硫胺 (V B ) 核黄素 (V B ) 烟酰胺 (V B ) 泛酸 (V B ) 吡哆醇 (V B ) 生物素 (V B7 ) 氰钴胺 (V B ) 抗坏血酸 (V C ), 中国国家药品生物制品检定所 ( 简称 NICPBP) 标准溶液的配制标准水溶性维生素溶液的制备方式是, 分别称取 mg 的
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- 米 莫
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1 二维高效液相色谱法测定营养饮料中的水溶性维生素 Application Note 9 戴振宇 陈静 许群 梁立娜 Jeffrey Rohrer 中华人民共和国上海 ; 美国加利福尼亚州森尼韦尔市赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 关键词食品分析, 食品质量, Acclaim PolarAdvantage 色谱柱, Acclaim LC C8 色谱柱,Hypersil Gold Phenyl 色谱柱 目标建立更简便 灵敏 有效的测定多种维生素矿物质复合饮料中的水溶性维生素的高效液相色谱法 (HPLC) 目标分析物是 B 族维生素包括硫胺素 (V B ) 核黄素 (V B) 烟酰胺 (V B ) 泛酸 (V B ) 吡哆醇 (V B ) 生物素 (V B7 ) 氰钴胺素 (V B ) 抗坏血酸 (V C ) 引言仪器众所周知, 维生素是一组化合物, 对人体健康非常重要 Thermo Scientific TM Dionex TM UltiMate TM 双高效液相维生素可分为两大类, 水溶性和脂溶性维生素 除吡哆色谱系统, 包括 : 醇 (V B ) 和氰钴胺素 (V B ) 以外, 人体无法储存水溶性配置 SRD- 集成溶剂和脱气机机架的 DGP RS 双三维生素 因此如果膳食维生素摄入量不足, 应在饮食中元快速分离泵系统添加维生素补充剂 配置 μl 样品环和 μl 注射器的 WPS TRS 自动维生素补充剂可制成片剂 单种维生素强化功能饮料 进样器维生素强化牛奶, 或通过添加其他成分 ( 如水果提取物 ) 带 个 位 - 孔切换阀的 TCC RS 柱温箱制成不透明的多种维生素矿物质营养饮料, 使其具有更配置 µl 流动池的 DAD-RS 二极管阵列检测器多的复合功能 为了确保这些产品中含有所标示量的维 7 μl 静态混合器生素, 许多公开的论文已经介绍了可靠的质量控制方法 - Thermo Scientific TM Dionex TM Chromeleon TM 色谱数据系统 (CDS) 对于某种维生素片剂或功能确切的饮料, 分析相对简单, 软件 7. 版 常规的 HPLC 方法即能达到定量分析维生素的要求 有些 Thermo Scientific Orion -Star 台式 ph 计样品如维生素强化牛奶和不透明多种维生素矿物质营养饮料, 除维生素外, 还含有氨基酸 矿物质 辅酶 Q-, 试剂和标准品葡萄提取物等 这些添加的化合物会干扰维生素的测定 去离子水 (DI), 电阻率为 8.MΩ-cm 因此, 我们开发出简便 灵敏的二维高效液相色谱法 (-D 乙腈 (CH CN), 高效液相色谱级,Fisher Scientific HPLC), 以实现此类样品中维生素的简便 灵敏 有效的 磷酸二氢钾 (KH PO ) (C/N P8-),Fisher Chemical 公司测定 磷酸,8% (H PO ), (C/N A-),Fisher Chemical 公司
2 硫胺 (V B ) 核黄素 (V B ) 烟酰胺 (V B ) 泛酸 (V B ) 吡哆醇 (V B ) 生物素 (V B7 ) 氰钴胺 (V B ) 抗坏血酸 (V C ), 中国国家药品生物制品检定所 ( 简称 NICPBP) 标准溶液的配制标准水溶性维生素溶液的制备方式是, 分别称取 mg 的 V B V B V B V B V B7 V B 和 V C 维生素粉, 置于容量瓶, 用去离子水定容至 ml, 配制成每种维生素浓度均为. mg/ml 的储备溶液 由于 V C 不稳定, 应即用即配制 此外, 由于 V B 在水中不够稳定,V B 储备溶液的浓度应降低到. mg/ml 向 毫升的样品瓶中加入 μl V B 储备溶液 V B 和 V B7 储备溶液各 μl 以及 V B V B V B V B 和 V C 储备溶液各 μl 加入 μl 的去离子水最后定容至 ml 在此混合标准储备液中,V B 的浓度为 μg/ml,,v B 和 V B7 的浓度均为 μg/ml, 而其他维生素的浓度为 μg/ml 为了制备用于校准的混合标准工作溶液, 向 ml 的玻璃小瓶中加入适量的混合标准储备溶液, 并用去离子水定容至 ml 有关详细信息, 请参阅表 表. 