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贝凌
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1 第 9 卷第 7 期食品安全质量检测学报 Vol. 9 No 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr., 年沙门氏菌能力验证的结果与分析王丽君, 韩爱芝, 杨 * 玲, 马国财 ( 塔里木大学分析测试中心, 阿拉尔 ) 摘要 : 目的验证塔里木大学分析测试中心对国家食品安全风险监项目中沙门氏菌检测的技术水平方法实验样品前处理方式按照考核方作业指导书要求进行处理, 沙门氏菌分离鉴定的能力验证工作按照 GB 食品安全国家标准食品微生物检验沙门氏菌检验并结合作业指导书进行操作将生化鉴定结果符合沙门氏菌阳性特征的样品进行血清学鉴定及分型结果 3 个样品中, 样品 1 检出斯坦利沙门氏菌, 样品 2 检出肯塔基沙门氏菌, 样品 3 未检出沙门氏菌, 3 个样品能力验证结果均与组织方一致结论通过此次能力验证, 本测试中心的微生物检验能力和沙门氏菌检测技术水平均得到了有效验证和提高, 提升了本实验室的检测能力和可信度关键词 : 沙门氏菌 ; 血清学分型 ; 能力验证 Results and analysis of Salmonella proficiency verification in 2017 WANG Li-Jun, HAN Ai-Zhi, YANG Ling, MA Guo-Cai * (Analysis and Test Center, Tarim University, Alar , China) ABSTRACT: Objective To verify the technical level of Salmonella detection of Tarim University in food safety risk monitoring project of China. Methods The experimental samples were processed in accordance with the requirements of operation instruction. The proficiency testing of isolation and identification of Salmonella were conducted according to the GB National food safety standard-food microbiological examination- Salmonella. Serological identification and serotyping of samples that accorded with Salmonella positive characteristics were performed. Results Sample 1 was detected Salmonella Stanley, sample 2 was detected Salmonella Kentucky, and sample 3 was not detected any Salmonella. The results of the three samples were satisfactory, which were consistent with the results of the organizers. Conclusion Through this proficiency verification, the microbiological examination ability and Salmonella detection technology level of the test center have been effectively verified and improved. It should improve the testing ability and reliability of our laboratory. KEY WORDS: Salmonella; serotyping; proficiency verification 1 引言沙门氏菌是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一 [1], 广泛存在于自然界据统计由沙门氏菌引起的食物中毒事件在世界各国的细菌性食物中毒种类中常列榜首 [2] [3] 能力验证是国际通行的评价检测机构技术能力的重要手段微生物检测能力验证是控制实验室微生物检测的关键环节 [4], 能否通过能力验证直接关系到检验报告的准确性和可靠性国家食品安全风险评估中心为提升国家食品安全风险监测微生物检验能力于 2017 年 11 月开展了 2017 * 通讯作者 : 马国财, 硕士, 高级实验师, 主要研究方向为天然产物活性成分及功能 ying0216mx@163.com *Corresponding author: MA Guo-Cai, Master, Senior Engineer, Analysis and Test Center, Tarim University, Alar , China. ying0216mx@163.com

