中国合格评定国家认可委员会 (China National Accreditation Service for Conformity Assessment, CNAS) 判定实验室能力的重要技术依据 [1,2] 基金项目 : 辽宁省自然科学基金指导计划 ( ) Fund: Supported by the Guidance plan for Liaoning Natural Science Foundation ( ) * 通讯作者 : 魏静元, 博士, 副研究员, 主要研究方向为食品质量与生物安全 @qq.com *Corresponding author: WEI Jing-Yuan, Ph.D, Associate Professor, Liaoning Province Academy of Analytic Sciences, No.103, Wanliutang Road, Shenhe District, Shenyang , China @qq.com

2 5070 食品安全质量检测学报第 9 卷沙门氏菌 (Salmonella spp.) 是一种最常见的造成食物中毒的食源性无荚膜和芽孢的革兰氏阴性肠道致病杆菌, 易引起诸如伤寒急性肠胃炎菌血症和败血症等疾病, 严重危害人体健康 [3-6] 当前沙门氏菌的检测方法主要包括依赖培养生化鉴定及血清分型的传统方法靶向于种属特异性核苷酸序列的分子生物学法 ( 如 PCR 法基因探针法等 ) 以及基于免疫学原理的酶联免疫法试纸条法免疫磁珠吸附法等 [7], 不同检测方法各有利弊 PCR 法具有检测方便快捷准确样品需量少等特点, 但也会出现假阳性情况本文参照 SN/T [8] 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR 法标准和国家标准 GB [9], 利用快检试剂盒, 结合食品中沙门氏菌定性检测的测量审核过程, 作以回顾与分析, 对于出现的可疑阳性结果, 应进一步生化鉴定予以佐证, 旨在为沙门氏菌的分离与鉴定提供参考 2 材料与方法 2.1 待测样品食品 ( 乳粉 ) 中沙门氏菌 ( 定性测试 ) 检测测量审核样品, 测量审核编号为 MA , 样品序号为 091 和 123 各一份, 西林瓶装, 由大连中食国实检测技术有限公司提供 2.2 培养基及试剂沙门氏菌核酸扩增检测试剂盒 (PCR- 荧光探针法 ) 购自北京索奥生物医药科技有限公司缓冲蛋白胨水 (buffered peptone water, BPW) 四硫酸钠煌绿增菌液 (tatrathionate broth base, TTB) 亚硒酸盐胱氨酸增菌液 (selenite cystine broth, SC) 亚硫酸铋琼脂(bismuth sulfite agar, BS) XLD 琼脂 (xylose lysine deoxycholate agar) 沙门氏菌显色培养基 (chromogenic Salmonella agar, SA) 沙门氏菌生化鉴定盒沙门氏菌属诊断血清 (A-F) 购自宁波天润生物药业有限公司阳性菌株肠炎沙门氏菌 (CICC 21482) 购自中国工业微生物菌种保藏中心 2.3 仪器 2720PCR 仪 ( 美国 AB 公司 ); ClassⅡ 生物安全柜 ( 青岛海尔特种电器有限公司 ); LRH-150F 生化培养箱 ( 上海一恒科技有限公司 ); 高压灭菌锅 ( 上海博讯科技有限公司 ); 59XC 生物显微镜 ( 上海光学仪器六厂 ); 移液器 (0.5~10 μl, 大龙医疗设备 ( 上海 ) 公司 ); 510 凝胶成像系统 ( 美国 UVP 公司 ) 2.4 实验方法样品前处理及前增菌按照测量审核实施方提供的乳粉中沙门氏菌 ( 定性测试 ) 测量审核样品测试指导书 [10], 无菌开启西林瓶, 1 min 内加入少量 (2~4 ml) 稀释液进行溶解, 溶解后吸于无菌瓶反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁, 回收清洗液于上述无菌瓶中, 合计用稀释液 40 ml 此液即是待测样品将水化后之 25 ml 待测样品转移至 225 ml 的灭菌 BPW 增菌液中, 置于 (36±1) 生化培养箱中培养 24 h 同时, 取阳性对照菌 (CICC 21482) 接种于 225 ml 灭菌的 BPW 增菌液同步培养和后续实验, 作为阳性对照另作空白对照增菌轻摇已培养样品混合物, 分别取 1 ml 接种于 10 ml TTB 增菌液和 10 ml SC 增菌液中, 置培养箱分别以 (42±1) (TTB) 和 (36 ±1) (SC) 培养 24 h PCR 扩增以下除模板外的试剂皆来自沙门氏菌核酸扩增检测试剂盒取 1 ml 增菌液置于灭菌的洁净 1.5 ml 离心管中, g 离心 3 min, 弃上清, 沉淀加 50 μl 核酸提取液, 充分混匀后 100 煮沸 10 min, r/min 离心 3 min, 收集上清液作为 PCR 模板取单管单份反应管, 加入处理后的样品阴性质控品阳性质控品各 3 μl, r/min 瞬时离心 30 s, 按下列条件进行 PCR 反应 : 94 变性 2 min, s s s, 反应体积 30 μl, 35 个循环选择性分离分别取用接种环取 TTB SC 增菌液 1 环, 分别划线接种于 BS 琼脂平板 [(36 ±1), 48 h] XLD 琼脂平板 [(36±1), 24 h] 和沙门显色培养基平板 [(36±1), 24 h] 培养结束后观察各平板上有无可疑沙门氏菌属菌落生化实验挑取中得到的 2 个以上典型的沙门氏菌可疑菌落, 接种三糖铁琼脂, 先在斜面划线, 再于底层穿刺 ; 接种针不需灭菌, 直接接种赖氨酸脱羧酶实验培养基 (36±1) 培养 18~24 h 同时, 接种蛋白胨水 ( 供做靛基质实验 ) 尿素氰化钾 (KCN) 培养基, 36 ±1 培养 18~24 h, 必要时可延长至 48 h 血清凝集实验血清凝集实验采用玻片凝集法, 在洁净玻片上滴加 1 滴 A-F 群多价 O 抗血清, 用接种针挑取菌落与血清混合, 并轻轻碾磨均匀, 将玻片倾斜摇动混合 1 min, 对照黑背景观察有无凝集现象, 同时用生理盐水作对照 3 结果与分析 3.1 增菌和选择性分离结果分离平板上的菌落特征见表 1 从表 1 可以看出, 2 个

第 19 期魏静元, 等 : 一例沙门氏菌测量审核的回顾与分析 5071 表 1 生长情况及菌落特征 Table 1 Bacterial growth and colony characteristics 样品编号 BPW TTB SC 沙门显色 BS 091 变黄变红品红色和蓝绿色菌落带金属光泽黑色菌落, 周围培养基变黑 123 略浊绿色变红白色和蓝绿色菌落黑色菌落阳性菌株变黄

3 第 19 期魏静元, 等 : 一例沙门氏菌测量审核的回顾与分析 5071 表 1 生长情况及菌落特征 Table 1 Bacterial growth and colony characteristics 样品编号 BPW TTB SC 沙门显色 BS 091 变黄变红品红色和蓝绿色菌落带金属光泽黑色菌落, 周围培养基变黑 123 略浊绿色变红白色和蓝绿色菌落黑色菌落阳性菌株变黄变红品红色菌落带金属光泽黑色菌落, 周围培养基变黑样品前增菌液接种至 TTB 和 SC 中均变混浊, 虽程度不同但也说明样品中均含有能在该培养基生长的微生物划线接种沙门氏菌显色培养基和 BS 平板, 从沙门氏菌显色培养基平板上发现, 91 号样品出现品红色菌落, 与显色培养基说明书可疑沙门氏菌菌落特征一致 ; 123 号呈白色和蓝绿色菌落, 与说明书可疑菌落特征不一致, 为非可疑沙门氏菌两样品在 BS 平板上均呈现黑色菌落, 但 123 号无金属光泽, 周围培养基也未变黑需进一步进行生化鉴定 3.2 PCR 结果由图 1 PCR 结果来看, 所有样品在目的条带处都有条带, 并不能对 91 号和 123 号样品加以区分, 对于出现的可疑阳性结果, 应进一步的生化鉴定予以明确 3.3 生化实验由表 2 可以看出, 091 和 123 号样品三糖铁琼脂内斜面不产酸, 产硫化氢变黑色, 产气, 赖氨酸脱羧酶实验阳性, 有沙门氏菌可能由表 3 可以看出, 091 号样品靛基质尿素氰化钾 3 项皆阴性, 结合硫化氢和赖氨酸脱羧酶实注 : M(marker): DL 2000, 最小片段 200 bp; 目的片段大小 : 180 bp; 1: 阴性水 ; 2: 阴性 DNA; 3: 阳性 DNA; 4: 091; 5: 123 图 1 两份样品的 PCR 电泳图 Fig. 1 PCR electrophoresis of two samples 验阳性, 可判定为沙门氏菌 123 号样品有 2 项异常, 可判定为非沙门氏菌 3.4 血清学鉴定由表 4 可以看出, 3 个样品都未发生自凝集反应, 但 091 号和阳性对照与 A-F 多价 O 血清发生凝集反应, 而生理盐水对照不发生凝集反应表 2 生化反应初步结果 Table 2 Preliminary results of biochemical reactions 样品三糖铁斜面底层产气硫化氢赖氨酸脱羧酶实验培养基初步判断 091 产碱可疑沙门氏菌 123 产碱可疑沙门氏菌 CICC 产碱可疑沙门氏菌注 : +: 阳性, : 阴性表 3 生化反应初步鉴别 Table 3 Preliminary biochemical identification 样品硫化氢靛基质尿素氰化钾赖氨酸脱羧酶判断沙门氏菌非沙门氏菌 CICC 沙门氏菌注 : +: 阳性, : 阴性