水溶性维生素的混合标准工作液的制备 混合标准工作液 用于制备 ml 的混合标准储备溶液体积 (ml)..... V B..... 每种维生素的浓度 (mg/l) V B, V B7... V B, V B, V B, V B, V C.... 样品的制备由客户提供添加 V B V B V B V B V B V B7 V B 和 V C 的多种维生素矿物质营养饮料 该饮料还含有一些脂溶性 维生素 矿物质 氨基酸复合物 葡萄籽提取物 辅酶 Q-, 并添加了其他成分, 以满足日常营养需要 表 列出了样品组分 表. 多种维生素营养饮料的标识值 成分 每份分量 * 成分 每份分量 总碳水化合物 9 g 锌 ( 葡萄糖酸锌 ) mg 维生素 A IU 硒 (L- 硒蛋氨酸 ) mcg 维生素 C mg 铜 ( 葡萄糖酸铜 ) mg 维生素 D IU 锰 ( 葡萄糖酸锰 ) mg 维生素 E IU 铬 ( 氨基酸螯合物 ) mcg 维生素 K mcg 钾 ( 柠檬酸 ) mg 维生素 B mg 胆碱 ( 酒石酸 ) mg 维生素 B mg 肌醇 mg 维生素 B mg 硼 ( 氨基酸螯合物 ) mg 维生素 B mg 氨基酸复合物 ( 专有配方 ) mg 维生素 B mg 葡萄籽提取物 mg 维生素 B7 mcg 辅酶 Q- mg 维生素 B mcg 二甲基甘氨酸 mg 叶酸 mcg 帕巴 mg 钙 mg 柑橘生物类黄酮 mg 磷 8 mg GDL mg 铁 ( 葡萄糖酸铁 ) mg 植物中提取的矿物质 mg 镁 ( 柠檬酸镁 葡萄糖酸镁 ) mg
3 必要时, 用去离子水稀释饮料, 并用. µm 滤膜过滤 将标识值与本应用说明中的校准范围比较, 判断是否需要稀释样品 样品在分析之前保存在 条件下的棕色瓶中 色谱条件一维色谱柱 : 除 V B 之外的水溶性维生素,Thermo Scientific Acclaim PolarAdvantage (PA), μm, Ǻ,. mm 对于 V B,Thermo Scientific Hypersil Gold Phenyl, μm,. mm 柱温 : 流动相 :A: mm 磷酸盐缓冲液 ( 取约. g KH PO 溶解于 L 水中, 并用 H PO 调节 PH 值至.) B:CH CN 梯度洗脱 ( 见表 ) 流速 :.8 ml/ 进样量 : μl 紫外检测 : 在 nm 和 nm 处的吸光度 表. 梯度程序和阀切换 一维 ( 右泵 ) 阀切换二维 ( 左泵 ) 时间 () 流速 (ml/ ) %A ( mm 磷酸盐缓冲液, ph.) %B (CH CN) 时间 () 右阀位左阀位时间 () 流速 (ml/ ) % A ( mm 酸盐缓冲液, ph.) %B (CH CN) * 食用份量 : fl. Oz. 二维色谱柱 :Acclaim C8, μm, Ǻ,. mm 柱温 : 流动相 : 与第一维中使用的相同流速 :.8 ml/ 紫外检测 : 在 nm nm 8nm 和 9 nm 处的吸光度结果与讨论测定维生素的传统高效液相色谱法目前, 美国药典 中尚没有关于八种水溶性维生素混合物的分离方法 美国药典 中对个别维生素的测定 方法较为复杂 ( 例如, 测定生物素需要用到高氯酸钠 磷酸 二甲亚砜 乙腈和水 ), 并要利用离子对试剂, 以保留亲水性维生素 由于离子对试剂对色谱柱性能会产生不可逆转的影响, 故研究人员作了大量研究, 旨在找到不使用离子对试剂而采用更为简单流动相的方法 最近, 据报导有研究者采用酸性或中性磷酸盐缓冲液 / 有机溶剂流动相, 分离多种维生素片提取物和维生素强化功能性饮料中的维生素, 但前述两种产品没有本文研究的饮料复杂 对于某些多种维生素营养饮料等复杂的样品, 其中添加物会干扰维生素的分离并最终干扰到紫外光谱对维生素的测定 图 中的色谱图显示多种维生素营养饮料采用常规 HPLC 测定, 由于出现大量紫外吸收干
