The world leader in serving science 方法开发报告 2013-APP-RLC-012 高效液相色谱法测定奶粉中核酸的含量 赛默飞世尔科技色谱产品应用中心 检测项目 仪器型号 色谱柱 核糖核苷 单磷酸核苷酸 Dionex Ultimate 3000 系统 : 泵 :D
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- 仁 钱
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1 方法开发报告 2013-APP-RLC-012 高效液相色谱法测定奶粉中核酸的含量 赛默飞世尔科技色谱产品应用中心 检测项目 仪器型号 色谱柱 核糖核苷 单磷酸核苷酸 Dionex Ultimate 3000 系统 : 泵 :DGP-3600RS 自动进样器 :WPS-3000TRS 柱温箱 :TCC-3000RS 检测器 :DAD-3000RS 色谱软件 :Chromeleon Chromatography Data System Acclaim C30,2.1 mm 150 mm,3 µm(s/n001008, P/N075725) A:H 2 O; B:100mmol/L NH 4 OAC 溶液,pH=5.0; C: 乙腈 梯度条件 : 时间 / A B C 流动相 流速 0.4 ml/ 检测器条件 UV 260nm 分析时间 /15
2 一 背景介绍核苷酸是构成核酸的主要成份, 其广泛参与人体的能量代谢 蛋白质合成, 具有提高各种酶的活性 活化细胞功能 促进抗体形成, 增强免疫功能的作用 对人体来说有很好的保健作用, 可以促进神经细胞的生长发育, 与 神经生长因子 有关或者可以作为神经生长物质利用的营养成分 同时能够促进铁质吸收及影响脂质代谢, 改变肠道菌丛及提供肠道黏膜完整所需的营养, 达到提升免疫功能的效果 一些临床研究发现, 添加核苷酸的婴儿配方奶粉, 可以减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育 而牛奶中一般不含有核苷酸, 且目前的婴幼儿配方奶粉国家标准中未规定这项指标, 但是根据核苷酸对婴幼儿的特殊功效, 大部分的乳品企业都将其作为重要指标, 因此建立简单方便的检测乳制品中核苷酸的方法就迫在眉睫 目前报道的检测方法包括微生物法 紫外分光光度法 高效液相色谱法 离子色谱法等, 但是这些方法都是测定奶粉中核苷酸添加剂 ( 包括 和 ) 的方法, 本方法除了测定这五种常见核苷酸, 还测定了五种核苷, 方法简单方便, 易推广到应用到实际样品的测定中 二 对照品和样品前处理标准溶液配制 : 分别精密称量尿嘧啶核苷 (U) 鸟嘌呤核苷(G) 腺嘌呤核苷(A) 肌苷 (I) 胞嘧啶核苷(C) 单磷酸腺苷() 单磷酸鸟嘌呤核苷() 单磷酸次黄嘌呤核苷 () 单磷酸尿嘧啶核苷() 单磷酸胞嘧啶核苷() 固体粉末标准品 5.0 mg 分别溶解于 1 ml 去离子水中, 混匀, 分别得到 5.0 mg/ml 的十种标准溶液 ; 取十种标准溶液不同体积, 稀释混匀得到一系列浓度的标准溶液 ( mg/ml) 样品前处理 ; 方法 1 样品 1-4: 准确称取 5.0 g 左右的样品, 用 25 ml 温水溶解后放入超声波水浴中超
3 声震荡 10 取出, 量取 20 ml 转入 50ml 容量瓶中, 加入 1 ml 25% 的乙酸沉淀 蛋白, 再用超纯水定容到 50ml 后混匀, 离心取上清液, 过 0.22μm 滤膜, 直接 进样分析 ; 样品 5: 准确量取 2 ml 液体样品, 用 3 ml 温水稀释混匀后放入超声波水浴中超 声震荡 10 取出, 加入 0.4 ml 25% 的乙酸沉淀蛋白, 再加入 4.6ml 的去离子水 到 10 ml 混匀, 离心取上清液, 过 0.22μm 滤膜, 直接进样分析 ; 方法 2. 在方法 1 的条件下, 采用截留分子量为 10000MW 的超滤离心管离心, 直接上机分析 三 色谱图 1 色谱分离条件优化 (1) 温度 : (2) 有机溶剂 :
4 z (3) 梯度 : %B: 2 % 1Flow: ml/ 38.0 乙腈 :38% %B: 2 % 2Flow: ml/ 36.0 乙腈 :36% %B: 2 % 3Flow: ml/ 乙腈 :32% (4) 前处理方法比较 : 1 光明 -直接 2 光明 -超滤 核苷和核苷酸标准品色谱图 ( 浓度 0.5 ): 18.0 std
5 3 样品 1( 奶粉 1) 色谱图 : 7 dmz 样品 2( 奶粉 2) 色谱图 : gm 样品 3( 奶粉 3) 色谱图 : 4 yl