2 1530 食品安全质量检测学报第 9 卷年国家食品污染和有害因素风险监测质量控制考核食源性沙门菌检验和血清分型项目本实验室参加此次能力验证活动, 现结合前期食源性沙门氏菌检测工作中的相关经验分析本次能力验证试验工作中出现的问题及解决方案, 以期为后续相关检验工作提供理论依据 2 材料与方法 2.1 样品来源考核样品 3 份, 每份考核样品包含 1 个西林瓶和 1 个基质样品袋每个西林瓶内装有 1 个冻干菌球, 样品编号分别为 2017S-32(4) S-32(4)-2 和 2017S-32(4)-3, 下文简称 1# 2# 和 3# 基质样品袋内装有专用样品基质(25 g/ 包 ), 样品编号同考核样品 2.2 材料及仪器缓冲蛋白胨水 (buffered peptone water, BPW) 四硫磺酸钠煌绿 (tatrathionate broth, TTB) 增菌液亚硒酸盐胱氨酸 (selenite cystine, SC) 增菌液亚硫酸铋 (bismuth sulfite, BS) 琼脂 HE 琼脂木糖赖氨酸脱氧胆盐 (xylose lysine desoxycholate, XLD) 琼脂沙门氏菌显色培养基三糖铁 (triple sugar iron, TSI) 琼脂沙门氏菌生化鉴定试剂盒营养琼脂 Swarm 琼脂沙门氏菌阳性菌株 (ATCC14028) 均购自北京陆桥技术有限责任公司 ; 沙门氏菌属诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司 BL3100 电子天平 ( 德国赛多利斯仪器有限公司 ); 101-3A 电热恒温鼓风干燥箱 ( 上海试验仪器厂 ); 1384 型生物安全柜 ( 美国赛默飞公司 ); HPX-9272MBE 数显电热培养箱 YXQ-LS-75G 高压灭菌锅 ( 上海博迅公司 ); JZ-II 均质器 ( 天津四方公司 ) 2.3 实验方法样品前处理按照组织方要求的作业指导书进行, 后续试验操作依据 GB 食品安全国家标准食品微生物检验沙门氏菌检验 [5] 进行样品处理与预增菌在生物安全柜中将装有冻干菌球的西林瓶打开, 加入 1 ml 无菌 BPW 进行复溶, 室温静置 3 min; 充分混匀西林瓶中的内容物, 静置 30 s 以消除产生的泡沫 ; 将上述溶液转移至含有 220 ml 无菌 BPW 的均质杯中, 再用无菌 BPW 充分洗涤西林瓶内壁 4 次, 每次 1 ml, 将洗液合并到均质杯中 ; 向均质杯中加入相应编号的样品基质, r/min, 均质 1.5 min, 将均质后的溶液倒入无菌三角瓶中, 36 培养 18 h 增菌与分离轻轻混匀样品培养物, 各移取 1 ml 转种于 10 ml TTB 和 10 ml SC 内, 分别于 42 (TTB) 和 36 (SC) 培养 24 h 用直径 3 mm 的接种环从上述 2 种增菌液中分别各取一环划线接种到 BS 琼脂平板 XLD 平板 HE 平板和沙门氏菌显色培养基平板中, 于 36 培养 24 h(xld 平板 HE 平板和沙门氏菌显色培养基平板 ) 和 48 h(bs 琼脂平板 ), 培养结束后观察平板上的菌落特征生化鉴定从选择性平板上分别挑取 2 个以上特征菌落, 划线接种到营养琼脂平板上, 挑取纯化后的菌落按照生化鉴定试剂盒使用说明书进行生化鉴定试验操作血清学鉴定及分型将生化鉴定结果符合沙门氏菌阳性特征的样品进行血清学鉴定及分型首先进行菌体多价 O 抗原鉴定, 在载玻片上划定 2 个大小相同的区域, 在一个区域中滴加 O 多价血清 1 滴, 另一区域滴加生理盐水 1 滴作为阴性对照, 然后分别放置 1 环待测菌用接种环将菌体研成乳状液, 将玻片轻轻摇动, 30 s 内对着黑暗的背景进行观察是否有凝集现象 O 多价凝集筛选后再用同样的方法对相应的因子进行 O 血清的分型, 直至最后得出阳性菌株对应的 O 抗原查阅常见沙门氏菌抗原表, 针对上述 O 抗原结果, 有目标性的进行 H 抗原检测具体方法是 : 在无菌平板中倒入 Swarm 琼脂, 待凝固后将菌株点种在平板的中央, 于 37 培养 24 h, 取扩散生长后的菌落边缘部位用 O 抗原检测的方法进行 H 抗原的凝集试验 3 结果与分析 3.1 增菌培养加入对应编号样品基质的试验样品经 BPW 溶液增菌后 1# 和 2# 呈乳白色的均匀混浊液 ; 3# 样品出现凝块, 经常温放置数小时后出现胨化现象 ; 阳性对照呈均匀混浊的黄色溶液 2 次增菌培养后阳性对照 1# 和 2# 样品在 TTB 液体中呈均匀的绿色混浊液, 在 SC 中呈现均匀的粉红色混浊液 ; 3# 样品在 TTB 和 SC 中均呈现上层清澈下层沉淀的明显分层现象 3.2 平板分离试验样品经 2 次增菌后划线到 4 种选择性平板上进行分离培养, 结果阳性对照 1# 和 2# 均出现特征菌落, 3# 样品在 4 种培养平板上均呈现非可疑或典型菌落, 菌落特征描述见表 1 和图生化鉴定针对上述选择性平板上出现可疑或典型菌落的样品进行生化鉴定试验, 挑取营养琼脂平板上纯化后的菌落进行生化鉴定, 操作方法按照生化鉴定说明书进行试验结果表明 1# 和 2# 样品生化鉴定结果与阳性对照结果一致, 均符合沙门氏菌反应特征描述, 具体见表 2

第 7 期王丽君, 等 : 2017 年沙门氏菌能力验证的结果与分析 1531 Table 1 表 1 沙门氏菌在不同培养基上的菌落特征 Colony characteristics of Salmonella samples in different culture

1 图 1 沙门氏菌在选择性平板上的菌落特征 Colony morphology of Salmonella in selective medium Table 2 表 2 沙门氏菌生化鉴定特征 The characteristics of biochemical

靛基质 - - - 尿素 - - - 甘露醇 + + + 山梨醇 + + + ONPG - - - 注 : + 表示 : 阳性, - 表示 : 阴性 3.4 血清学分型参照 GB4789.