4 5072 食品安全质量检测学报第 9 卷表 4 血清学鉴定结果 Table 4 Serological identification results 样品自凝集反应 A-F 多价生理盐水 CICC 注 : +: 阳性, -: 阴性 4 结论与讨论沙门氏菌的检验主要依据传统的增菌及生化鉴定, 优点是准确度高 [7] 成本低; 缺点是耗时, 需 4~7 d, 且操作繁杂作为快检的 PCR 法特异性强灵敏度高简便高效快捷 ( 可以缩时到 20 h), 非常适合于样本的初筛或快速检测 ; 缺点是容易出现假阳性 [11], 误差仍然存在, 与其他方法的联合使用将是未来发展的方向 [12] 所以, 在标准 SN/T [8] 的结果判定里特别说明如待测样品出现相应大小扩增条带则可判定该样品结果为假定阳性, 则回到传统的检测步骤在选择性平板中, 沙门氏菌显色培养基的特异性和灵敏度都较高, 快捷直观, 提高了检测效率但显色培养基是根据微生物复杂多样的胞内酶的特征设计的, 在特异性酶作用下游离出发色基团并显示一定颜色, 直接观察菌落颜色对菌种做出鉴定 [13] 但是, 由于混合微生物感染时会出现一定比例的假阳性或假阴性不同菌种呈现相似的颜色或者同一种微生物呈现不同的颜色显色培养基中高浓度的抑制杂菌物质抑制目标菌的生长菌落在不同的孵育时间里呈现不同的颜色显色培养基可能不能覆盖目标菌的所有种等原因 [14], 所以也存在误判情况沙门菌属和枸橼酸杆菌属不仅在血清学上密切相关, 而且生化反应也非常相似 [15] 因此, 鉴定时需要特别注意赖氨酸脱羧酶实验, 沙门菌为阳性, 枸橼酸杆菌为阴性此外, 尿素酶实验 ONPG 实验氰化钾生长实验等, 沙门氏菌亚种和枸橼酸杆菌都有一致的可能参加能力验证 ( 测量审核 ) 计划是实验室检测结果质量保证的重要手段 [16,17], 有助于实验室评价和证明其检测数据可靠性, 发现和纠正自身存在的问题, 改进实验室的检测工作 [18] 在实验全过程中, 应秉承绿色理念 [19,20], 既要注意生物安全, 防止操作人员被感染, 又要对培养物进行无害化处理, 避免污染环境参考文献 [1] 刘颖, 薛靓. 测量审核的实施方法及满意度评定 [J]. 中国测试, 2012, 38(S1): Liu Y, Xue L. Implementation of measurement audit and satisfaction evaluation [J]. Chin Measur Test Technol, 2012, 38(S1): [2] 贾东, 李宏, 王金玲, 等. 食品微生物学能力验证过程质量控制的研究 [J]. 现代测量与实验室管理, 2012, 6: Jia D, Li H, Wang JL, et al. The research of quality control during proficiency testing of food microbiology [J]. Adv Measur Lab Manag, 2012, 6: [3] 王学硕, 崔生辉, 邢书霞, 等. 餐饮食品中沙门氏菌的危害分析污染调查与防控 [J]. 中国药事, 2013, 27(9): Wang XS, Cui SH, Xing SX, et al. The contamination status, hazard analysis and Salmonella control in restaurant food [J]. Chin Pharm Affa, 2013, 27(9): [4] Wang W, Liu F, Baloch Z, et al. Genotypic characterization of methicillinresistant Staphylococcus aureus isolated from pigs and retail foods in China [J]. Biome Environ Sci, 2017, 30(8): [5] Mcsorley SJ. Immunity to intestinal pathogens: Lessons learned from Salmonella [J]. Immunol Rev, 2015, 260(1): [6] Ramírez-Castillo FY, Loera-Muro A, Jacques M, et al. Waterborne pathogens: Detection methods and challenges [J]. Pathogens, 2015, 4(2): [7] 刘喆, 张书萧, 王少辉, 等. 