6 6 样品 4( 奶粉 4) 色谱图 : 6 QC 样品 5( 母乳 ) 色谱图 : 重复性 :
7 9 样品 1 及加标 : 核酸 #72 dmz UV_VIS_ 核酸 #73 dmz-直接 -sk UV_VIS_ 样品 5 及加标 : sk 四 测试结果表 1 温度对分离的影响 : 温度 R(/) R(C/) R(/) 表 2 前处理方法对分离的影响 ( 峰面积比较 ): 前处理方法 方法一 方法二
8 表 3 样品 1-3 中核苷和核苷酸的含量 : 样品 1 样品 2 样品 3 实际值 (mg/100g) 实际值 (mg/100g) 实际值 (mg/100g) 计算方法 : 实际值 (mg/100g) = 5L/(5g (20ml/25ml)) 100 表 4 样品 4-5 中核苷和核苷酸的含量 : 样品 4 样品 5 实际值 (mg/100g) 实际值 计算方法 : 实际值 (mg/100g) = 5L/(5g (20ml/25ml)) 100 表 5 样品 1 和 5 加标结果 : 样品 1 样品 5 加标值 加标后测定 回收率 加标值 加标后测定 回收率 值 (%) 值 (%)
9 表 6 核苷和核苷酸重现性 线性关系及最低检出限 : RSD(Peak Area %) Calibration Range r 五 结果讨论对色谱分离条件进行优化, 比较了色谱柱温度 有机溶剂种类 梯度变化条件和前处理方法对核苷和核苷酸分离的影响 : 1 温度的变化对核苷和核苷酸分离的影响较大, 随着温度的降低, 核苷和核苷酸的保留时间均增加, 且核苷酸在色谱柱上保留更强, 比较了 15 和 20 的条件下分离情况, 由表 1 可知,C 和 在 15 时分离度大于 1.5, 而在 20 时三种物质之间的分离度在 1 左右, 或者小于 1, 如果继续降低温度, 分离度没有显著改善, 且系统压力较高, 因此认为 15 为分离核酸较合适的温度条件 ; 2 比较了有机试剂乙腈和甲醇对核苷和核苷酸分离的影响, 比较图 1-2 可知, 乙腈作为有机试剂能够显著提高核苷酸的理论塔板数和对称因子, 尤其是 和, 从而提高其分离度, 因此选择乙腈作为有机试剂 ; 3 图 1-3 比较了不同乙腈梯度 ( 最高乙腈含量分别为 32% 36% 和 38%) 对分离度和总体保留时间的影响, 结果表明不同乙腈的梯度影响不大, 考虑到绿色环保, 节约能源, 尽可能降低乙腈的使用, 因此选择 32% 乙腈含量已经满
10 足分析要求 ; 4 前处理过程中采用 25% 的乙酸沉淀蛋白后离心, 普通离心管离心和超滤离心管离心结果见图 1-4 和表 2, 结果基本类似, 但是超滤离心管能够截流大分子蛋白等物质, 可能更有利于延长色谱柱的使用寿命 十种核苷和核苷酸的线性关系好,RSD 线性范围和最低检出限见表 6 测定了实际样品中五种核苷 (A U C T 和 I) 和五种单磷酸核苷酸 ( TMP 和 ) 的含量, 结果见表 3 和 4,I 在实际样品的测定中含量较低, 有干扰, 其他几种物质干扰较小, 并对其中的两个样品进行加标回收率实验分析, 结果见表 5, 在 88%-103% 之间, 满足要求 附录 : External U V_VIS_1 Area [ *] 4.50 External U V_VIS_1 Area [ *] External UV_VIS_1 Area [*] External UV_VIS_1 Area [*]
11 3.50 External UV_VIS_1 Area [*] 7.00 External UV_VIS_1 Area [*] External UV_VIS_1 Area [ *] 5.50 External UV_VIS_1 Area [*] External UV_VIS_1 Area [ *] 6.00 External UV_VIS_1 Area [*] No. Ret.Time () Peak Name Cal. Type Offset (C0) Slope (C1) Range Corr. Coeff % LOff LOff LOff LOff LOff LOff LOff LOff LOff LOff
g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min
25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.
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