初步判定为 B 群, 2# 与 O 8 发生凝集, 属于 C 3 群 ; 然后对照抗原表中对 H 抗原进行凝集试验, 结果表明, 1# 与 H 抗原第 1 相中的 H d 发生凝集, 初步判定为斯坦利沙门菌, 然后用第 2 相 H 1,2 验证,

3 第 7 期王丽君, 等 : 2017 年沙门氏菌能力验证的结果与分析 1531 Table 1 表 1 沙门氏菌在不同培养基上的菌落特征 Colony characteristics of Salmonella samples in different culture mediums 样品编号 BS XLD 沙门氏菌显色培养基 HE 1# 2# 3# 无菌落生长无菌落生长无菌落生长无菌落生长阳性对照注 : 左上为沙门氏菌显色培养基 ; 右上为 XLD 琼脂 ; 左下为 HE 琼脂 ; 右下为 HE 琼脂 Fig. 1 图 1 沙门氏菌在选择性平板上的菌落特征 Colony morphology of Salmonella in selective medium Table 2 表 2 沙门氏菌生化鉴定特征 The characteristics of biochemical identification of Salmonella samples 试验项目 1# 2# 阳性对照三糖铁斜面 K 底层 A 产硫化氢产气斜面 K 底层 A 产硫化氢产气斜面 K 底层 A 产硫化氢产气赖氨酸脱羧酶氰化钾靛基质尿素甘露醇山梨醇 ONPG 注 : + 表示 : 阳性, - 表示 : 阴性 3.4 血清学分型参照 GB 的附录 B 中的常见沙门氏菌抗原表对 1# 2# 和阳性对照菌株进行血清学分型结果表明 3 个菌株均与 O 多价血清凝集, 生理盐水对照未发生凝集反应 ; 用 O 血清单因子逐一进行凝集反应试验, 阳性对照和 1# 均与 O 4 和 O 12 发生凝集, 初步判定为 B 群, 2# 与 O 8 发生凝集, 属于 C 3 群 ; 然后对照抗原表中对 H 抗原进行凝集试验, 结果表明, 1# 与 H 抗原第 1 相中的 H d 发生凝集, 初步判定为斯坦利沙门菌, 然后用第 2 相 H 1,2 验证, 结果菌株与该因子也发生凝集, 最终判定为 B 群斯坦利沙门菌 ; 2# 和阳性菌株均与 H 抗原第 1 相中的 H i 发生凝集, 初步判定 2# 为肯塔基沙门菌, 阳性菌株为鼠伤寒或拉古什沙门菌, 然后分别用第 2 相进行验证, 结果 2# 菌株与 H Z6 发生凝集, 阳性菌株与 H 1,2 发生凝集, 最终判定 2# 为 C 3 群肯塔基沙门菌, 阳性菌株为 B 群鼠伤寒沙门菌具体见表 3