沙门氏菌的检测技术进展 [J]. 中国动物传染病学报, 2012, 20(2): Liu Z, Zhang SX, Wang SH, et al. Advances in detection techniques for Salmonella [J]. Chin J AnimInfect Dis, 2012, 20(2): [8] SN/T 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR 法 [S]. SN/T Rapid detection methods for pathogens in foods-pcr method [S]. [9] GB 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 [S]. GB National food safety standard-food microbiological examination-salmonella [S]. [10] 大连中食国实检测技术有限公司, 乳粉中沙门氏菌 ( 定性测试 ) 测量审核样品测试指导书 [Z] China CFAPA Testing Technology Company Limited of Dalian. Test guide for measurement of Salmonella (qualitative test) in milk powder [Z] [11] 王玉健, 朱巍, 杨智, 等. 移液器使用不当导致 DNA 分型 Ladder 污染原因初探 [J]. 中国法医学杂志, 2014, 6: Wang YJ, Zhu W, Yang Z, et al. The preliminary study of Ladder pollution reason about DNA typing because of improper use of pipettors [J]. Chin J Forensic Med, 2014, 6: [12] 沈兰, 王锐萍, 史海涛, 等. PCR 技术在快速检测沙门氏菌中的应用 [J]. 基因组学与应用生物学, 2012, 31(1): Shen L, Wang RP, Shi HT, et al. Applications of PCR Technologies on rapid detection of Salmonella [J]. Genom Appl Biol, 2012, 31(1): [13] 吴清平, 周艳红, 蔡芷荷. 卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用 [J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15(1): Wu QP, Zhou YH, Cai ZH. Applicat ion and reserch of chromogenic culture media in detection and identification of sanitary microorganisms [J]. Chin J Health Lab Technol, 2005, 15(1): [14] 陈茂义, 胡婕, 刘建昭, 等. 科玛嘉显色培养基和 XLD SS HE 分离食品中沙门菌效果比较 [J]. 公共卫生与预防医学, 2008, 19(4): Chen MY, Hu J, Liu JZ, et al. Comparison of CHROM agar Salmonella medium and XLD, SS agars and HE media for isolation of Salmonella

第 19 期魏静元, 等 : 一例沙门氏菌测量审核的回顾与分析 5073 strains from food samples [J]. J Pub Health Prev Med, 2008, 19(4): 12 14. [15] 陈德云, 梁玉萍, 李笑琼. 六株与沙门菌属具有相同抗原的弗劳地枸橼酸杆菌的实验研究 [J]. 中国卫生检验杂志, 2010, 20(12): 3314 3315.