4 扰峰, 因此很难甚至不可能对水溶性维生素峰进行量化 分析 显然, 色谱峰 - 不能量化分析 真实的样品中可 检测到光谱峰 -8, 但由于出现了多个干扰峰, 无法进行 精确定量 b 7 a 图. 采用传统的高效液相色谱法 (HPLC), 标准混合物与多维营养饮料样品的色谱图 -D-HPLC 的说明 -D-HPLC 法已被用于实现复杂样品的高效分离 采用不同的双色谱柱不但能提供更强大的分离能力, 而且采用在线 -D-HPLC 中的 Heart-Cut 能够简化第二维的分离 图 显示了用于本应用说明中二维高效液相色谱仪的配置 经过简单的样品制备 ( 必要时, 过滤样品后, 用去离子水稀释 ), 进样后在第一维使用 Acclaim PA 色谱柱进行部分分离 紫外检测器可在线监测目标物在何处洗脱 通 过进样混合标准工作溶液, 测定每种维生素出峰开始和结束时间 根据这些值切换阀 右边阀切换到 - 位时, 可将维生素色谱峰单独输送到第二维流路 对于早期洗脱维生素峰, 左边的阀切换到 - 位, 使这些维生素组分直接转移到第二个色谱柱 对于后期洗脱维生素光谱峰, 左阀切换到 - 位, 使 7 μl 混合器在线 在此配置中, 第二维中的水流动相可稀释第一维流动相中的乙腈, 以此确保维生素在第一维色谱柱得到保留 双梯度泵 第 个柱 自动进样器 混合器 第 个检测器 废物 废物 第 个检测器 第 个柱 图. 二维高效液相色谱系统的配置 * 注意当右阀切换到 - 位时, 紫外检测器 将把两个色谱柱连接起来 第二维色谱柱的背压会超过紫外检测器 流动池的压力极限 因此, 选择适当的颗粒大小和第二色谱 柱长度, 以确保背压低于流动池的压力极限 也可以在 仪器方法中设置压力极限指令, 以便当背压过高时可随 时停止流动
5 -D-HPLC 法的优化 阀切换 为了实现 -D-HPLC 法应用中的最佳分辨率和峰形, 方法的 关键是将在第一维上得到初步分离的色谱峰完整地转送到第二维上 实际上, 第一维和第二维上使用的两个流动相通常是有差异的, 有时会导致 峰丢失 如图 A 所示, 当峰 7 和 8 直接转移到第二维时会消失, 这是由于第一维流动相梯度后期含有高浓度乙腈, 使它们在第二维上难以保留 解决这个问题的常用方法是被测物到达第二维中的色谱柱之前, 使用第三个泵注入水以稀释流动相中高比例的乙腈 在赛默飞世尔科技公司最近的应用说明 (AN) 中, 采用了另外一种方式解决这一问题 7 将一个 7 μl 混合器切入第二维流路, 在第二维分离之前, 使第一维后期含有高比例乙腈的流动相与第二维初始含有高比例水的流动相充分混合 最初, 我们把这个想法应用到所有的被测物上 发现在第二维上, 后期洗脱峰峰形良好, 但早期洗脱峰峰形加宽 ( 图 B) 经过多次实验, 修改了设置, 当后期洗脱色谱峰转移到 7 μl 混合器但未到达第二维色谱柱时, 将早期洗脱色谱峰直接转移到第二维色谱柱上 图 C 显示此设置使所有 8 种水溶性维生素的峰形良好 色谱柱的选择及对分离的影响测试了几种色谱柱的组合 先前的研究结果表明, 大多数水溶性维生素采用 Acclaim PA 和 C8 色谱柱分别作为第一维柱和第二维柱达到良好的分离度 ; 但在饮料样品中, V B 与杂质共同洗脱, 因而无法对 V B 进行定量分析 8 当 图. 具有不同配置的标准混合物的二维色谱图 7 8 A B 使用 Hypersil Gold Phenyl 色谱柱作为第一维柱时, 可满足这 一需求 如图 所示, 采用 PA 色谱柱作为第一维时, 在 色谱图上的 nm 处无法检测到 V B 当采用 Hypersil Gold Phenyl 色谱柱作为第一维时, 可检测到 V B ( 图 ) C 8 第分 流 8 梯 柱流进第分 流 梯 柱 流检 b 阀 色 - 峰 - a 图. 在第一维度使用 Acclaim PA 分析柱条件下, 标准混合物与多维营养饮料样品的色谱图
6 b -. a 图. 在第一维度使用 Hypersil Gold Phenyl 分析柱,V B 标准品和 b) 多维营养饮料样品的色谱图 方法的重现性 线性关系和检测限连续 8 次进样水溶性维生素, 估算保留时间和峰面积的相对标准偏差 (RSD), 结果见表 示 图 则显示了 8 次进样的叠加色谱图 通过三次连续进样不同浓度的混合标准溶液, 采用外标法得到线性工作校准曲线, 用于定量样品中的水溶性维生素, 结果见表 采用置信度为 99% 时的 single-sided Student s test 方法, 估算方法检测限 (MDL), 结果见表 h g f e d - c - b a 图. 连续八次注射标准水溶性维生素混合物色谱图的叠加 表. 水溶性维生素的保留时间和峰面积的重现性 水溶性维生素 保留时间相对标准偏差 峰面积相对标准偏差 V B..8 V B.. V B.. V B.. V B.. V B7..87 V B..8 V C..