4 1532 食品安全质量检测学报第 9 卷 Table 3 表 3 沙门氏菌血清分型结果 Serotype results of Salmonella isolated from the samples 样品编号 O 抗原 H 抗原第 1 相 H 抗原第 2 相菌名拉丁菌名 1# 4,12 d 1,2 斯坦利沙门菌 S. stanley 2# 8 i Z 6 肯塔基沙门菌 S. kentucky 阳性对照 4,12 i 1,2 鼠伤寒沙门菌 S. typhimurium 4 结论与讨论参加能力验证项目, 能够提高实验室的检测能力和技术水平 [6-8], 可以通过对试验过程中出现的一些问题进行认真思考, 吸取失败的教训, 总结成功的经验, 确保实验结果的准确性和可靠性从质控考核证书分析的数据来看, 本中心是全国 431 个实验室中唯一一个高校分析测试中心, 从参加本次能力验证的结果中得出 431 个实验室均参加了食源性沙门菌属检验和血清分型 2 个项目其中沙门菌检验项目有 398 个实验室初测结果满意, 通过率为 92.3%, 对不满意单位进行复测安排后通过率为 100%; 血清分型项目有 357 个实验室初测结果满意, 通过率为 82.8% 从上述数据中可以看出, 食源性沙门菌对食品安全造成的危害已经引起相关部门的足够重视, 且本次能力验证通过后对后期食品中沙门氏菌的检验工作增加了自信, 对后期检验报告的准确性有了极大的信心能力样品的制备应充分考虑均匀性和抽样的稳定性及在传运中可能的损坏等周围环境条件的影响, 力保在抽样运送和处置检测样品时样品的均匀性和稳定性 [9,10] 本次能力验证样品中的样品基质在样品处理时出现不一样的状态, 其中 1# 和 3# 的基质为松软的粉状物质比较容易溶解, 疑似速溶奶粉, 均质不需要太长时间 ; 2# 样品基质为硬块状疑似奶酪的物质, 溶解较难, 均质所用时间也较长但是从预增菌的结果观察来看, 1# 和 2# 样品的增菌液呈均匀混浊, 而 3# 样品的增菌液则呈块状凝集, 室温放置后出现胨化现象上述结果表明试验中的某种现象不能作为判定试验结果的依据, 要按照试验步骤按部就班的操作才能得出最终的正确结论由于沙门氏菌种类繁多, 复杂多样 [11,12], 培养基的选择要兼顾多方面的因素, 避免因培养基选择不全面造成样品中的菌种出现漏检或杂菌污染等现象所以在选择性培养基的选择方面建议用几种培养基同时筛选, 避免漏检或错检, 本试验中使用 BS HE XLD 和沙门氏菌显色培养基 4 种培养基进行菌落筛选, 结果 1# 2# 和阳性对照均出现同样的菌落特征, 这对阳性样品的筛选提供较大的参考价值比较这四种培养基发现效果最佳的为显色培养基, 较易得到单菌落, 且种类单一, 选择性很强, 易于为下一步的试验提供纯菌落 ; HE 和 XLD 培养基中菌落较大, 接种时不宜挑太多菌液, 仅用接种环沾取少许即可, 菌液量太大容易使平板上菌苔成片, 影响单菌落的筛选 ; BS 培养基上的菌落生长慢, 需要 48 h 培养, 且菌落也较少, 接种量不好控制, 建议如果上述 3 种培养基可以确定样品为阳性或阴性时, 尽量不要使用此培养基沙门氏菌具有复杂的抗原结构, 包括 O 抗原和 H 抗原, 少数菌株含有 Vi 抗原 [13] 其中 O 抗原也称菌体抗原 [14], 是细胞壁的组成成分, 能够与抗血清发生颗粒状凝集 ; H 抗原属于鞭毛抗原, 其主要成分是蛋白质, 与抗血清反应呈絮状或绒状凝集 [15,16] 沙门氏菌的血清学分型试验对菌株的新鲜度要求较高, 此外 O 抗原试验要求培养基平板上的菌落干燥, 因为干燥的培养物发育较好, 成功率较高 ; H 抗原要求菌落必须是新鲜培养的, 所以一定要选取菌落边缘呈雾状生长的部分, 挑取中心部位容易造成血清不凝集, 会直接影响实验结果总之, 血清学分型试验繁琐且工作量大, 需要一定的耐心和经验进行判断参考文献 [1] 孙晶, 王歆睿, 魏静元, 等. 食品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌检出能力验证结果与分析 [J]. 食品安全质量检测学报, 2017, 8(9): Sun J, Wang QR, Wei JY, et al. Proficiency testing results and analysis of detection ability of Staphylococcus aureus and Salmonella in food [J]. J Food Saf Qual, 2017, 8(9): [2] 高晗, 何娟, 严礼. 3 种沙门氏菌检测方法能力验证 [J]. 食品安全质量检测学报, 2017, 8(2): Gao H, He J, Yan L. Capability verification of three detection methods of Salmonella [J]. J Food Saf Qual, 2017, 8(2): [3] 陈雨欣, 苏粉良, 鞠慧萍, 等. 食品能力验证中沙门氏菌的分离鉴定与血清分型 [J]. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(7): Chen YX, Su FL, Jv HP, et al. Isolation and identification of Salmonella and serotype in food ability verification [J]. J Food Saf Qual, 2016, 7(7): [4] 王志伟, 徐琼, 陈欣钦, 等. 能力验证样品中沙门氏菌的分离与鉴定 [J]. 食品研究与开发, 2016, 37(7): Wang ZW, Xu Q, Chen XQ, et al. Isolation and identification of Salmonella in the proficiency testing sample [J]. Food Res Dev, 2016, 37(7): [5] GB 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 [S]. GB National food safety standard-food microbiological examination-salmonella [S].

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Microsoft Word 李琼琼-二校 7 7 Vol. 7 No. 7 2016 7 Journal of Food Safety and Quality Jul., 2016 李琼琼, 杨 * 燕, 范一灵, 杨美成 (, 201203) 摘要 : 目的方法 (1~100 CFU/10 g) (0~10 6 CFU/10 g), GB4789.4-2010, (VIDAS30) (BAX Q7 System), 结果, VIDAS