5 第 19 期魏静元, 等 : 一例沙门氏菌测量审核的回顾与分析 5073 strains from food samples [J]. J Pub Health Prev Med, 2008, 19(4): [15] 陈德云, 梁玉萍, 李笑琼. 六株与沙门菌属具有相同抗原的弗劳地枸橼酸杆菌的实验研究 [J]. 中国卫生检验杂志, 2010, 20(12): Chen DY, Liang YP, Li XQ. Study on C.freundii cplx with the same antigen of Salmonella [J]. Chin J Health Lab Technol, 2010, 20(12): [16] 颜瑛, 罗玉彬, 王文娟, 等. 能力验证试验中沙门氏菌的分离和鉴定 [J]. 食品安全质量检测学报, 2015, 6(9): Yan Y, Luo YB, Wang WJ, et al. Isolation and identification of Salmonella spp. in food during the proficiency testing [J]. J Food Saf Qual, 2015, 6(9): [17] Abdel MM, Planchon V, Polet M, et al. Analytical performances of food microbiology laboratories-critical analysis of 7 years of proficiency testing results [J]. J Appl Microbiol, 2016, 120(2): [18] 孙晶, 王歆睿, 魏静元, 等. 食品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌检出能力验证结果与分析 [J]. 食品安全质量检测学报, 2017, 8(9): Sun J, Wang XR, Wei JY, et al. Proficiency testing results and analysis of detection ability of Staphylococcus aureus and Salmonella in food [J]. J Food Saf Qual, 2017, 8(9): [19] 由继红. 创建绿色化生物实验室的探讨 [J]. 实验科学与技术, 2014, 12(2): You JH. Discussion on construction of greening biological laboratory [J]. Exp Sci Technol, 2014, 12(2): [20] 樊佳, 王茂林, 林宏辉. 绿色生物实验室建设的探索与实践 [J]. 实验科学与技术, 2016, 14(6): Fan J, Wang ML, Lin HH. Exploration and practice of construction of green biology laboratory [J]. Exp Sci Technol, 2016, 14(6): 作者简介 ( 责任编辑 : 韩晓红 ) 魏静元, 博士, 副研究员, 主要研究方向为食品质量与生物安全 @qq.com 食品生物技术专题征稿函食品生物技术是生物技术在食品原料生产加工和制造中的应用的一个学科它包括了食品发酵和酿造等最古老的生物技术加工过程, 也包括了应用现代生物技术来改良食品原料的加工品质的基因生产高质量的农产品制造食品添加剂植物和动物细胞的培养以及与食品加工和制造相关的其他生物技术, 如酶工程蛋白质工程和酶分子的进化工程等生物技术在食品领域中日益显示其巨大的作用与意义鉴于此, 本刊特别策划食品生物技术专题专题将围绕基因工程细胞工程酶工程分子生物学技术免疫学技术基因芯片和生物传感器等生物技术在食品加工生产与保藏保鲜及食品安全检测与控制的应用等方面展开, 基于技术原理技术特点优势与局限性影响因素工艺及设备应用实践等各个方面展开讨论, 同时该专题也关注转基因食品的安全性评价与管理本专题预计在 2018 年 12 月出版鉴于您在该领域的杰出成就, 本刊主编吴永宁研究员特邀请您撰稿, 综述研究论文研究简报等稿件形式均可, 以期为食品生物技术的推广应用科研开发提供理论和实践指导请您请在 2018 年 11 月 20 日前通过网站或投稿我们将快速处理并优先发表谢谢您的参与和支持! 投稿方式 ( 注明专题 ): 网站 : jfoodsq@126.com 食品安全质量检测学报编辑部

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Microsoft Word 李琼琼-二校 7 7 Vol. 7 No. 7 2016 7 Journal of Food Safety and Quality Jul., 2016 李琼琼, 杨 * 燕, 范一灵, 杨美成 (, 201203) 摘要 : 目的方法 (1~100 CFU/10 g) (0~10 6 CFU/10 g), GB4789.4-2010, (VIDAS30) (BAX Q7 System), 结果, VIDAS