7 7 表. 校准数据和水溶性维生素的方法检出限 (MDL) 水溶性维生素 检测波长 (nm) 范围 (µg/ml) 回归方程 r 相对标准偏差 方法检测限 (µg/ml) V B.- A=.7c V B 8.- A=.8c V B 9.- A=.98c V B.- A=.c V B.- A=.c V B 8.- A=.98c V B7 - A=.c V C / / / / / 样品分析可能由于在样品中的浓度较低, 在多种维生素的营养饮料中未检测到 V B7 和 V B,V B 亦未检出 当按标识值 V B 到样品中时, 其回收率达到 9% 因此, 本方法能够测定 V B 检测到其它水溶性维生素接近其标识值 虽然 V C 在标准工作溶液中不稳定, 但在多种维生素营养饮料中相对稳定 正如图 7 中所示,V C 是样品色谱图中的主要峰 样品测定结果见表 第分 8 流 梯 柱流进第分 流梯 8 柱流检阀色 峰 图 7. 多维营养饮料样品 ( 稀释 倍 ) 的第二维色谱图 表. 多种维生素营养饮料样品中水溶性维生素的分析结果 被分析物 标示 mg/ml* 检定 µg/ml 加入 µg/ml 发现 µg/ml 回收率 % V B V B 不适用.9 9 V B.. V B.. 7 V B. 不适用.8 8 V B... V B7. 不适用. V C 检测到 / / / * 在分析前取样品稀释 倍 ; 从而 mg/ml 应被检测为 µg/ml
8 结论本研究描述了一种能够简化复杂样品如多种维生素营养饮料中维生素含量测定的二维高效液相色谱法 方法由变色龙软件控制的 UltiMate HPLC 双泵系统进行测定, 简单, 快速和有效 参考文献. Dionex (now part of Thermo Fisher Scientific) Application Note : Deteration of Water- and Fat-Soluble Vitas in Nutritional Supplements by HPLC with UV Detection, Sunnyvale, CA,. [Online] webdocs/878-an-hplc-vita-supplements-june- LPN.pdf (accessed June 7, ). Moreno, P.; Salvado, V. Deteration of Eight Water- and Fat- Soluble Vitas in Multivita Pharmaceutical Formulations by High-Performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr., A,, 87, 7.. Perveen, S.; Yas, A; Khan, K.M. Quantitative Simultaneous Estimation of Water Soluble Vitas, Riboflavin, Pyridoxine, Cyanocobala and Folic Acid in Nutraceutical Products by HPLC. The Open Analytical Chemistry Journal, 9,, -.. Dionex (now part of Thermo Fisher Scientific) Application Note. Deteration of Water- and Fat-Soluble Vitas in Functional Waters by HPLC with UV-PDA Detection, Sunnyvale, CA, 9. [Online] HPLC-Vitas-FunctionalWaters-April9-LPN.pdf (accessed June, ). U.S. Pharmacopeia National Formulary, USP, NF, May, 8 7. Dionex (now part of Thermo Fisher Scientific) Application Note 87: Two-Dimensional HPLC Combined with On-Line SPE for Deteration of Sudan Dyes I IV in Chili Oil, Sunnyvale, CA,. [Online] AN87-HPLC-Sudan-Dyes-Chili-Oil-Sept-LPN99.pdf (accessed June 7, ) 8. Thermo Scientific Application Note : Deteration of Sudan Dyes I IV in Curry Paste, Sunnyvale, CA,. [Online] Dyes-Curry-Paste-AN7_E.pdf (accessed June 7, ) 9. Dionex (now part of Thermo Fisher Scientific) Technique Note 89: Deteration of Water- and Fat-Soluble Vitas by HPLC, Sunnyvale, CA,. [Online] WaterFatSolubleVitas-7Oct-LPN98.pdf (accessed June 7, ) Application Note 9 赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 免费服务热线 : ( 支持手机用户 ) AN 9
g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min
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